Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ved å bruke Published: November 22, 2013 doi: 10.3791/50964
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Molecular Bacteriology and Infection, Imperial College London

Summary

Larven av voks møll Galleria mellonella ble nylig etablert som en in vivo modell for å studere Legionella pneumophila infeksjon. Her viser vi grunnleggende teknikker for å karakterisere patogenesen av Legionella i larvene, inkludert vaksinasjon, måling av bakteriell virulens og replikering samt ekstraksjon og analyse av infiserte hemocytes.

Abstract

Legionella pneumophila, er den utløsende agent for en alvorlig lungebetennelse som heter legionellose, en viktig menneskelig patogen som infiserer og replikerer i alveolære makrofager. Dens virulens avhenger Dot / Icm type IV sekresjon system (T4SS), som er nødvendig for å etablere en replikasjonsgivende vakuole kjent som Legionella innehold vakuole (LCV). L. pneumophila infeksjon kan modelleres i mus, men de fleste musestammer er ikke ettergivende, som fører til jakten på nye smittemodeller. Vi har nylig vist at larver av voks møll Galleria mellonella er egnet for undersøkelse av L. pneumophila infeksjon. G. mellonella brukes i økende grad som en smittemodell for menneske patogener og en god korrelasjon mellom virulens av flere bakteriearter i insekt og i pattedyr modeller. En viktig del av larver immunforsvar er hemocytes, yrkeal fagocytter, som tar opp og ødelegge inntrengerne. L. pneumophila er i stand til å infisere, danner en LCV og replikere i disse cellene. Her viser vi protokoller for å analysere L. pneumophila virulens i G. mellonella modell, inkludert hvordan å vokse smittsomme L. pneumophila, pretreat larvene med hemmere, infisere larver og hvordan du kan hente infiserte celler for kvantifisering og immunfluorescens mikroskopi. Vi beskriver også hvordan å kvantifisere bakteriell replikering og fitness i konkurransebestemmelser. Disse metodene gir mulighet for rask screening av mutanter å bestemme faktorer viktige i L. pneumophila virulens, som beskriver et nytt verktøy for å hjelpe til forståelsen av denne komplekse patogen.

Introduction

Dyremodeller av infeksjon har vist seg uvurderlig i fastsettelse av bakterielle virulensfaktorer. Men, har virvelløse modeller fått økt oppmerksomhet som et levedyktig alternativ til tradisjonelle pattedyr modeller av infeksjon. Larvene av voks møll, er Galleria mellonella i økende grad benyttet for å studere en rekke viktige humane patogener, inkludert gram-positive 1 og Gram-negative bakterier 2,3 og flere patogene sopper 4,5. Ved hjelp av et insekt-modellen har en rekke fordeler i forhold til tradisjonelle pattedyrmodeller, som et invertebrate, G. mellonella er ikke underlagt de etiske begrensninger av pattedyr modeller. I tillegg kan larvene lett opprettholdes, infisert ved injeksjon uten bedøvelse, gjennomgå forbehandling med kjemiske inhibitorer 6 og opprettholde inkubering ved 37 ° C 7. Interessant, en god korrelasjon mellom patogenitet av flere mikroorganismer i G. mellonella og pattedyr modeller av infeksjon er etablert 2,8. Den økte forståelsen av immunsystemet hos G. mellonella har også bistått i karakterisering av denne modellorganisme. Selv insekter ikke har en adaptiv immunsystem som funnet i pattedyr, har de sofistikerte cellulære og humeral forsvar, inkludert produksjonen av antimikrobielle peptider 9. Hemocytes er den viktigste mediator av cellulære forsvars og er den mest tallrike celletype som finnes i hemolymph (eller blod) i G. mellonella 10, Disse cellene er profesjonelle fagocytter og utføre lignende funksjoner til menneskelige makrofager og nøytrofile ved både å ta opp og nedverdigende bakterier i en PHAGO-lysosomal rommet 10,11 og danner knuter rundt invaderende bakterier, fysisk hindre bakterie replikering 12.

Legionella pneumophila er en luftveis patogen som forårsaker alvorlig pneumonien (legionærsykdom) hos utsatte befolkningsgrupper som eldre eller immunsupprimerte 13. er Legionella finnes overalt i både miljø-og menneskeskapte vannkilder, hvor det er en patogen av ulike arter av ferskvanns amøber 14,15. Legionella overlever og replikerer i disse profesjonelle fagocytter ved å anvende en multi-protein-komplekset kjent som Dot / Icm (defekt i organeller handelen / intracellulære multiplikasjon) type 4 sekresjon system (T4SS) for å translocate over 275 effektor proteiner i vertscellen 16-20. Disse proteinene bidrar til å undergrave den normale vertscellen fagocytiske trasé, som førte til etableringen av Legionella inneholder vakuole (LCV). Den LCV unngår fusjon med lysosomer og i stedet rekrutterer endoplasmatiske retikulum (ER)-avledet vesikler, som resulterer i en spesialisert avdeling som ligner på grov ER 21,22. L. pneumophila er ansett som et utilsiktet menneskelig baneogen; de samme strategiene som tillater det å gjenskape i amøber, også tillate replikering i menneskelige alveolære makrofager 23.

