Summary
Bu serbest zaman uyumlu bir duyusal içinde özel olarak tasarlanmış bir akvaryum tank içinde hem doğru ve güvenilir bir hayvanın elektrik organı deşarj zamanlaması, vücut konumu ve duruşu ölçülerek, uzun bir süre boyunca zayıf elektrik balık yüzme spontan davranışını incelemek için teknikler bir dizi tanımlamak izolasyon odası.
Abstract
Uzun vadeli davranışsal izleme seyrek meydana gelen de dahil olmak üzere doğal hayvan davranışları yakalamak ve ölçmek olabilir. Bu tür keşif ve sosyal etkileşimler gibi davranışlar iyi pervasız, özgürce davranarak hayvanları gözlemleyerek ele alınabilir. Zayıf elektrik balığı (WEF) ekran elektrik organı akıntı (EOD) yayan tarafından kolayca gözlemlenebilir keşif ve sosyal davranışlar. Burada, biz eşzamanlı EOD, vücut pozisyonu, ve uzun bir süre için serbest yüzme WEF duruşu ölçmek için üç etkili teknikleri tarif. İlk olarak, bu tür ışık, ses ve titreşim gibi duyusal uyaranların dış kaynaklardan engellemek üzere tasarlanmış bir yalıtım bölmesinin içine deneysel tankın yapımını tarif eder. Akvaryum dört test örneklerini barındırmak için bölümlenmiş ve otomatik kapıları uzaktan merkezi arenada hayvanların erişimini kontrol edildi. İkincisi, biz özgürce WEF yüzme hassas ve güvenilir bir gerçek zamanlı PMİ zamanlama ölçüm yöntemini tarif. Hayvanın vücut hareketlerinden kaynaklanan sinyal bozulmaları mekansal ve zamansal ortalama alma işleme aşamaları tarafından düzeltilir. Üçüncü olarak, biz soğukkanlı gece hayvan davranışlarını gözlemlemek için bir sualtı yakın-kızılötesi görüntüleme kurulumu açıklanmaktadır. Kızılötesi ışık darbeleri uzun bir kayıt süresi boyunca, video ve fizyolojik sinyal arasındaki zamanlama senkronize etmek için kullanıldı. Bizim otomatik izleme yazılımı bir su sahnesinde güvenilir hayvanın vücut pozisyonu ve duruşu ölçer. Birlikte, bu teknikler serbestçe güvenilir ve kesin bir şekilde zayıf elektrik balık yüzme kendiliğinden davranışının uzun süreli gözlem sağlar. Biz yöntemi benzer keşif veya sosyal davranışları ile kendi fizyolojik sinyalleri ile diğer su hayvanları çalışmaya uygulanabilir inanıyorum.
Introduction
Arkaplan. Hayvan davranışları üzerine nicel deneyler (örneğin zorunlu tercih, şok kaçınma, T-labirent, vb.), Tipik olarak, duyusal-motor becerileri ile ilgili öğrenme ve bellek oluşumu spesifik hipotezleri araştırmak için kullanılmaktadır. Ancak, bu kısıtlayıcı deneyler doğal hayvan davranışlarının zenginliği çok özledim ve davranışın altında yatan nöral temeli basitleştirilmiş modelleri sonuçlanması muhtemeldir. Daha doğal koşullarda deneyler nedenle biz daha tam bir tür davranış repertuarı keşfetmek hangi önemli bir tamamlayıcıdır. Serbestçe hareket hayvanları ile ilgili deneyler, ancak bu tür hareketleri kaynaklı kayıt eserler gibi eşsiz teknik sorunları ele almalıdır. Uyarıyla tetiklenen tepkiler farklı olarak, kendiliğinden meydana gelen araştırıcı davranışı tahmin edilemez, bu nedenle deneysel konular sürekli olarak izlenir ve uzun bir süre boyunca izlenir gerekir. Özel araştırma soruları can en iyi özenle seçilmiş organizmalar ve mevcut teknik araçları tarafından ele. Örneğin, genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri 1 ve optogenetik 2 gibi optik kayıt ve stimülasyon teknikleri başarıyla serbestçe genetik model organizmalar 3-5 hareketli tatbik edilmiştir. Alternatif olarak, minyatür sinir telemetri sistemleri kaydedebilir ve küçük hayvanlara 6,7 hareket serbestçe uyarır.
Elektrikli balık. WEF türler onların yakın çevresini algılamak ya da daha büyük mesafeler üzerinden iletişim kurmasına izin elektrik organı deşarjları (EODs), üretir. EODs zamansal desenler tür öz-hareketler 8,9, duyusal uyaranlar 10,11 ve sosyal etkileşimlerinin 12,13 gibi farklı koşullar altında değişir. Sürekli yarı sinüs dalga şekilleri oluşturmak için dalga-tipi türlerin aksine darbe tipi WEF türler, ayrık bakliyat bir tren üretmek. Genel olarak, darbe tipi türler sergi morE değişken EOD oranı dalga tipi türlere göre ve hayvanların EOD oyu yakından onların duyusal çevresi 10,14 yenilik içeriğini yansıtmaktadır. Pulse-tipi türler hemen yeni bir duyusal tedirgemesi (yenilik yanıt 10,11,14) için cevap veren bir tek darbe döngüsü içindeki arası nabız aralığı (IPI) kısaltabilir. Bu balıkların devam eden elektrik davranış dış kaynaklardan kontrolsüz duyusal uyaranlar tarafından tedirgin olabilir ve bu tür titreşim, ses, elektrik, ve ışık gibi uyarıcıların farklı tetik yenilik yanıtları bilinmektedir. Bu nedenle, özel önlemler serbest yüzme WEF uzun süreli gözlem sırasında dış duyusal uyaranlara engellemek ya da azaltmak için alınmalıdır. Bu şekilde, EOD hızı ve hareket yörüngelerine değişimler özel deneyi tarafından sunulan uyaranlara atfedilebilir.
Akvaryum tankı ve izolasyon odası. Dolayısıyla titreşim emici malzemelerin çoklu katmanlar yerleştirilir under büyük bir akvaryum tankı (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), ve ışık, elektriksel gürültü, ses ve ısı akışı dış kaynakları engellemek için yalıtılmış bir muhafaza ile tankı çevrili. EOD oranı, çevredeki sıcaklığa 15,16 bağlıdır böylece su sıcaklığı sıkıca Güney Amerika WEF türler için tropikal bir aralık (25 ± 1 ° C) düzenlenmiştir. Biz esas olarak iki boyutlu (Şekil 1A) sınırlı DEF mekansal keşif davranışlarını gözlemlemek için geniş ve sığ (10 cm su derinliği) deposu inşa. Tank ayrı ayrı balık (Şekil 1B) evine merkezi mekansal davranışlarını gözlemlemek arena ve dört köşe bölmelere bölünmüştür. Her bölme bireyler arasındaki elektriksel iletişimi önlemek için su geçirmez inşa edilmiştir. Merkezi arenaya hayvanların erişim dört motorlu kapıları ile dışarıdan kontrol edildi. Kapıları bölmeler arasına yerleştirilmiş ve kilitli zaman su geçirmez oldularnaylon kanat tarafından fındık. WEF metallere karşı hassas tepki beri metalik parçalar sualtı kullanıldı.