Pattedyr verter har blitt karakterisert som modeller for menneskelig legionellasmitte inkludert mus og marsvin 24,25. Men de fleste av musestammer er bestandige mot Legionella-infeksjon 26 med unntak av innavlet albino A / J mus, som utvikler en mild, selvbegrensende infeksjon 24.. Selv om marsvin-modellen mer ligner human sykdom 25, mangel på mutanter og økt kostnad fraråder bruken 27.. I tillegg har flere virvelløse modeller er utviklet for Legionella pneumophila infeksjon inkludert Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 og flere arter av amøber 30-32. Men disse modellene har svakheter, virulens i C. elegans 28, noe som begrenser nytten av denne modellen. Drosophila-modellen har vist seg effektiv i å undersøke bakterie virulens faktorer 29 og ser ut til å være lovende men denne modellen er ikke fullstendig karakterisert. Encellede amøber er miljø vertene av L. pneumophila og er ideelle for å undersøke virkningen av virulens faktorer på et molekylært nivå 33 men mangler flere viktige formidlere av pattedyr vertscellen respons på infeksjon som caspases 34. Svakhetene ved de eksisterende modellene, sammen med høye kostnader og etiske bekymringer relatert til pattedyr eksperimentering, har ført til søk etter andre egnede modellorganismer 29,35.

Vi har nylig vist at G. mellonella er en egnet modell for L. pneumophila patogenesen 36,37. Denne protokollen detaljer de eksperimentelle teknikker som brukes for smitteing G. mellonella larver, analysere larve moral, utpakking hemocytes for telling og immunfluorescens og bestemme replikering av levedyktig CFU teller fra infiserte larver.

Protocol

En. Utarbeidelse av L. pneumophila for infeksjon

  1. Forbered kullgjærekstrakt (CYE) plater (2 g / l aktivt kull, 10 g / L gjærekstrakt, 13 g / l agar, 10 g / l N-(2-acetamido)-2-aminothanesulfonic syre (ACES), 1 g / L α-ketoglutarat, 0,4 g / l L-cystein-HCl og 0,25 g / l treverdig pyrofosfat, pH 6,9).
    Merk: Hvis nødvendig, tilsett kanamycin (25 ug / ml) og / eller kloramfenikol (6 ug / ml) for å Cye platene.
    1. Gjennomføre alle L. pneumophila arbeid på biosikkerhet inneslutningsnivå 2 (BSL-2) i en mikrobiell sikkerhetskabinett (MSC) i samsvar med lokale regler.
  2. Streak L. pneumophila fra -80 ° C glyserol aksjer bort på CYE plater
  3. Inkuber platene i 4 dager ved 37 ° C.
    Merk: Inkubasjon av plater for 4 dager signifikant øker virulens av L. pneumophila i G. mellonella løpet av inkubasjon i 3 dager.
  4. En dag før infeksjon, resuspender en sløyfe full bakterier (som inneholder flere kolonier) i 1 ml forvarmet (37 ° C) ACES gjærekstrakt (AYE) buljong og måle absorbansen ved 600 nm (OD 600) ved hjelp av et spektrofotometer.
  5. Inokuler en frisk 3 ml AYE kultur (med antibiotika hvis nødvendig) til en slutt-OD 600 på 0,1.
    1. Inkluderer medie bare styre for å sikre steriliteten av media.
  6. Inkuber ved 37 ° C i en risteinkubator ved 200 rpm i 21 timer.
    Merk: Bakterier bør dyrkes til post-eksponentiell fase for smitte 38. Økende for 21 hr gjør eksperimenter for å bli standardisert.
    Merk: Ved behov for protein induksjon, tilsett 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) over natten.
  7. Måle OD 600 (bakterier bør være i post-eksponensielle vekstfase, OD 600 2,5-3).
  8. Fortynn bakteriekultur for å gi 1 x 10 9 CFU / ml i steril Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (D-PBS).
    Note: På grunnlag av tidligere resultater tilsvarer en OD 600 på 1 til 1 x 10 9 CFU / ml, men dette bør bekreftes for forskjellige L. pneumophila stammer.
    Merk: hvis induksjon av et protein fra et plasmid er nødvendig, tilsett 1 mM IPTG til inokulum.
  9. Plate inokulatet som beskrevet i seksjon 9 som en kontroll for å sikre at den forventede CFU er tilstede i inokulum.

2. Utarbeidelse av Larver

  1. Kjøpe tilstrekkelig G. mellonella larver fra en kommersiell leverandør. Larver sendes ved 5 eller 6. instar trinn (omtrent mellom 2-3 cm i lengde), og er egnet for bruk med en gang.
    Merk: En fremgangsmåte som beskriver hvordan man bakre larver er blitt beskrevet tidligere 39.
    Merk: Larver kan lagres ved romtemperatur i opp til to uker, og krever ikke mat. Umiddelbart forkaste ethvert larver viser tegn til forpupping.
  2. Forbered beholderen for larve av placing en sirkel med 10 cm filterpapir i bunnen av en 10 cm petriskål.
  3. Med butte tippet pinsett, plasserer ti sunne larver på ca samme størrelse inn i petriskål.
    Merk: Kast usunn brun farget eller flekkete ser insekter. Sunn larver er jevnt kremet farget med ingen områder av mørk misfarging og er i stand til å rette seg raskt hvis slått over.