EOD kaydı. EODs (Mormyridsleri içinde) tek aktivasyonu veya 17,18 (Gymnotiforms olarak) birden fazla dağınık elektrik organları tarafından basmakalıp bir şekilde üretilmiştir. Medüller kalp pili gibi sırayla ön beyin 19 aksonal projeksiyonlar alır diensefalik prepacemaker nükleus gibi yüksek beyin bölgelerinden direkt nöral girdiler aldığı beri EOD oranının zamansal modülasyon, üst düzey nöral faaliyetlerini ortaya çıkarabilir. Ancak, EOD zamanlama dikkatli bir ham dalga kayıt çıkarılan ve hayvanın hareketi kaynaklı çarpıtmalar tarafından önyargılı olmamak gerekir. Bir WEF tarafından üretilen elektrik alanı dipol olarak yaklasık olabilir, bu nedenle kayıt elektrotlar PMİ darbe genlikleri hayvan ve elektrotlar 8,20 arasındaki bağıl mesafeler ve yönelimleri bağlıdır. Hayvanın kendini movemEnt Bu şekilde, farklı hareketler elektrotlarda EOD genlikleri (Haziran et al. 8 Şekil 2B, bakınız) uçucu bir şekilde, zaman içinde değişir neden, hayvan ve elektrotlar arasındaki nispi geometri değiştirin. Elektrikli organların farklı bir dizi göreli katkıları kuyruk bükme tarafından tanıtıldı vücut uzunluğu ve yerel eğriliklerin boyunca konumlarını bağlıdır çünkü Ayrıca, kendi kendine hareketler de, kaydedilen PMİ dalga şeklini değiştirmek. EOD genlik ve şekil hareketi kaynaklı çarpıtmalar yanlış ve güvenilmez EOD zamanlama ölçümleri yol açabilir. Biz mekansal farklı yerlerde kaydedilen birden fazla PMİ dalga formları ortalamasını alarak bu sorunları üstesinden, ve tam bir serbest yüzme WEF gelen EOD zamanlamasını belirlemek için bir zarf çıkarma filtre ekleyerek. Ayrıca, tekniği de bir hayvan EOD değişikliği dayalı istirahat veya aktif hareket olmadığını göstermek EOD genliklerde ölçerzamanla genlikleri (Şekil 2E ve 2F bakınız). Biz ortak mod gürültüsünü azaltmak için kayıt elektrot çiftlerinden farklılaşarak güçlendirilmiş sinyalleri kaydedildi. EOD bakliyat düzensiz zaman aralıklarında üretilen bu yana, EOD olay zaman serisi değişken örnekleme oranı var. Tercih edilen bir analitik araç tarafından gerekirse EOD zaman serisi enterpolasyon ile sabit bir örnekleme oranına dönüştürülebilir.
Video kaydı. EOD kayıt bir hayvan brüt hareket aktivitesini izleyebilir karşın, video kaydı, bir hayvanın vücut pozisyonu ve duruş doğrudan ölçülmesini sağlar. Yakın kızılötesi (NIR) aydınlatma (λ = 800 ~ 900 nm) WEF karanlıkta en aktif ve gözleri NUR spektrum 23,24 duyarlı olmadığından serbestçe, balık 21,22 yüzme soğukkanlı görsel gözlem izin verir. Çoğu dijital görüntüleme sensörleri (örn. CMOS veya CCD) wavelengt NIR spektrum yakalayabilirfiltreyi 25 tıkayan bir kızılötesi (IR) çıkardıktan sonra 800-900 nm arasında saat aralığı. Bazı high-end tüketici sınıf kamerası mevcut profesyonel kalitede IR kameralar çok daha büyük maliyetleri bir görüntü kalitesi karşılaştırılabilir, ya da üstün üretebilir yüksek çözünürlüklü, geniş görüş açısı ve iyi düşük ışık hassasiyeti, sunuyoruz. Buna ek olarak, bazı tüketici sınıf kamerası hiçbir kalite kaybı ile video sıkıştırma tarafından genişletilmiş bir kayıt süresini izin kayıt yazılımı ile birlikte verilir. Çoğu profesyonel kalitede fotoğraf makineleri dijital sinyalleri ile video arasındaki zamanlamayı hizalanması için 26 saat senkronizasyonu TTL darbe çıkışları ya da tetik TTL darbe girişlerini sunuyoruz, ancak bu özellik tüketici sınıf kamerası genellikle yoktur. Ancak, video kayıt ve bir sinyal sayısallaştırıcınız arasındaki zamanlama doğru aynı anda kamera ve sinyal sayisallastirici LED periyodik olarak yanıp sönen IR çekimi ile uyumlu olabilir. Başlangıçtaki ve son IR darbe zamanlama kullanılabilecek birtersi sinyal dijitalleştirici zaman birimi için video kare numaraları dönüştürmek ve s iki kez Kalibrasyon işaretleri.
Aydınlatma ve arka plan. Su ile yakalama görüntü nedeniyle su yüzeyinde ışık yansımaları teknik açıdan zorlayıcı olabilir. Su yüzeyi sualtı bir su üstünde görsel bir sahne, ve karanlık görsel özelliklerini yansıtan bir ayna olarak hareket edebilir, bu nedenle su üstünde sahne görsel etkileşimi önlemek için özelliksiz hale getirilmelidir. Görüntü için tüm akvaryum içinde, bir kamera doğrudan su üstünde yerleştirilmesi gereken ve bu su yüzeyinde kendi yansımasını önlemek için küçük bir görüntüleme delik üzerine tavan arkasındaki gizli olmalıdır. Işık kaynakları yanlış tahmin edilmektedir Ayrıca, eğer su yüzeyi glares ve kuralsız aydınlatma üretebilir. Dolaylı aydınlatma, tavana doğru ışık kaynakları yönelterek tüm akvaryumun üzerinde düzgün bir parlaklık elde edebilirsiniz şekilde tavan ve çevredeki walls yansıtır ve su yüzeyine ulaşmadan önce ışınları yaygın olabilir. Kamera (örneğin 850 nm dalga boyu tepe) bir spektral tepki eşleşen bir IR aydınlatıcı seçin. Işık kaynaklarından elektrik gürültü LED ışıkları kullanarak ve Faraday kafesi dışında kendi DC güç kaynağı koyarak minimize edilebilir. Balık NIR dalga boylarında beyaz bir arka iyi tezat yana, tankın altında beyaz bir arka plan yerleştirin. Benzer şekilde, yalıtım bölmesinin iç yüzeyleri üzerinde mat beyaz renkli kullanımı düzgün ve parlak bir arka aydınlatma sağlar.
Video izleme. Bir video kaydettikten sonra, otomatik bir görüntü izleme algoritması zamanla hayvanın vücut pozisyonlarını ve duruşlar ölçebilirsiniz. Video izleme otomatik ya hazır kullanımlı yazılımı (Bakış açısı veya Ethovision), ya da kullanıcı-programlanabilir yazılım (OpenCV veya MATLAB görüntü işleme araç kutusu) tarafından yapılabilir. Görüntü izleme ilk adım olarak,Geçerli bir izleme alanı (maskeleme işlemi) dışındaki alanı hariç tutmak için bir geometrik şekil çizerek tanımlanmalıdır. Daha sonra, bir hayvanın resim hayvan içeren bir resimdeki bir arka plan görüntüsü çıkarılarak arka izole edilmesi gerekmektedir. Çıkarılmış görüntü sentroidinin ve yönlendirme eksen ikili morfolojik faaliyetlerinden hesaplanabilir şekilde bir yoğunluk eşik uygulayarak ikili bir biçimde dönüştürülür. Gymnotiforms 27-29 ve 30-32 Mormyridsleri olarak, electroreceptor yoğunluk kafa bölgesine yakın olarak yüksek olduğu, bu yüzden her an baş konumu, en yüksek duyusal keskinliği bir konumunu gösterir. Baş ve kuyruk yerleri otomatik görüntü döndürme ve sınırlayıcı kutu işlemleri uygulanarak tespit edilebilir. Baş ve kuyruk uçları elle ilk karede onları tanımlayan ve iki ardışık kareyi karşılaştırarak kendi yerleri takip ederek birbirinden ayırt edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu prosedür Ottawa Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi gereksinimlerini karşılar. Hiçbir çıkar çatışması ilan edilir. Ekipman ve aşağıda listelenen maddelerin marka ve modelleri için Malzeme ve Reaktitlerin Tablo bakınız. Özel yazılmış Spike2 ve MATLAB komut ve örnek veriler Ek Dosya verilmektedir.