Tre. Infeksjon av G. mellonella Larver

  1. Tilbered injeksjons plattformen ved taping en sirkel av filterpapir til overflaten.
  2. Sikkert tape en P1000 tips horisontalt til filterpapiret for å skape en vanninjeksjonsplattform. Dette trenger ikke å være sterilt.
  3. Steril en 20 mL mikrotiter sprøyten ved å aspirere 70% etanol og inkubering i minst 10 min.
    1. Bruk punktering bevis hansker når du sprøyter,
  4. Fjern eventuelle gjenværende etanol ved å aspirere og utstøter sterilt vann flere ganger.
  5. USIng sprøyten aspirer 10 mL av L. pneumophila 1 x 10 9 CFU / ml suspensjon.
  6. Ta en larve og forsiktig, men bestemt slå den på ryggen, bøyd over P1000 tips.
  7. Sett tuppen av sprøyten over fremre, høyre proleg av larvene.
  8. Forsiktig, sette spissen på nålen inn i proleg, noe som gjør at det er inni larvene, og jevnt injisere alt av sprøyten innholdet.
    Merk: Hvis sprøyten er satt riktig, bør det være mulig å plukke opp larvene bruker bare sprøyten å plassere den inn i kammeret.
    1. Etter injeksjon, observere larvene i noen sekunder. Larvene vil begynne å krype etter et par sekunder, men bør ikke skille ut væske.
  9. Kort observere larvene noen timer etter smitte, infeksjon med 10 7 CFU L. pneumophila 130b ikke forårsaker noen symptomer innen den første 5-8 timers pi Derfor hvis larver er å snu grå / svart før dette punktet, than eksperimentet skal seponeres.
    Merk: Inokulering av larvene med 1 mM IPTG ikke påvirker larvenes levedyktighet i løpet av eksperimentet.
  10. På samme måte, injiserer totalt 10 larver pr tilstand med 10 larver injisert med D-PBS for å tjene som en kontroll for å analysere larve-dødelighet.
  11. Tape petriskåler stengt og plasser i videregående containment.
  12. Inkuber i et standard bakterie inkubator ved 37 ° C, for varigheten av eksperimentet.

4. Forbehandling av Larver med en kjemisk hemmer

  1. Før infeksjon, forberede larver for injeksjon som beskrevet i pkt. 3.1 til 3.6.
  2. Injiser 10 ul av en 100 uM løsning av Cytochalasin D i den fremre, venstre proleg av 10 larver.
    Merk: Inhibitor blir injisert inn i en annen proleg fra bakteriell suspensjon for å redusere skade på larvene.
  3. Injiser 10 ul DMSO til 10 larver som en kontroll.
  4. Inkuber larver på37 ° C i 4 timer.
  5. Injisere forbehandlet larver som beskrevet i kapittel 3 i front, til høyre proleg med enten 1 x 10 7 CFU av WT L. pneumophila eller en PBS-kontroll.

5. Analyse av larve-dødelighet

  1. På 18 timer etter infeksjon (pi), undersøke alle infiserte larver for dødelighet.
  2. For å sjekke dødelighet, bruk sløv tippet pinsett til å snu larvene og ser for bevegelse av beina, bør sunn larver rette seg raskt. Pigmentering indikerer en sterk immunreaksjon mot infeksjon. Hvis det er noen bevegelse, teller som levende.
  3. Rekordmange døde og levende larver.
  4. Gjenta denne prosessen på alle andre tidspunkter valgt.
    Merk: Hvis inkubasjon er fortsatte i mer enn tre dager, kan puppe bli sett. Fjern eventuelle puppe og avlive ved frysing ved - 20 ° C før metamorfose kan forekomme.

6. Utvinning av hemolymph

  1. Tilfeldig velge trelarver og plasser i en 14 ml tube på utvalgte tidspunkter som 5 og 18 timers pi,
  2. Plasser dette rør på is i 5-10 min, inntil ingen bevegelse av bena på larvene kan observeres.
  3. Plasser bedøvet larver på en petriskål, og anvendelse av en skalpell, gjøre et snitt mellom to segmenter nær halen av larver.
  4. Klem larvene i en steril 1,5 ml sentrifugerør å samle hemolymph.
    1. Pool hemolymph fra minst tre personer. En larvene gir mellom 15 til 50 pl av hemolymph avhengig av størrelse.
      Merk: Under hemolymph utvinning er det veldig lett å forstyrre tarmen, noe som resulterer i potensiell forurensning av prøvene. Reduser kontaminering ved å kutte larvene nær halen (bort fra tarmen) vil imidlertid antibiotikum valg alltid være nødvendig når plette ut bakterier.
      Merk: For å unngå hemolymph fra snu brun og koagulerende, prosess hemolymph innen 10 min etter samlingen.
  5. Kast den larve legeme inn i et nytt 14 ml Falcon rør, pakning og sted ved - 20 ° C over natten for å sikre at larvene er døde.
  6. Autoklav døde larver og kast i henhold til lokale regler.

7. Fastsettelse av Hemocyte levedyktighet

  1. Ekstraher hemolymph som beskrevet ovenfor.
  2. Bland 20 ul av hemolymph ekstrahert med 20 ul av 0,02% (v / v) Trypan blue i PBS i én brønn av en 96 brønns plate.
  3. Inkuber i 5 min ved RT.
  4. Load 10 mL av hemolymph på en hemocytometer og telle levedyktige (ikke blå) celler.
  5. Telle hver prøve i tre eksemplarer for å redusere feil.