1.. Akvaryum Tank ve İzolasyon Odası Kurulumu
- Anti-v ibration kat. Alttan üstüne (Şekil 1A) kauçuk pedleri, akustik Strafor, deniz kontrplak paneli ve poliüretan köpük pedleri istifleme bir anti-titreşim yüzeyi (2,1 mx 2,1 m) Construct. Akvaryum tankı kenarlarını destekleyecek kontrplak panel üzerinde dört ahşap saplamalar (5 cm x 10 cm) yerleştirin.
- Kat kaloriferi. (Şekil 1D altına bakınız) termal dereceli köpük dolgu üzerinde bir elektriksel ekranlı ısıtma elemanı yatıyordu. Bir metal ile ısıtma elemanı Kapaklic elektrik koruma için örgü.
- Mekansal tankı. Kalınlığında cam paneller, L-şekilli alüminyum çerçeve ve akvaryum dereceli silikon (Şekil 1A bakınız) temperli 1.3 cm kullanan geniş ve sığ bir akvaryum tankı (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) Construct. (Protokol: 3), yüksek görüntüleme kontrast sağlamak için beyaz arka plan büyük bir levha ile tankın alt kapak.
- (0.64 cm kalınlığında beyaz mat) akrilik levhalardan yapılmış (22.5 cm boyunda) yükleyerek duvarlar tarafından merkezi bir alanda (1,5 m çap) ve dört köşe bölmeleri (Şekil 1B bakınız) içine akvaryum tankı bölün.
- Dört kavisli duvar bölümleri oluşturmak, ve dört köşe bölmelerinden merkezi arena ayırmak için silikon kalafat kullanarak tank tabanına ekleyebilirsiniz ısı uygulanarak bend dört akrilik levhalar (22.5 cm x 102.7 cm). Kapı montaj için kavisli bölümler arasında 20 cm boşluk bırakın.
- Dört çift duvar wi yükleyerek ayrı komşu köşe bölmeleriBöyle bir Hidrofondan gibi sualtı sensörler için fazladan elektrik izolasyon ve yerleri sağlamak inci 15 cm boşluklar.
- Dört motorlu kapı montaj ve köşe bölmeleri ve merkezi arena arasında bunları yükleyin.
- Şekil 1C gösterildiği gibi dört kapı çerçeveleri birleştirin. Her kapı çerçeve üzerinde altı kuyu (0.64 cm derinlik) oluşturmak, naylon palamut fındık (0.64 cm çap diş) gömmek ve epoksi ile sabitleyin.
- Ve akrilik kauçuk tabakalar dört kapı panelleri kesme ve kilitleme mekanizması için, akrilik ve kauçuk panellerde altı delik (0.64 cm çapında) oluşturur. Silikon doldurmayı kullanarak akrilik ve kauçuk paneller katılın.
- Install akrilik kapı çerçeveleri ile kapı panelleri katılmak için menteşeleri.
- Dağı servo motorlar üzerinde silah sallanan, ve (Şekil 1C bakın) kapı çerçevelerinin üstüne onları yükleyin. Kapı panelleri için sallanan kollarını bağlamak için kablo bağları ile döngüler olun.
- Ga üzerinde kapı montajları yerleştirinps kavisli duvar bölümleri arasında oluşturulan ve silikon doldurmayı kullanarak sabitleyin.
- Bir servo kontrol için tüm servo motorlar, ve aktif bir USB uzatma kablosu aracılığıyla bir güç kaynağına ve bilgisayara bağlayın. Servo kontrol ile sağlanan kontrol yazılımı kullanarak kapıları kontrol edin.
- Silikon sertleştikten sonra, naylon vidalar ile tüm kapıları kilitleme ve bir seferde bir bölme doldurarak su geçirmezlik için kontrol edin.
- İzolasyon odası. Akvaryum çevreleyen ve (Şekil 1D bakınız) ışık, ses ve elektriksel gürültü dış kaynaklarını engellemek için bir izolasyon haznesi oluşturun.
- Üç duvar panelleri (2 mx 2 mx 5 cm) ve dört kapı panelleri (1,9 mx 0,95 mx 5 cm) olun. Her panel için, bir dikdörtgen çerçeve oluşturmak için alüminyum pervaz (5 cm x 2,5 cm) katılmak ve alüminyum çerçeve üzerinde beyaz bir oluklu plastik paneli perçin. Akustik fiberglas paneller tabakaların ve siyah oluklu plastik panel ile yakın doldurun.
- Titreşim katta üç duvar panelleri kurmak ve yüklemek piyano duvar panelleri üzerinde dört kapı panelleri katılmak için menteşeleri.
- Alüminyum kafesleri ile izolasyon odasını çevreleyen ve zemin bir Faraday kafesi oluşturmak için her tarafta kafesleri.
- Nem kontrolü. Isıtma aşırı nem birikmesini kaldırmak için düşük gürültü egzoz fanı (Şekil 1F üst) yükleyin. En az 2 m uzakta kayıt sitesinden egzoz fanı yerleştirin ve izolasyon odası ve egzoz fan arasında bir hava kanalı yükleyin.
- Rutin olarak izlemek ve tank su ve hayvan koşullarını korumak.
- 10 cm derinliğinde, 100 us / cm iletkenlik ve su veya tuz stok solüsyonu (tarifi için Knudsen 33 bakınız) eklenerek pH 7.0 'de sabit su koşulları sağlamak. PH 6,5 'in altında düşerse ezilmiş mercan bir çanta ekleyin.
- Temizlik için sığ suda işletmek ve dikey olabilir akvaryum filtreleri takınhavalandırma amaçlı (Şekil 1F alt). Filtreleri ayırın ve kayıt oturumları sırasında merkezi arena dışına götürün.
- Elastik emme bardak takarak tankın altındaki canlı mealworms sunun. Kayıt sırasında kaçak avlayan kontrolsüz beslenmesini engellemek için böyle blackworms gibi serbest yüzen avlayan kaçının.
2. EOD Takibi
- Elektrotlar kurulum. Merkezi arena eğimli duvara sekiz grafit elektrotlar ve eşit boşluk bunları birleştirin.
- (15 cm uzunluğunda; Mars Karbon 2. mm tip HB) yol çizim elde etmek ve potansiyel dış kaplama traş.
- , Koaksiyel kablo (RG-174) sekiz 10 cm kesimleri kesmek grafit çubuklarının bir ucunda etrafında kablo özünü sarın ve uygulamak ısı shrink güçlü ve kararlı elektriksel bağlantısı için üzerlerine boru. Zıt uçlarında (Şekil 2A sol) BNC jack konnektörleri takın. </ Li>
- Taping tarafından duvara elektrotlar yerleştirin ve silikon korumak için elektrot yüzeylerinde maskeleme ince şerit bant uygulanır. Kalıcı elektrotları tutun ve silikon artıkları (Şekil 2A sağda) önce tüm bandı çıkarmak için silikon doldurmayı uygulayın.