8. Behandling av utpakkede Hemocytes for Immunfluorescens Mikros

  1. Bland den sammenslåtte hemolymph hentet fra minst tre larver og pipette på en 10-15 mm glass dekkglass i en 24-brønns plate.
    Merk: Dekk ikke krever behandling som hemocytes kan forholde seg til glass.
  2. Tilsett 0,5 ml av D-PBS og bland godt med pipettering opp og ned.
  3. Sentrifuger plate i 10 min ved 500 x g ved romtemperatur (RT) under anvendelse av en aerosol-tett sentrifuge plateholderen.
  4. Undersøk hver brønn med en invertert mikroskop for å sjekke at de hemocytes har levd.
  5. Fjern supernatanten og nøye vaske cellene tre ganger ved tilsetning av 0,5 ml D-PBS til veggen i brønnen, vugging av plate 2-3x, og fjerning av D-PBS med en pipette.
  6. Løser cellene ved tilsetning av 0,5 ml av 4% (v / v) paraformaldehyd (PFA) i PBS.
  7. Inkuber cellene til mellom 20 til 30 min ved RT.
  8. Vask cellene tre ganger med D-PBS, som før.
  9. Tilsett 0,5 ml 15 mM NH4Cl i PBS for å slukke residual PFA og Inkuber ved RT i 15 min.
  10. Vask cellene tre ganger med D-PBS.
    Merk: På dette stadiet, kan Dekk lagres over natten ved 4 ° C.
  11. Tilsett 0,5 ml 0,1% Triton X-100 i PBS og inkuberes i 5 minutter ved RT for å permeabilize celler. Blokker i 1 time med blokkeringsløsning (2% (w / v) BSA i PBS).
  12. Inkuber i 1 time ved romtemperatur i mørke med det primære antistoff fortynnet i blokkeringsløsning ved den fortynning som er angitt av produsenten.
  13. Vask 3x med PBS.
  14. Inkuber i 1 time med det sekundære antistoff og DAPI for visualisering av bakterier som ovenfor.
  15. Vask 3x med PBS.
  16. Monter Dekk bruke en dråpe monterings reagens på glassplater.
  17. Inkuber over natten i mørke ved RT for å full tørke monteringsløsning.
  18. Bildet glir på en fluorescens mikroskop.

9. Kvantifisering av bakteriell CFU

  1. Legg 100 mikrogram / ​​ml spectinomycin å cye plater for å unngå forurensning av tarmfloraen. L. pneumophila belastning 130b er naturlig motstandsdyktig mot spectinomycin 40.
  2. Før hemolymph utvinning, veie 1,5 ml sentrifugerør.
  3. Pakk hemolymph som beskrevet i kapittel 6 og plasser i veies tUBE'er, tilsett 1 mL av 5 mg / ml digitonin, bland godt og inkuber i 5 min ved RT å lysere hemocytes.
  4. Reweigh røret med hemolymph og bestemme vekten av hemolymph ekstrahert.
  5. Utfør ti-ganger serie-fortynninger av hemolymph i sterilt AYE media.
  6. Ved hjelp av en penn, dele bunnen av en CYE plate inn i seks like sektorer og etiketten.
  7. Plate tre dråper av 25 ul av hver fortynning (som starter med den mest fortynnede) i hver del av platen.
  8. Inkuber platene med lokkene aller største over natten ved 37 ° C.
  9. Når dråpene er tørket fullstendig, snu platen over og inkuber ved 37 ° C i minst ytterligere to dager.
  10. Kvantifisere bakterie utvunnet ved å telle de kolonier på hver fortynning, og normaliseres til vekten av hemolymph ekstrahert.

10. Fastsettelse av konkurranse Index (CI)

  1. Bekreft at begge stammer vokser like godt i buljongkultur og på CYE agar plater PRIOr å forsøke konkurranseindeksen.
  2. Forbered WT eller kanamycin resistente mutant bakteriesuspensjoner som beskrevet i punkt 1 og bland i forholdet 1:1.
    1. Plate serielle fortynninger av inokulum på CYE spektinomycin (100 ug / ml) og spectinomycin CYE / kanamycin
  3. Infect larver og ekstrakt hemolymph ved egnede tidspunkter som er beskrevet ovenfor.
  4. Bestem levedyktige tellinger ved å trekke hemolymph og plating seriefortynning på CYE spectinomycin og CYE spectinomycin / kanamycin.
  5. Beregn konkurranseindeksen (CI) som følger: CI = (mutant utgang / WT utgang) / (mutant inokulat / WT inokulum).

Representative Results

Her er det vist at G. mellonella er en hensiktsmessig, enkel å bruke modell for å studere L. pneumophila infeksjon. Tidligere har det blitt vist at L. pneumophila virulens i makrofager, amøber og pattedyr modeller er avhengig av tilstedeværelsen av Dot / Icm sekresjon system 41-43. G. mellonella larver ble infisert som beskrevet ovenfor, og virulens av villtype (WT) og en Dot / Icm-manglende stamme sammenlignet. Infeksjon med 10 7 CFU av L. pneumophila stamme 130b resulterte i 100% mortalitet i løpet av 24 timer etter infeksjon (pi). Imidlertid L. pneumophila Δ DOTA belastning, noe som ikke har en funksjonell Dot / Icm T4SS sekresjon system, var avirulent i denne analysen (se figur 1). Dette viser at L. pneumophila virulens i G. mellonella avhenger av translokasjon av Dot / ICM effektorer, noe som gjør denne modellen egnet for karakterisering avfunksjonen til disse proteinene.

Nylig ble det vist at inhibering av fagocytose av cytokalasin behandling økte susceptibly av larvene til infeksjon av gjæren Candida albicans 6. Som L. pneumophila er en intracellulær patogen, ble det besluttet for å bestemme om opptak av bakteriene er avgjørende for dets patogenese i denne modellen. Larvene ble forbehandlet med 10 ul av 100 uM Cytochalasin D (CyD) i 4 timer ved 37 ° C og deretter infisert med 10 7 CFU for L. WT pneumophila 130b og dødelighet overvåkes 24 timer pi Behandling med hemmer alene ikke påvirker larve overlevelse. Imidlertid forbehandlet, infiserte larver viser betydelig større overlevelse (p = 0,0066, uparet t-test) sammenlignet med DMSO-behandlede, infiserte insekter (figur 2). Effekten av CyD behandling ble opphevet med 48 timers pi (resultater ikke vist), og dette kan skyldes at halveringstiden til medikamentet i G.mellonella. Dette viser at opptaket av L. pneumophila i G. mellonella hemocytes er en viktig del av bakteriell virulens.

For å bekrefte ekspresjon og bestemme den subcellulære lokalisering av en effektor protein i G. mellonella, hemocytes ble hentet ut og behandlet for immunfluorescens mikroskopi. Larver ble smittet med WT og Δ DotA L. pneumophila 130b uttrykker et fragment av veldefinerte T4SS effector, SidC 41-918, smeltet til 4 N-terminal HA koder. Denne effektor ble vist å binde LCV via en phosphoinositide-4-fosfat-bindingsdomene 44.. Ved hjelp av anti-HA (rød) og anti-Legionella (grønn) antistoffer, 4HA-SidC 41-918 lokalisert til LCV i infiserte hemocytes (figur 3). Denne lokalisering er tidligere vist i amøber Dictyostelium discoideum og i pattedyrmakrofager 44,45 bekrefter comparability av denne modellen.

Betydningen av proteiner for virulens er vanligvis bestemt ved å sammenligne de vekstkinetikken for villtype-og mutante bakterier. For å kunne følge de bakterielle replikasjonskinetikk i løpet av infeksjonen, ble tre larver avlivet ved hvert tidspunkt (0, 5, 18 og 24 timer pi), hemolymph oppsamlet og CFU/0.1g av ekstrahert hemolymph bestemmes. Etter en innledende fall i 5 timer pi, CFU av WT bakterier øker opp til 24 timer pi imidlertid gjennomgår Δ DOTA belastningen ingen replikasjon og tømmes ved 18 timer pi (figur 4).

Muligheten av L. pneumophila å forårsake lysis av makrofager i et T4SS avhengig måte har lenge vært dokumentert 46, men ingen tilsvarende undersøkelser er blitt utført in vivo. Konsentrasjonen av sirkulerende hemocytes ble bestemt ved 5, 18 og 24 timer pi Larver infisert med WT eller Δ (fig. 5). Men på 18 hr pi var det en betydelig nedgang i hemocyte konsentrasjon i WT, men ikke Δ DOTA, infiserte larver. Denne forskjellen vedvarte i 24 timer pi Fallet i hemocyte nummer, kombinert med tilstedeværelse av intracellulære bakterier som sett av immunfluorescens, tyder på at L. pneumophila gjentak innen hemocytes deretter lyserer dem, slik at bakterier å gjennomgå flere runder med replikering.

Figur 1
Figur 1. Infeksjon med L. pneumophila induserer Dot / Icm avhengige larvedødelighet. 10 larver ble smittet med PBS alene eller 10 DOTA L. pneumophila 130b, inkubert ved 37 ° C i 72 timer og tiden for død av larvene registrert. Alle larver infisert med WT bukket under for infeksjon innen 24 timer etter infeksjon (pi), men ingen dødelighet ble sett hos larver inokulert med PBS alene eller Δ DotA belastning. Resultatene er gjennomsnittet av tre separate eksperimenter, ± standardavvik.

Fig. 2
Figur 2. Dødelighet er avhengig av bakteriell intern. 10 L. pneumophila larver ble forbehandlet med 10 ul av 100 uM Cytochalasin D (CyD) i 4 timer ved 37 ° C og deretter infisert med 10 7 WT og dødelighet overvåket ved 24 timers pi forbehandlet larver viste signifikant (P = 0,0066, uparet t-test) reduseres dødelighet. Resultatene representerer mean av at fire uavhengige eksperimenter ± standardavvik med 10 larver per tilstand.

Figur 3
Figur 3. Immunfluorescens avbildning av effektor proteiner i utvunnet hemocytes. Hemocytes ble hentet fra larver infisert med L. pneumophila 130b WT eller Δ DotA uttrykke 4HA-SidC 41-918 på fem timers pi Cellene ble farget med anti-HA (rød) og anti-Legionella (grønn) antistoffer og DAPI DNA flekken (blått) for å visualisere kjerner. 4HA-SidC 41-918 ble observert rundt WT, men ikke Δ DotA, bakterier. Scale bar 5 mikrometer.

Figur 4
Figur 4. L. pneumophila gjentak innen G. mellonella i en Dot / Icm-avhengig måte. Larver infisert med WT eller Δ DOTA L. pneumophila og på 0, 5, 18 og 24 timer pi hemolymph fra tre infiserte insekter sammenslåtte, platet ut på CYE platene og CFU bestemt og normalisert til podestoffet, og til vekten av hemolymph ekstrahert. WT L. pneumophila replikert i løpet av forsøket, mens Δ DOTA belastningen ble fjernet innen 18 timer pi Resultatene er gjennomsnittet av tre separate forsøk ± standardavvik.

Figur 5
Figur 5. Infeksjon med WT L. pneumophila resulterer i betydelig hemocyte ødeleggelse. Hemocytes ble ekstrahert ved 5, 18 og 24 timer pi fra larver infisert med wt-eller Δ DOTA L. pneumophila og levedyktige celler telles ved bruk av et hemocytometer. Ingen forskjell iantall celler ble observert ved 5 timers pi mellom stammene men på 18 timer pi bare omtrent 15% av hemocytes forbli i larver infisert med WT belastningen i forhold til Δ DOTA belastning. Resultatene er gjennomsnittet av tre separate eksperimenter, ± standardavvik.