- Amplifikatör ünitesine her elektrot arasındaki mesafeyi ölçme ve uzunluklarda koaksiyel kablolar (RG-54) keserek sekiz kablo montajları oluşturun. Kabloların iki ucunda BNC fiş konnektörleri takın.
- Amplifikatör ünitesine tüm elektrotlar tel kablo montajları kullanın. Diferansiyel Faraday kafesi onları bağlayarak tüm koaksiyel koruyucu teller (Şekil 2B) iki 90 ° odaklı elektrotlar eşleştirme tarafından yükseltmek ve zemin.
- Sinyal doygunluk sınırının altında amplifikatör kazancı ayarlayın ve gürültü çıkarmak için bir bant geçiren filtre (200 Hz-5 kHz) uygulanacaktır. 40 KS / sn hızında dört kayıt elektrot çiftleri sayısallaştır.
- Çevrimiçisinyal işleme. Talimatlar Spike2 yazılım için yazılır ve parametre ayarları Gymnotus sp için optimize edilmiştir. (Özet için bakınız Şekil 2C).
- Ekle DC tüm kayıt kanalları işlemi (τ = 0.1 sn) çıkarın.
- Tüm kayıtlar kanallarına bir rektifiye işlemi ekleyin.
- Dört kayıt kanalları toplanmasıyla sanal bir kanal oluşturun.
- Bir RMS ekleyerek PMİ darbe başına bir unimodal zarf Özü (root-mean-squared,
Açıkça darbe zamanlamasını belirlemek için PMİ çevrimi başına tek bir tepe oluşturmak için sanal kanala) süreci (τ = 0.25 msn). - Sanal kanalı bir Realmark kanalı oluşturmak ve tüm EOD bakliyat wi yakalamak için uygun bir eşik ayarladıktan sonra, zaman ve genlik zirve değerlerini kaydetmekyanlış pozitif kaçınarak thout, bir darbe eksik.
- Bir anlık frekans moduna Realmark kanal kanal görüntüleme seçeneği ayarlayarak gerçek zamanlı anlık EOD hızını izlemek.
- Realmark kanalı çoğaltarak gerçek zamanlı balık hareketi izlemek ve bir dalga moduna ekran seçeneğini ayarlayın.
- Realmark kanalı (0.01 sn örnekleme dönemi) bir sanal kanal oluşturarak EOD genlik eğimin RMS bir etkinlik düzeyini ölçmek ve eğim (τ = 0.25 msn) ve RMS (τ = 0.5 milisaniye) süreçleri ekleyin.
- MATLAB formatında Spike2 yazılım Realmark kanalı ihracat.
Açıkça darbe zamanlamasını belirlemek için PMİ çevrimi başına tek bir tepe oluşturmak için sanal kanala) süreci (τ = 0.25 msn). 3. Senkronize ve Video Takip
- Bir arka plan sahne oluşturun.
- Mat beyaz tezgah film ile kaplayarak su yüzeyinde bir yansıması atmalarını herhangi bir nesneyi gizlemek.
- Bir mat beyaz yükleyinKamerayı ve hava deliği gizlemek için 15 cm tavanın altında oluklu plastik paneli.
- Bir kamera kalibre için beyaz kağıt büyük bir kağıda yazdırma ızgara desenleri ve yüksek kontrastlı arka plan sağlamak için tankın altında yatıyordu.
- Işık kaynakları yükleyin.
- Elde IR LED ışıkları ve gürültüyü azaltmak için dahili fanlar kaldırın. Faraday kafesi dışına yerleştirilmiş bir akım ayarlı DC güç kaynağı ile LED sürün.
- IR karanlıkta görüntüleme için ışıklar ve test balık bir gündüz ışık döngüsü sürüş için beyaz LED LED ışıklar yükleyin. Dolaylı ve homojen aydınlatma (Şekil 3A) ulaşmak için tavana doğru doğrudan tüm ışık kaynakları.
- Beyaz sürerek gündüz ışık döngüsünü düzenleyen bir zamanlayıcı kontrol anahtarı (örneğin 12 saat on/12 saat kapalı) ile LED ışıklar.
- Doğrudan akvaryum üzerinde bir kamera takın.
- Bir NIR-duyarlı bir kamera alın, ya da bir kızılötesi engelleme filte kaldırmaklens takımının arkasında renkli cam ince tabaka kırarak r. Görüş açısı görüntünün tüm merkezi arena yeterince geniş olduğundan emin olun.
- Tavan panelinin ortasında küçük bir gözetleme deliği yapmak ve doğrudan deliğin üstünde kamera yerleştirin.
- Işık kaynakları glares oluşturmak eğer lens etrafında beyaz bir halka bekçi yükleyin.
- Bir zaman senkronize video kaydı yapmak.
- IR zaman senkronizasyonu bakliyat (1 msn süre, 10 saniye süre) oluşturmak için dört tankı köşelerinden birinde LED yerleştirin. Seri bir yük sınırlayıcı direnç (1 kW) ekleyin ve dijitalleştirici donanım dijital bir çıkış noktasına gelen IR LED sürücü.
- Kamera varsa ile birlikte video kayıt yazılımı kullanın. Yüksek kayıt kalitesini (örneğin kayıpsız sıkıştırma) ve desteklenen yüksek çözünürlükleri seçin.
- Hemen EOD kayda başlamadan önce video kaydını başlatmak ve video kayıt derhal durdurunkinveren'in EOD kayıttan sonra.
- Kayıttan sonra, doğrusal birinci ve sinyal sayısallaştırıcıya ve video kaydı ile yakalanan son ışık darbeleri arasındaki enterpolasyonlayarak dijitalleştirici zaman birimi için resim çerçeve numaraları dönüştürmek.
- Otomatik görüntü izleme
Talimatlar MATLAB görüntü işleme araç kutusu için yazılmış ve onun fonksiyonları kullanarak yapmak vardır. Özel bir MATLAB komut dosyası, otomatik görüntü izleme için bu sunulması ile sağlanır.- Video import. Doğrudan kullanarak MATLAB çalışma alanına bir video kayıt dosyasını içe "Videoreader. Okumak" fonksiyonu.
- İki resim karelerini birleştirerek bir kompozit arka plan görüntüsü oluşturun. Başka bir çerçeve aynı bölgesinin bir işgal edilmemiş bir görüntü (Şekil 3B) ile bir hayvan tarafından işgal edilen bir görüntü alanını değiştirin.
- A dışlamak için merkezi arena etrafında dairesel bir maske çizerek izlemek için bir görüntü bölgeyi belirleyinrea dışında (Şekil 3B alt) ve yoğunluk farkı için asgari eşik ayarlamak için bir sabiti (r int) ile çarpın. Arka altındaki - (r int 1) Örneğin, Rint ayar 0.85 yoğunluk oranlarındaki değişim% 15 = bastırır =.
- Görüntü çıkarma. (= IM 0) fark görüntünün (= ΔIM k) elde etmek için arka plan görüntüsü bir resim çerçevesi (= IM k) çıkarın. Negatif olmayan tamsayılar gibi görüntü yoğunluk değerlerini saklamak için işaretsiz tamsayı sayısal hassasiyet kullanın.
- Graythresh işlevi belirlenen bir yoğunluk eşiği uygulayarak Segment fark görüntü. Bwmorph işlevini kullanarak ikili görüntüyü temizleyin ve regionprops fonksiyonunu kullanarak tüm blob alanları hesaplandıktan sonra bir hayvana karşılık büyük blob seçin.
- Merkezini ve ana yönelim a belirleyinregionprops fonksiyonunu uygulayarak, ve x-ekseni ile ana eksene hizalamak için görüntüyü döndürmek tarafından büyük blob'un x,. Sentroidi (Şekil 3D üstte) baş ve kuyruk parçaları görüntü bölün.