Discussion

The Galleria mellonella larve modell for Legionella pneumophila infeksjon er et nyttig verktøy for in vivo studier av patogenesen. Her er det vist at en rekke aspekter av makrofag infeksjon kan recapitulated i G. mellonella modell, inkludert rollen til Dot / Icm T4BSS i virulens og bakteriell replikering og lokalisering av Dot / Icm-effektor SidC. I tillegg, viser vi at en kjemisk inhibitor av aktin polymerisasjon reduserer larve-dødelighet, likne resultatene oppnådd i macophages 47 og støtte bevis på at internalisering av bakteriene er nødvendig for å forårsake larve-dødelighet. Tidligere har det blitt vist at variasjoner i virulens mellom L. pneumophila stammer sett i andre smittemodeller kan verifiseres i G. mellonella og at induksjon av virulensfaktorer i post-eksponensiell vekstfase er nødvendig for bakteriell virulens G. mellonella er en egnet modell for L. pneumophila infeksjon.

Bestemme CFU av L. pneumophila fra larver infisert enten enkeltvis eller i blandede infeksjoner i stor grad øker anvendeligheten av modellen. Tidligere har flere forhold blitt oppdaget at har subtile effekter på bakteriell replikering i en eller flere modeller av infeksjon 29,48-51. Selv om larvene ikke har en adaptiv immunsystemet, tilstedeværelsen av den medfødte immunrespons gir bedre utvalg sammenlignet med makrofager alene, som kan tjene til å forsterke små fenotyper. Derfor er det mulig at, mens disse stammene vil sannsynligvis ikke i vesentlig grad påvirker larvenes dødelighet, kan de vise redusert bakteriell replikasjon eller anvendelighet i G. mellonella modell. I tillegg til replikasjon av L. pneumophila i larver, har vi vist betydelig hemocyte uttømming sent i infeksjon. Som L.pneumophila er forventet å lysere vertsceller som ved slutten av dets replikasjonssyklus, måle hemocyte uttømming kan også fungere som en indirekte måling av bakteriell replikasjon. Hemocyte uttømming har tidligere vært korrelert med insekt dødelighet i smitte 3,52, selv om nyere resultater tyder på at dette bildet er mer komplekst enn først belived 37. Nylig har det blitt vist at utsulting av larver fører til økt mottakelighet for smitte gjennom en undertrykkelse av immunresponser 53. I assayene som beskrives her, ble larvene ikke matet for varigheten av studien og det er ikke kjent hvor godt matet larver ville svare til L. pneumophila infeksjon.

En av fordelene ved G. mellonella som modellorganisme er den enkle utvinning og kvantifisering av hemocytes fra infiserte larver. Tidligere videoer har vist ulike metoder for å trekke ut hemocytes fra insekter 54,55 imidlertid møtthod presentert her er enkel og egnet for umiddelbar behandling. Når ekstrahert kan hemocytes være lett kvantifiseres, som brukes for immunfluorescens, transmisjonselektronmikroskopi 36 eller strømningscytometri 56 eller kultivert og infisert ex vivo 3 slik at responsen av cellene til infeksjon som skal undersøkes i detalj. Dette øker fleksibiliteten i modellen. En påminnelse til Immunfluorescens i G. mellonella er begrenset tilførsel av antistoffer validert mot G. mellonella proteiner. Studier har imidlertid vist at opprettelsen av antistoffer mot larver proteiner 57 og antistoffer mot humane immunrelaterte proteiner ble funnet å gjenkjenne G. mellonella proteiner 11 som viser potensialet for immunfluorescens på G. mellonella hemocytes.

Den enkle G. mellonella infeksjon gir mulighet for raske, middels gjennomstrømning skjermer som kunnebrukes til å sammenligne virulens av forskjellige Legionella-arter og-stammer, og kan bli brukt for ytterligere å analysere tidligere identifiserte virulens faktorer som adhesjonsmolekyler 58 eller type 2 sekresjon system 59 som er påkrevet for virulens i andre modeller. I tillegg vil bruk av denne modellen tillater identifikasjon og videre karakterisering av nye virulensfaktorer herunder utskilles og translokaliseres effektor-proteiner. Nylig har det blitt vist at fosfolipase C aktivitet av L. pneumophila har en rolle i G. mellonella virulens 60 og at Dot / Icm effektor protein SdhA er nødvendig for virulens 37. I tillegg har vi nylig demonstrert at det er en sammenheng mellom de fenotyper som observeres i G. mellonella og i A / J mus belastning 37.

Dette understreker verdien av dette verktøyet for å komplettere miljø protozo og encellede vert og murine smittemodeller. The G. mellonella modellen vil bli enda mer verdifullt i fremtiden, når larve genomisk sekvens vil være tilgjengelig og flere genetiske verktøy er etablert. Skritt i denne retningen inkluderer fersk publikasjon detaljering immunrelaterte transcriptome 61 og dannelsen av et initiativ for å fremme genet stanse i Lepidoptera spp. 62.

Ved hjelp av G. mellonella larver, har vi en rekke enkle, raske avlesninger av bakteriell virulens som kan brukes til å undersøke patogenesen av L. pneumophila. Etablering av disse analysene og bredere screening av L. pneumophila stammer og serogrupper vil øke nytten av dette nye verktøyet, og vil bidra til vår forståelse av L. pneumophila patogenesen.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

CR Harding ble støttet av Wellcome Trust student WT086724.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/ Equipment
ACES yeast extract (AYE) broth 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution*
*add sterile ingredients after autoclaving
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) Sigma P6526 0.6 mM solution, sterile filtered
Sterile cysteine solution Sigma C7880 3.3 mM solution, sterile filtered
G. mellonella (waxworms) Livefood UK W250
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) Sigma H9037
Anti-Legionella LPS Cambridge Biosciences PA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488 Jackson Immunoreach 711-485-152
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma I6758
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) Sigma D8662
Paraformaldehyde Agar Scientific R1026
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma A9434
Trypan Blue solution Sigma T8154
Digitonin Sigma D141
Cytochalasin D Biomol International BML-T109-0001
Name Company Catalog Number Comments
Material
Microtiter Syringe Sigma 24544
Cell counter, double, Improved Neubauer VWR 631-0926
Centrifuge For centrifuging plates
Fluorescence microscope Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores
Inverted microscope For viable cell counting
Puncture-proof glove Turtleskin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olsen, R. J., Watkins, M. E., Cantu, C. C., Beres, S. B., Musser, J. M. Virulence of serotype M3 Group A Streptococcus strains in wax worms (Galleria mellonella larvae. Virulence. 2, 111-119 (2011).
  2. Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
  3. Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 310-317 (2010).
  4. Mowlds, P., Barron, A., Kavanagh, K. Physical stress primes the immune response of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Microbes Infect. 10, 628-634 (2008).
  5. Renwick, J., Daly, P., Reeves, E. P., Kavanagh, K. Susceptibility of larvae of Galleria mellonella to infection by Aspergillus fumigatus is dependent upon stage of conidial germination. Mycopathologia. 161, 377-384 (2006).
  6. Banville, N., Fallon, J., McLoughlin, K., Kavanagh, K. Disruption of haemocyte function by exposure to cytochalasin b or nocodazole increases the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Microbes Infect. 13, 1191-1198 (2012).
  7. Mowlds, P., Kavanagh, K. Effect of pre-incubation temperature on susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Mycopathologia. 165, 5-12 (2008).
  8. Joyce, S. A., Gahan, C. G. Molecular pathogenesis of Listeria monocytogenes in the alternative model host Galleria mellonella. Microbiology. 156, 3456-3468 (2010).
  9. Mak, P., Zdybicka-Barabas, A., Cytrynska, M. A different repertoire of Galleria mellonella antimicrobial peptides in larvae challenged with bacteria and fungi. Dev. Comp. Immunol. 34, 1129-1136 (2010).
  10. Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1295-1309 (2002).
  11. Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect. Immun. 73, 4161-4170 (2005).
  12. Ratcliffe, N. A., Gagen, S. J. Studies on the in vivo cellular reactions of insects: an ultrastructural analysis of nodule formation in Galleria mellonella. Tissue Cell. 9, 73-85 (1977).
  13. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  14. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  15. Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
  17. Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
  18. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  19. Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 (2011).
  20. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
  21. Horwitz, M. A. The Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) inhibits phagosome-lysosome fusion in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 2108-2126 (1983).
  22. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect. Immun. 63, 3609-3620 (1995).
  23. Segal, G., Shuman, H. A. Legionella pneumophila utilizes the same genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages. Infect. Immun. 67, 2117-2124 (1999).
  24. Brieland, J., et al. Replicative Legionella pneumophila lung infection in intratracheally inoculated A/J mice. A murine model of human Legionnaires' disease. Am. J. Pathol. 145, 1537-1546 (1994).
  25. Baskerville, A., Fitzgeorge, R. B., Broster, M., Hambleton, P., Dennis, P. J. Experimental transmission of legionnaires' disease by exposure to aerosols of Legionella pneumophila. Lancet. 2, 1389-1390 (1981).
  26. Wright, E. K., et al. Naip5 affects host susceptibility to the intracellular pathogen Legionella pneumophila. Curr. Biol. 13, 27-36 (2003).
  27. Padilla-Carlin, D. J., McMurray, D. N., Hickey, A. J. The guinea pig as a model of infectious diseases. Comp. Med. 58, 324-340 (2008).
  28. Komura, T., Yasui, C., Miyamoto, H., Nishikawa, Y. Caenorhabditis elegans as an alternative model host for Legionella pneumophila, and protective effects of Bifidobacterium infantis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4105-4108 (2011).
  29. Kubori, T., Shinzawa, N., Kanuka, H., Nagai, H. Legionella metaeffector exploits host proteasome to temporally regulate cognate effector. PLoS Pathog. 6, e1001216 (2010).
  30. Abu Kwaik, Y. The phagosome containing Legionella pneumophila within the protozoan Hartmannella vermiformis is surrounded by the rough endoplasmic reticulum. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2022-2028 (1996).
  31. Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