- Baş kısmının ana ekseni belirlemek, ve x-ekseni (Şekil 3D sol altta) ile hizalamak için tüm görüntüyü döndürmek. Başının etrafında sınırlayıcı kutuları Fit ve kuyruk parçaları regionprops işlevini kullanarak kendi ana eksenlerinin paralel.
- Sol, orta ve sınırlayıcı kutuları (Şekil 3D alt yeşil noktalar) doğru dikey kenarlarında blob'un medyan y-koordinatlarını belirlemek ve beş özellik noktalarının (baş ucu, orta-kafa, orta vücut bunları atamak , orta kuyruk, kuyruk ucu).
- Önceki çerçevesi belirlenen hayvanın sentroidi merkezli bir görüntü çerçevesini kırpma sonra ardışık kare işleyin.
- Elle ilk karede için kafa yönünü atamak ve bir nokta-ürün betwe kullanınbirbirini takip eden iki çerçeve arasındaki yönlendirme vektörleri en otomatik olarak baş konumu belirlenmiştir. Sonucu incelemek ve yanlış atanan elle baş yönünü çevirmek.
- Baş-ipuçlarını katılarak bir hayvan yörünge çizmek ve medyan ve ortalama filtreleri kullanarak pürüzsüz (n = 3), bir gergin bir görünüme sahipse. Bir arka plan görüntüsü ile yörünge üst üste, ve beş özellik noktaları (Şekil 2E bakın) kullanarak balık midlines katmak.
- Anlık EOD oranını (100 Hz örnekleme hızı) yeniden örnekleme ve (0.0625 sn zaman penceresi) ortalama her görüntü yakalama anda ortalama EOD oranını hesaplayın. Zaman uyumlu PMİ oranından belirlenir sözde renklerde yörünge çizmek ve bir arka plan görüntüsü (Şekil 2F bakınız) ile üst üste.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EOD izleme sonuçları
Kendilerine özgü konum ve yönelimleri (Şekil 2C üst) beklendiği gibi farklı elektrot çiftleri kaydedilen EOD dalga genlik ve şekilleri değişmiştir. Birden fazla elektrot çiftlerinin kullanılması, tankın içindeki tüm olası pozisyonları ve DEF of yönelimleri de güçlü bir sinyal alımını sağlanmalıdır. Zarf dalga (Şekil 2C alt, yeşil iz) her zaman kesin (= IPI -1) arası nabız aralıkları ve anlık EOD oranının belirlenmesi için güvenilir bir zaman belirteci olarak görev PMİ çevrimi başına tek bir pik, içeriyordu. Ardışık EOD zirveleri katıldı ve doğrusal interpolasyon sabit zaman aralıklarında (Şekil 2D üst, siyah iz) de, ve anlık EOD oranı benzer sabit zaman aralıklarında (Şekil 2B alt, pembe iz) interpolasyon edilmiştir edildi. Sabit zaman örnekleme prosedürü zaman eşitleme olacak kolaylaştırırhareket yörüngesini ve EOD sinyalini arasını doldurmak ve sürekli örneklenmiş zaman serisi verileri için analitik araçların daha fazla sayıda kaldıraç sağlar. Bir hayvan dinlenme (Şekil 2E üst) iken dış elektrotlar kaydedilen PMİ genlikleri sabit kaldı, ancak hayvan nedeniyle dipol yerini ve yönünü (Şekil 2F üst) değişen hareket ederken zamanla değişmiştir. Böylece, balık hareketleri zamanla PMİ genliklerinin değişimi gözlemleyerek anlaşılmaktadır olabilir. Balık kalanı (Şekil 2E alt) iken bazal PMİ oranı düşük kalmıştır, ama balık aktif (Şekil 2F üst) yüzdü ise EOD oranı önemli ölçüde daha yüksek olmuştur. Dair gözlemimiz EOD oranı ve daha önce rapor 8,9,34,35 balık hareket arasındaki pozitif korelasyon ile tutarlıdır.
Video izleme sonuçları
Hayvanın yörüngesi ve midlines Şek ilk ve son fotoğraf çerçeveleri ile ure 3E bindirilmiş. Balık aniden iki saniye dönüm iken duruş değişim zamanı ders yakalandı ve balık midlines her 200 msn çizilmiştir. Balık orta hat doğru baş ucunda başlayan ve balık kuyruk ucunda sonlandırıldı. Yakından hayvan tarafından döküm gölgeler rağmen otomatik olarak izlenir midlines ile anlaştı balık görüntüler. Şekil 3F balığın kafasının zaman uyumlu yörünge ile bindirilmiş renkli zamanla değişen ortalama PMİ oranı (τ = 0.0625 sn), göstermektedir -ucu. Hayvan dönme fazının ortasında ise 2 saniye dönme süresi boyunca ortalama EOD oranı zirveye ulaşmış, ve fiyat dönüm sonuna doğru azalmıştır. Bu temsili bir sonuç bizim yöntemi başarıyla serbest yüzme sırasında kendinden güdümlü hareketler ve EOD hızı modülasyonu arasındaki ilişkiyi incelemek için uygulanabilir olduğunu göstermektedir.
t "fo: keep-together.within-page =" always ">
Şekil 1. Akvaryum tankı ve izolasyon odası kurulum. A) deneysel odası bir anti-titreşim kat, akvaryum tankı ve bir izolasyon odası. B) akvaryum tankı konut birey için deneyler ve dört köşe bölmeleri çalıştırmak için merkezi arena ayrıldı oluşur balık. Her bölme hayvanlar. C) motorlu kapı birden fazla perspektif açılardan gösterilen arasındaki elektriksel iletişimi önlemek için su geçirmez inşa edilmiştir. Lastik conta (açık kahverengi tabaka) sıkıştırmak altı kanat fındık tarafından kilitli kapı su geçirmez hale gelir. Bir kez kilidi, kapak uzaktan üstündeki servo motor tarafından çalıştırılabilir. D) yalıtım haznesi üç w katılarak toplandıiki taraftan akvaryum tankı erişim sağlayan tüm paneller ve dört kapı panelleri,. Alt panel, tank kenarları desteklemek için ahşap raylar, ve zemin ısıtıcı yerleştirilmesini göstermektedir. Alüminyum örgü tabakası) elektriksel gürültü. E korumak için ısıtıcı kapsayan izolasyon odasının duvarları ve kapı panelleri yapısal destek için alüminyum çerçeve inşa edildi (3). Odasının iç yüzeyleri (5) iç ışık kaynakları yansıtacak şekilde beyaz plastik paneller ile kaplıdır, ve dış (2) dış ışık kaynakları engellemek için siyah plastik paneller tarafından karşılanmaktadır. Bir alüminyum örgü (1) dış elektriksel gürültüyü engellemek için dış duvarlar kapsar. . Duvar akustik fiberglas plakalar (4) F), en iyi fotoğraf ısınmasından üretilen aşırı nemi gidermek için havalandırma kurulum gösterir ile doldurulur ve alt fotoğraf, difüzyon arasındaki su tankı havalandırma, temizlik için su filtrasyon kurulum gösterir deneyseloturumları. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. EOD kayıt kurulum ve temsilcisi sonuçları. A) Sol paneli, bir ince grafit elektrot, koaksiyel kablonun kısa bir segment ve bir BNC Jack oluşan elektrot düzeneğini göstermektedir. Sağ panel elektrot eki talimatları gösterir. Maskeleme bandı geçici elektrot takımı konumlandırmak için kullanılır, ve silikon doldurmayı kalıcı elektrot. B) kablo şeması tutmak için uygulandı. İki 90 ° odaklı elektrotlar farklı olarak yükseltilmiş ve filtrelenmiş, eşleştirilmiş. Dört kayıt kanalı Faraday c dışında dijitalize edildiEOD sinyal işleme adımları yaş. C) İllüstrasyon. Üst izleri rektifiye ve aşağıdaki gri iz üretmek için toplanır dört elektrot çifti, ham dalga şekillerini göstermektedir. Unimodal zarflar "Root-Mean-Meydanı" (RMS) filtre (yeşil iz) kullanarak gri dalga ayıklanır. EOD genlikleri ve IPIS zarf zirveleri. D) Zamanla değişen PMİ genlikleri (üst) ve anlık EOD oranı (alt) C daha uzun bir zaman ölçeği üzerinde gösterilir) belirlenir. EOD genlikleri ve anlık hızı (= IPI -1) D olarak E) aynı. Zarf zirveleri (siyah izleri) katılarak, düzenli zaman aralıklarında interpolated) ama balık rest. F iken) daha uzun bir zaman ölçeğinde çizilir balık aktif yüzme iken) E ile aynı. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Video izleme kurulumu ve temsilcisi sonuçları. A) ışık ve kamera kurulum gösterilmektedir. Kızılötesi (IR) ve görünür ışık kaynakları tavan yüzeyi yansıtır ve tüm tankı boyunca homojen bir aydınlatma çıkıntı için ışık yayılır, öyle ki duvarlarda bağlı ve tavana doğru işaret edilir. Kamera su yüzeyinde yansıma önlemek için tavan panelinin üstünde gizlidir. Bir IR LED zaman senkronizasyonu darbeleri üretmek için dört depo köşelerinden birinde konumlandırılır. B) bileşik bir arka plan görüntüsünü oluşturma görüntülenmiştir. İki görüntü kareleri (üstte görüntüler) hayvan içeren bölgesi yerine (yani tarafından kompozit arka plan görüntüsü (sol alt) oluşturmak için kombine edilirhayvan olmadan bölge ile kapak kırmızı kare) () kırmızı kare kesik. Merkezi arena alanı dışında balık anahat yalıtma siyah (sağ alt). C) dışarı maskelenir. Bir resim çerçevesi (sol üst) (sağ üst) (sol alt) fark görüntü üretmek için arka plan görüntüsü çıkarılır, ve) bir yoğunluk eşik. D uygulayarak ikili görüntüde (sağ alt) dönüştürülür vücut pozisyonu ölçümleri ve duruş gösterilmektedir. Hayvan (blob) ikili görüntüsü x-ekseni (sağ üstte) ile ana eksene hizalamak döndürülmüş ve onun Centroid merkezli edildi. Blob baş (kırmızı) ve kuyruk (mavi) parçalar ayrıldı ve her bir parçası ayrı ayrı kendi sınırlayıcı kutunun belirlenmesi için döndürüldü. Blob hayvanın referans çerçevesi (sol altta) ve beş özellik noktalarının (head-end, orta-kafa, orta gövde, orta kuyruk, kuyruk ucu) yönlendirilmiştir sınırlayıcı kutusunun midpoints belirlenmiştir kenarlar. E) Time-lapse imBalık midlines yaşı her 200 msn çizilmiştir. Ilk ve son görüntü kareleri 2 sn dönüm süresi. F) ortalama EOD oranı sözde-renk temsil ve balık kafa yörünge ile bindirildiği sırasında bindirilmiş. Aynı görüntüler) E olarak kullanılır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim teknikleri önemi. Özetle, öncelikle büyük bir akvaryum tankı yapımı ve Dünya Ekonomik Forumu tarafından üretilen kendiliğinden keşif davranışlarını gözlemlemek için bir izolasyon odasını tarif. Sonra, EOD oranı ve çoklu elektrot çiftleri kullanarak gerçek zamanlı olarak kontrolsüz balık hareketi durumlarını kayıt ve izleme tekniği gösterdi. Son olarak, biz bir zaman senkronize bir şekilde su ile infrared video kayıt tekniği, ve vücut pozisyonu ve duruş ölçmek için görüntü izleme algoritması nitelendirdi. Deneysel bir hazırlık olarak, WEF aktif electrosensory örnekleme hızına eşittir kolaylıkla ölçülebilir EOD oranı göstererek aktif duyusal-güdümlü davranışları araştırmak için önemli bir avantaj sunuyor. Bu tekniklerin kombinasyonu kontrolsüz WEF kendiliğinden davranışların hassas ve güvenilir uzun vadeli gözlem 8 etkinleştirebilirsiniz. Ayrıca, kurulum çoğunluğu fr inşa edilebilirom yapı malzemeleri ve kolayca elde edilebilen elektronik parçalar yaygın olarak kullanılabilir. Burada açıklanan teknikler geliştirilmiş ve son yıllarda deneysel gereksinimlerini karşılamak için test edilmiştir. Bu nedenle, serbest yüzme WEF kendiliğinden keşif davranışları gelecekteki çalışmalar için bu teknikleri önerilir.
İzolasyon odası. Izolasyon odası ışık, titreşim, ses ve etkinliğinin değişen derecelerde ile elektriksel gürültü dış kaynaklarını bloke ederek iyi kontrollü deneysel koşulları sağlar. Işığı bloke performansı karanlık izolasyon odasının içinde bir motorlu kamera yerleştirerek tarafından test edildi ve hiçbir harici ışık sızıntısı uzaktan pan kumandayı kullanarak tüm yerleri taradıktan sonra kameradan gözlendi. Dış zeminden kanalize titreşim ve birden çok kauçuk ve köpük tabakalarının istifleme karşı tank sağlanan zayıflatma altına yerleştirilmiş titreşimi azaltan yüzey en bloke edilmesi için etkili olduğuHarici titreşim olaylar. Ancak, bu tür yakın yerlerde yüksek sesle kapı kapatma gibi aralıklı titreşim olaylar nadir durumlarda yenilik tepkileri tetiklemek yaptım. Bir anti-titreşim hava tablo arka plan titreşimlerden üstün yalıtım performansı rağmen, bizim akvaryum tankı için yeterli bir hava masa büyük satın almak için pahalı olacaktır. Bu nedenle, büyük dış titreşimleri yenilik tepkileri tetikleyen olayları algılamak ve dışlamak için bir Hidrofon sualtı yerleştirilir. Ayrıca laboratuar dışında gürültü etkisini en aza indirmek için, bizim deneyler (18:00 sonrası) off-pik saatlerde yapılmıştır. Benzer şekilde, dış havadaki akustik gürültü fiberglas batts yalıtımı ile dolu izolasyon odasının duvarları yoluyla zayıflatılmış oldu. Biz objektif ses zayıflatma performansını ölçmek değil de, bir laboratuar ortamında arka plan sesi çoğu yenilik tepkileri tetiklemek yoktu. Dış tetikleyici nadir durumlarda, ani yüksek sesed bir yenilik yanıt; ancak böyle bir olay Hidrofon kaydı ile tespit ve nadiren off-peak saatlerde meydana geldi. Akvaryum tankı serbestçe yüzmeye ve keşfetmek için bizim hayvanlar için yeterince geniş bir alan sağladı. Tank boyutu biz (30 cm) kullanılan türlerin uzunluğu ile orantılı olarak seçildi, ama daha küçük hayvanlar kullanılmış olsaydı tank boyutu küçültülmüş olabilir. Biz Gymnotus sp seçtik. Serbest yüzme 36 sırasında elektrofizyolojik kayıtları kolaylaştırmak için onların büyük kafatası boyutu için farklı darbe-tipi türler arasında. Elektrik kayıt kalitesi daha pahalı bakır kafesleri kullanarak ve nem kontrolü için kullanılan egzoz fan koruyucu gelen artırabilir.
EOD ölçüm tekniği. Bizim çok-kanallı PMİ kayıt tekniği serbestçe balık yüzme doğru ve güvenilir EOD zamanlama ölçüm izin verdi. Bizim teknik kullanarak, özgürce WEF yüzme tarafından oluşturulan tüm PMİ bakliyat bir günah eksik veya eklemeden tespit edildialtı saatlik uzun kayıt süresi için gle darbe (ark. 8 Haziran içinde bkz. Şekil 12). EOD kayıt tedbirler EOD oran, aynı zamanda dış elektrotlar kaydedildi PMİ zirve amplitüdlerin değişen zaman aktivite düzeyi değil sadece. Kaydedilen EOD amplitüdleri bir hayvan ve kayıt elektrotları arasındaki nispi geometri ile belirlenir, böylece hayvan hareketleri EOD genlikleri (Şekil 2F) değişikliklere neden olur. Aktivite düzeyi hareketli pencere içinde EOD genlik eğimin değişkenliği (RMS) (0,5 saniye) göre hesaplandı. Bu yöntemi kullanarak, video kayıt uzun bir süre boyunca aktivite düzeyini ölçmek için gerekli olmaz ve tek başına EOD kayıt kâfi olabilir. Bunun yerine bir video kaydını kullanarak, WEF bir vücut pozisyonu ve duruş elektrotlar yerlerde dayalı yalnız EOD kayıttan anlaşılacağı, bir tank geometrisi, ve bir akım dipol teorik bir model. Benzer bir recordi kullanılmasıng kurulumu, Haziran ve ark. 20. bilinen akım dipol yerlerde tahmin sinyal yoğunlukları içeren arama tablosu girdileri ile birden fazla kayıt elektrot çiftleri de ölçülen sinyal yoğunlukları karşılaştırır bir nesnenin varlığında birden WEF izleme için gerçek-zamanlı elektrik izleme yöntemini önerdi. Elektrik izleme yöntemi hayvanlar genellikle görünümünden veya izleme birden hayvanların sırasında tıkalı olsun bir görsel darmadağın ortamda geliştirilmiş izleme güvenilirlik sunuyor. WEF natüralist habitatları elektrik izleme yöntemi takibi görsel daha basit kurulum gereksinimleri ile daha güvenilir izlemeyi sağlayabilir gibi su bitkileri ve kökleri gibi birçok görsel engelleri içerir. Prensip olarak, bizim yöntem filtre zaman sabitleri değiştirdikten sonra dalga-tipi WEF türlerin doğrudan uygulanabilir. EOD dalga dalga tipi türlerin yaklaşık sinüzoidal olduğundan düzeltme adım, PMİ döngüsü başına iki modu tanıtacak. Bu durumda,, Anlık EOD oranı negatif EOD faz görmezden her PMİ zaman belirteçleri atlama ile tespit edilebilir. Onlar yakın yüzmek zaman WEF kayıt elektrotları algılayabilir; böylece biz uzakta 37 algılanabilir büyük ya da metalik elektrotlar kullanılarak kaçınılması ve bunun yerine ince grafit elektrotlar (2 mm çapında) kullanılır. Tiner koaksiyel kablolar (RG-174) esneklik için elektrot meclisleri ile kullanılan, ancak daha kalın koaksiyel kablolar (RG-54) üstün elektriksel koruma için uzun mesafelerde kablolama için kullanılmıştır. Daha uzun kayıt süresi EOD örnekleme oranını düşürerek elde, ama bir ticaret-off gibi düşük bir zamansal çözünürlükte olabilir. EOD oranının ortalaması ve değişkenliği, türleri arasında değişiklik gösterir, böylece anlık EOD hızını düzeltme için zaman penceresi uygun şekilde ayarlanması gerekmektedir. Daha kısa bir zaman aralığı daha kısa ve daha küçük ortalama değişkenliği IPIS (örneğin Gymnotiforms) ve daha uzun bir zaman windo olan türler için önerilirw IPIS (örneğin Mormyridsleri) daha uzun ve daha yüksek ortalama çeşitliliğine sahip türler için tavsiye edilir.
Aydınlatma ve kamera kurulum. Video kayıtları nicel ve nitel davranış gözlemlerini sağlamak, ve biz burada, kurma, kayıt ve görüntü verilerinin işlenmesi için prosedürleri tarif. Aydınlatma kurulum yüksek kaliteli görüntüler üreten önemli bir rol oynar, ve ışık projeksiyon açısı sualtı hayvanları görüntüleme için önemli bir faktördür. Optimal aydınlatma koşullarında, su yüzeyi hayvanlar yüzey dalgaları üretmek özellikle görüntü izleme ile müdahale glares ve yansımaları oluşturabilir. Parlama ve yansıma sorunları bir tankın dibinden ışık kaynakları yansıtarak elimine edilebilir. Küçük bir tank için, LED dizileri tankın altına doğrudan yerleştirilebilir ve homojen ışık yoğunluğunu 38 üretmek için bir difüzör paneli üzerinden parlıyor. Benzer şekilde daha büyük bir tank için, bir ışık kaynağı cbir tankın altına yerleştirilebilir, ve homojen bir ışık yoğunluğu 39 difüze ışık için yeterli bir mesafe sağlayarak elde edilebilir. Bizim kurulum, biz alan kısıtlamalarından dolayı, yapısal kararlılık ve tankın altında ısıtıcı yerleştirme tankı üzerinde gelen ışığı yansıtmak zorunda kaldılar. Biz ışık kaynakları tavana doğru tahmin edildi, öyle ki, endirekt aydınlatma kullanarak parlama ve yansıma problemleri önlenebilir. Odasının özelliksiz ve mat beyaz üst kısmını render olarak, hiçbir yansımalar su yüzeyinde görünür. Görüntü için tüm merkezi arena, bir geniş açı objektif kameraya monte edilebilir, ancak bazı lensler (balık gözü lens) önemli varil bozulmaya neden olabilir. Distorsiyon tankı merkezinde izlendi ızgara yerleri piksel koordinatlarını ölçmek için tankın altında bir kalibrasyon ızgara sayfasını kullanarak düzeltilebilir. Birlikte santimetre karşılık gelen ızgara yerleri ile, bir dönüşüm matrisi co hesaplanabilirNamlu distorsiyon 40 rrect. Bir hayvan boyutu tank boyutu daha küçüktür, yani piksel yeterli sayıda doğru şekilde vücut duruşu ölçmek için hayvandan elde edilebilir eğer yüksek çözünürlüklü kameralar öneririz.
Görüntü izleme ve zaman senkronizasyonu. Burada anlatılan görüntü izleme algoritması hızlı bir vücut pozisyonu ve duruş ölçmek için bölge-faiz (ROI) işlem kullanır. ROI işlem işlenecek görüntü boyutunu azaltır ve önceki kareden hayvan yere yakın izleme aralığını kısıtlar. Biz bunun yerine bazen iyi tanımlanmış bir tek orta hat üretmek için başarısız olağan görüntü Skeletonizasyon operasyonun görüntü döndürme ve sınırlayıcı kutunun işlemlerini kullanarak vücut duruşu (orta hat) ayıklanır. Referans hayvanın çerçevesi benmerkezci davranış analizi izin kafa sınırlayıcı kutusunun ortasında yer oldu. Görüntü tracki içinde hata ana kaynağıng, geniş bir açıyla optik yansıtma etkisi nedeniyle olmuştur. İdeal olarak, hayvanın dikey hareketler 2B konum ölçümü etkilememesi gerektiğini, fakat daha uzağa merkezi görüntüleme ekseninden, dikey boyutunun büyük kısmı kameraya tahmin edilmektedir. Ve en kötü pozisyon hatası genelgenin ± 1.4 cm; su yüzeyinde kırılma (kamera yüksekliği = 1.8 m, su derinliği = 10 cm, tank yarıçapı = 75 cm) bizim görüntüleme kurulumunda% 28, optik projeksiyon etkisi azaltılmış çit. EOD ve video kayıtları arasındaki zamanlama video ve sinyal dijitalleştirici saatleri ve farklı kayıt başlatma süreleri arasındaki zaman sürüklenme için hesap kızılötesi LED darbeleri kullanarak senkronize edildi. Video ve EOD kayıtlar arasında zaman senkronizasyonu beklenen belirsizlik kare yakalama aralığı orantılıdır; örneğin, saniyede 15 kare (fps) kare yakalama hızı ± 33 msn zaman hizalama belirsizlik neden olur. Tim bu dereceE hassas yavaş hareket eden balıkları izlemek için yeterli olduğunu, ancak yüksek hızlı kamera hayvanları hareketli hızlı takibi için gerekli olabilir. Sensör pozlama süresi kare hızı ile ters orantılıdır çünkü biz, artan kare hızı ile parlak ışık yoğunluğunu öneririz.
Gelecekteki çalışmalar. Birden WEF arasındaki sosyal etkileşimlerin kendi EOD sinyallerini ve vücut yerleri takip ederek ele alınabilir ve izleme sistemi doğru aynı bireyin konumu ile EOD ilişkilendirmek gerekir. Haziran ve diğ. 20 Bir kullanarak benzer bir kurulum tarif dipol yerelleştirme yöntemine göre, kendi EOD sinyallerinin olayla hayvan yerleri birden fazla elektrot aldığımız, doğru, farklı bireylerden EOD darbeleri belirlenmesi için görsel izleme çıkış eşleştirilmiş olabilir. Birden fazla hayvan görüntü izleme ROI işlemini kullanarak bir kerede tek bir kişi yapılabilir. Bir ilk ROI için bireysel etrafında tanımlanabilirizlenebilir ve ROI güncelleştirilmiş bir vücut pozisyonu her karede yeniden konumlandırılmış olacaktır. Dışında ROI göründüğünde diğer balık görüntü izleme analiz dışında olacak ve içinde çıktı ise, diğer balıkların görüntü otomatik olarak görüntü ROI sınır dokunursa olmadığını kontrol ederek kaldırılabilir. Bazen, iki hayvan birbirine temas ve onların görüntüleri birleştirme ve eğer öyleyse, bir maske elle diğer balığın imajını ayrı çizilebilir. Bir başka ilginç gelecekteki iş av yakalama 22 ya da sosyal etkileşimler sırasında karmaşık hareket dizileri ortaya çıkarmak için üç-boyutlu bir video izleme olduğunu. MacIver et al. 22, bir üç boyutlu gövde modeli yeniden inşa için üst ve yan dikdörtgen akvaryum tankı görüntülemek için iki kamera kullanılır. Ancak, bu yaklaşım yan manzarası ve akvaryum derinliği çok daha fazla genişliğe sahiptir engellemek bölümleme duvarlar olmadığından, bizim durumumuzda işe yaramaz. Bunun yerine, bu başvurunun devamı olacakfarklı bir perspektiften de tavana birden fazla kamera yüklemek için kablo Hedrick 41 tarafından kullanılan kurulum benzer açıları. Daha fazla doğruluk için, su ve eğik kamera açısı getirdiği kırılma etkisi üç boyutlu görüntüleri kalibre tarafından düzeltilmesi gerekir. Bizim görsel izleme yöntemi balık yakındaki bir nesneyi yüzer zaman balığın vücut yüzeyinde 42,43 üzerinde elektrik görüntü akışını incelemek için uygulanan olabilir. Hofmann ve ark. 26 tarafından incelenmiş olarak, nesne mesafesi, şekil, boyut ve malzemeye bağlı olarak serbest yüzme sırasında nesnenin elektrik görüntü akışını incelemek ilginç olurdu. Balık nesne keşif veya sosyal etkileşimlerde yürütmektedir ederken Sonuçta, serbestçe balık 44-46 yüzme sinir kayıtları ile birlikte bizim yöntemleri nöral aktivite değişiklikleri ve EOD oranı gözlemleri ile yeni bakış açıları ortaya çıkarabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma cömertçe Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri (CIHR) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Construction | |||
| Electrically shielded floor heater | ThermoSoft Corp., IL, USA | ThermoTile | www.thermosoft.com |
| Tempered glass panel | generic | 0.5 in thick, used for the aquarium construction | |
| Aquarium grade silicone | generic | ||
| Acrylic sheet | generic | 0.25 in thick, matte white | |
| Natural rubber sheet | generic | 0.25 in thick | |
| Servomotor | HTECHRCD Inc., Korea | HS-325HB, 180deg rotation | www.servocity.com |
| Servomotor arm mount | HITECHRCD Inc., Korea | 56362 Large Spline | www.servocity.com |
| Servomotor controller (6 channels) | Sparkfun | ROB-09664 | Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller |
| Active USB extension cable | C2G | 38990 | 12 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable |
| Exhaust fan | Nutone | ILFK120 | www.homedepot.com |
| Vertical aquarium filter | Tetra, Germany | Whisper Internal Power Filter - 40i | |
| Crushed coral | Used to increase the pH of the tank water | ||
| EOD Recording Setup | |||
| Graphite Electrodes | Staedtler, Germany | Mars Carbon 2-mm type HB | Shave the outer coating |
| Physiological Amplifier/Filter | Intronix, Canada | 2015F | |
| Coaxial Cable | generic | RG174 | For electrodes assembly |
| Coaxial Cable | generic | RG54 | For wiring use |
| BNC jack connector for RG-174 | Amphenol Connex | 112160 | For electrodes assembly |
| BNC plug connector for RG-54 | Amphenol Connex | 112116 | For wiring use |
| Signal digitizer hardware | Cambridge Electronic Design, UK | Power MKII 1401 | |
| Signal digitizer software | Cambridge Electronic Design, UK | Spike 2. ver 7 | |
| Visual Tracking Setup | |||
| White LED light | IKEA, Sweden | DIODER 201.194.18 | www.ikea.com |
| Infrared LED light (850 nm) | Scene Electronics, China | S8100-60-B/C-IR | Remove built-in fan |
| USB webcam | Logitech Inc., CA, USA | C910 | Remove Infrared blocking filter |
| Motorized camera | Logitech Inc., CA, USA | Quickcam Orbit | Remove Infrared blocking filter |
| Video recording software | Logitech Inc., CA, USA | Logitech Quickcam Software | Download from www.logitech.com |
| MATLAB | Mathworks, MA, USA | 2012a | Image processing toolbox |
References
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
- Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
- Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
- Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
- Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
- Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
- Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
- Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
- Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
- Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
- Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
- Bennett, M. V. L. Fish physiology. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press. NY. 493-574 (1971).
- Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
- MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
- Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W. Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. Douglas, R., Djamgoz, M. , Chapman & Hall. London. 373-418 (1990).
- Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
- Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
- Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
- Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
- Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
- Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
- Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
- Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde,, Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
- Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
- Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
- Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
- Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
- Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
- Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
- Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
- Shapiro, L. G., Stockman, G. C. Computer vision. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 367-368 (2001).
- Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
- Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
- Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
- Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).