  32. Solomon, J. M., Rupper, A., Cardelli, J. A., Isberg, R. R. Intracellular growth of Legionella pneumophila in Dictyostelium discoideum, a system for genetic analysis of host-pathogen interactions. Infect. Immun. 68, 2939-2947 (2000).
  33. Hilbi, H., Weber, S. S., Ragaz, C., Nyfeler, Y., Urwyler, S. Environmental predators as models for bacterial pathogenesis. Environ. Microbiol. 9, 563-575 (2007).
  34. Khoa, D. B., Trang, L. T., Takeda, M. Expression analyses of caspase-1 and related activities in the midgut of Galleria mellonella during metamorphosis. Insect Mol Biol. 21, 247-256 (2012).
  35. Brassinga, A. K., et al. Caenorhabditis is a metazoan host for Legionella. Cell Microbiol. 12, 343-361 (2011).
  36. Harding, C. R., et al. Legionella pneumophila pathogenesis in the Galleria mellonella infection model. Infect. Immun. 80, 2780-2790 (2012).
  37. Harding, C. R., et al. The Dot/Icm effector SdhA is necessary for virulence of Legionella pneumophila in Galleria mellonella and A/J mice. Infect. Immun. 81, 10-1128 (2013).
  38. Byrne, B., Swanson, M. S. Expression of Legionella pneumophila virulence traits in response to growth conditions. Infect. Immun. 66, 3029-3034 (1998).
  39. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. , e4392 (2012).
  40. Suter, T. M., Viswanathan, V. K., Cianciotto, N. P. Isolation of a gene encoding a novel spectinomycin phosphotransferase from Legionella pneumophila. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1385-1388 (1997).
  41. Hilbi, H., Segal, G., Shuman, H. A. Icm/dot-dependent upregulation of phagocytosis by Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 42, 603-617 (2001).
  42. Watarai, M., et al. Legionella pneumophila is internalized by a macropinocytotic uptake pathway controlled by the Dot/Icm system and the mouse Lgn1 locus. J. Exp. Med. 194, 1081-1096 (2001).
  43. Santic, M., Asare, R., Doric, M., Abu Kwaik, Y. Host-dependent trigger of caspases and apoptosis by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 75, 2903-2913 (2007).
  44. Weber, S. S., Ragaz, C., Reus, K., Nyfeler, Y., Hilbi, H. Legionella pneumophila exploits PI(4)P to anchor secreted effector proteins to the replicative vacuole. PLoS Pathog. 2 (4), e46 (2006).
  45. Luo, Z. Q., Isberg, R. R. Multiple substrates of the Legionella pneumophila Dot/Icm system identified by interbacterial protein transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 841-846 (2004).
  46. Alli, O. A., et al. Temporal pore formation-mediated egress from macrophages and alveolar epithelial cells by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 68, 6431-6440 (2000).
  47. Elliott, J. A., Winn, W. C. Treatment of alveolar macrophages with cytochalasin D inhibits uptake and subsequent growth of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 51, 31-36 (1986).
  48. Cirillo, S. L., Yan, L., Littman, M., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Role of the Legionella pneumophila rtxA gene in amoebae. Microbiology. 148, 1667-1677 (2002).
  49. Ridenour, D. A., Cirillo, S. L., Feng, S., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Identification of a gene that affects the efficiency of host cell infection by Legionella pneumophila in a temperature-dependent fashion. Infect. Immun. 71, 6256-6263 (2003).
  50. Samrakandi, M. M., Cirillo, S. L., Ridenour, D. A., Bermudez, L. E., Cirillo, J. D. Genetic and phenotypic differences between Legionella pneumophila strains. J. Clin. Microbiol. 40, 1352-1362 (2002).
  51. Lomma, M., et al. The Legionella pneumophila F-box protein Lpp2082 (AnkB) modulates ubiquitination of the host protein parvin B and promotes intracellular replication. Cell. Microbiol. , (2010).
  52. Champion, O. L., et al. Galleria mellonella as an alternative infection model for Yersinia pseudotuberculosis. Microbiology. 155, 1516-1522 (2009).
  53. Banville, N., Browne, N., Kavanagh, K. Effect of nutrient deprivation on the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Virulence. 3, 497-503 (2012).
  54. Qayum, A. A., Telang, A. A protocol for collecting and staining hemocytes from the yellow fever mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. , e2772 (2011).
  55. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J. Vis. Exp. , e4173 (2012).
  56. Garcia-Garcia, E., Garcia-Garcia, P. L., Rosales, C. An fMLP receptor is involved in activation of phagocytosis by hemocytes from specific insect species. Dev. Comp. Immunol. 33, 728-739 (2009).
  57. Bogus, M., Scheller, K. Allatotropin released by the brain controls larval molting in Galleria mellonella by affecting juvenile hormone synthesis. Int. J. Dev. Biol. 40, 205-210 (1996).
  58. Chang, B., Kura, F., Amemura-Maekawa, J., Koizumi, N., Watanabe, H. Identification of a novel adhesion molecule involved in the virulence of Legionella pneumophila. Infect. 73, 4272-4280 (2005).
  59. Cianciotto, N. P. Many substrates and functions of type II secretion: lessons learned from Legionella pneumophila. Future Microbiol. 4, 797-805 (2009).
  60. Aurass, P., et al. The Legionella pneumophila Dot/Icm-secreted effector PlcC/CegC1 together with PlcA and PlcB promotes virulence and belongs to a novel zinc metallophospholipase C family present in bacteria and fungi. J. Biol. Chem. , (2013).
  61. Vogel, H., Altincicek, B., Glockner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
  62. Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J. Insect. Physiol. 57, 231-245 (2011).

Tags

Infeksjon bakterielle infeksjoner infeksjon sykdom modeller Animal bakterielle infeksjoner og mykoser, insekt-modell bakteriell infeksjon legionellose haemocytes
Ved å bruke<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som modellorganisme for å studere<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infeksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harding, C. R., Schroeder, G. N.,… More

Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection. J. Vis. Exp. (81), e50964, doi:10.3791/50964 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter