Summary
대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.
Abstract
대 식세포는 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소이며, 그들은 때문에 그들의 강력한 살균 활동의 외국 침략자에 대한 방어의 첫 번째 라인이다. 대 식세포가 널리 몸 전체에 분포하고 림프 기관에 존재하는, 간, 폐, 위장관, 중추 신경계, 뼈, 피부. 때문에 그들의 재분할 건들은 생리적 및 병리 적 과정의 넓은 범위에 참여한다. 대 식세포는 미세 환경 변화를 인식하고 조직의 항상성을 유지하기 위해 수있는 매우 다양한 세포입니다. 수많은 병원체 생존에 복제 및 감염 인간과 동물 모두를 몸 전체에 전파하기 위해 트로이 목마로 대식 세포를 사용하는 메커니즘을 진화했다. 호스트 병원체 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 대한 관심이 최근의 폭발은 대 식세포에 대한 과학적인 관심을 갱신했다. 여기에서, 우리는 설명호스트 병원체 상호 작용을 공부뿐만 아니라 다른 프로세스 대식 세포의 큰 번호를 제공합니다 쥐의 골수에서 대 식세포를 분리 및 배양하는 절차.
Introduction
대식 세포 기능의 중요한 측면은 타고난 및 적응 면역에서의 역할입니다. 때문에 불활성 입자, 세균이나 기생충을 탐식하는 그들의 능력으로, 대식 세포는 외국 침략자에 대한 방어의 첫 번째 라인이다. 일단 내면화, 미생물은 phagolysosomes 내에서 분해된다. 대 식세포는 또한 T 림프구 등의 면역 세포에 신규 모집을위한 신호와 현재의 항원을 보낼 수 있습니다. 대 식세포는 단핵 세포에서 파생됩니다. 단핵 세포는 골수 줄기 세포로부터 골수에서 발생하고이 대 식세포로 분화 말초 혈액과 여러 조직으로 마이그레이션 할 수 있습니다. 그것은 건강한 성인 마우스는 다양한 장기와 조직 (표 1) 1, 2에 몸 전체에 분포되어 약 10 8 대 식세포가 포함되어있는 것으로 추정된다. 대 식세포 때문에 자신의 미세 환경의 3,4에 적응하는 능력의 큰 표현형과 기능의 다양성을 표시합니다. 가장 중요한 macrophage 숙박 시설은 미생물을 탐식하고 파괴하는 그들의 능력에 의해 정의됩니다 자신의 살균 활동이다. 식세포 반응은 미생물의 접촉에 의해 자극 된 복잡한 시그널링 네트워크의 활성화에 의해 정의되며, 따라서, 식세포는 다양한 자극에 응답하여 적절하게 유전자 발현을 변조한다. 식균 작용 한 후, 미생물은 phagolysosome라는 구조에서 제거되고 있지만, 많은 병원성 미생물 식세포 5의 살균 기능을 파괴 할 수있는 전략을 개발했습니다. 다른 미생물 종에 의해 이용되는 파괴 메커니즘의 다양성은 식세포 과정 6의 복잡성과 phagolysosome 생합성의 증거입니다. 감염성 질환은 주요 인간의 건강 문제, 그리고 수많은 메커니즘과 분자는 대 식세포의 항균 활동에 참여한다. 또한, 미생물에 의해 납치 된 살균 속성의 목표는 알 그대로 남아 있고, 따라서 전자가대식 세포에 대한 과학적인 관심을 갱신했다 호스트 병원체 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에서 관심 XPLOSION. 현재 필드에서 연구의 대부분은 식세포 활성, 사이토킨 생산 및 산화 적 버스트의 조절에 기본 식세포 다를 대식 세포주에서 수행된다. 또한, 그들은 현미경 덜 적합하다. 상호 작용 식세포 - 병원균을 조사하기 위해 그것은 더 많은 생리적 기능을 나타내는 등 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)와 같은 차 대식 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 이 대식 세포는 형질 전환 마우스에서 직접 분리하고, 같은 렌티 바이러스 형질 전환과 같은 새로운 기술의 가용성을 할 수 있기 때문에 또한,이 유전자 변형 BMDMs에서 작동 할 수 있으며, 자신의 유전자 발현 프로파일이 유전자 과발현 또는 RNA 간섭에 의해 변경 될 수 있습니다. 여기, 우리는 쥐의 뼈 M을 차별화하는 절차를 설명기능이 같은 단백질 체학 7, transcriptomics 8로 분석하여 다양한위한 7 일에서 대식 세포의 큰 번호를 제공합니다 식세포에 화살표, 세포 내 인신 매매는 9, 동적 스터디 10, 유전 스크린 (RNAi의) 11 심사 약물을 연구.
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Protocol
윤리 정책
규칙에 맞는 엑스 마르세유 대학에서 동물 처리를위한 프로토콜이 우리의 기관 동물 윤리위원회 "헌법위원회 Scientifique 뒤 센터 드 형성 등 드 공들인 실험 의학적 Chirurgical"의 승인을 받았다 (CFREMC, 에릭 Ghigo에 프로젝트 허가 10-300122013) 의 Décret N은 1987년 10월 19일의 87-848을 °. 실험은 Faculté 드 MEDECINE 드 라 티모네 (에릭 Ghigo에 실험 허가 번호 13.385)에서 수행 하였다.
1. 재료 및 문화 미디어 준비
- 두 집게, 두 개의 가위, 두 수술 블레이드, 박격포와 유봉을 소독.
- 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 2 MM의 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 μg을 포함하는 완전한 DMEM를 얻습니다.
- 1X PBS를 얻기 위해 멸균 증류수로 10 배 PBS를 희석.
- 얼음처럼 차가운 1X PBS, 얼음처럼 차가운 완전한 DMEM, 완전한 DMEM의 워싱턴 주를 얻37 ° C.에 RMED
2. L929 세포 상층 액의 제조
- 37 ° C에서 완전한 DMEM에 (이십 175cm 2 플라스크) 5 % CO 2를 합류 할 L929 세포를 성장.
주 : 인자 (GM-CSF)를 자극하는 과립구 - 대 식세포 콜로니가 대 식세포 (12)에 조혈 세포의 분화를 유도하는 데 필요합니다. L929 세포는 GM-CSF를 생산하고 있습니다.
- 합류, 신선한 완전한 DMEM과 문화 매체를 교체하십시오. 10 일 동안 32 ° C, 5 % CO 2에 플라스크를 전송합니다.
- 수집, 수영장과 10 분 동안 750 XG에서 상층 액을 원심 분리기. 세포 펠렛을 폐기하십시오.
- -20 ℃에서 15 ML 튜브 및 저장소에 보관 상층 액
3. 뼈 식세포 (BMDM) 제조 예 골수 유래
- 자궁 전위에 의해 1 마우스를 희생.
- 실험을하는 동안 무균 수술 블레이드를 사용합니다. 70 % ALCO로 피부를 소독HOL. 각 뒷다리의 상단에 절개를하고 근육을 노출하는 발쪽으로 피부를 아래로 당겨.
- 뒷다리를 잘라, 멸균 가위 및 멸균 집게로 피부를 제거합니다. 살균, 얼음처럼 차가운 1X PBS (5 ㎖)를 포함하는 멸균 페트리 접시 (10분의 35 ㎜) 내 다리를 놓습니다.
- 멸균 가위와 집게로 뼈에 부착되어있는 살과 근육을 제거합니다.
- 얼음처럼 차가운, 살균 1X PBS (5 ㎖)를 포함하는 새로운 멸균 페트리 접시 (10분의 35 ㎜)에 뼈를 전송합니다. 5 ML 얼음처럼 차가운, 살균 1X PBS와 뼈를 두 번 씻으십시오.
- 5 ML 얼음처럼 차가운, 살균 1X PBS를 포함하는 멸균 박격포에 뼈를 전송합니다.
- 멸균 가위로 관절에서 대퇴골에서 경골을 잘라. 유봉을 사용하여 5 ㎖ 얼음처럼 차가운, 살균 1X PBS를 포함하는 멸균 박격포 부드럽게 뼈를 분쇄.
- 얼음처럼 차가운 15 ML 튜브에 뜨는을 수집합니다. 이 단계의 3 배를 반복합니다.
- 70 μm의 나일론 셀 스트라 통해 필터고체 조각을 제거하는 iner. 4 ℃에서 10 분 동안 450 XG에서 여과 액을 원심 분리기
- 조심스럽게 상층 액을 버린다. 30 초 동안 10 ㎖ 적혈구 세포 용해 버퍼에 펠렛을 떼어 놓다. 20 ㎖의 얼음처럼 차가운, 완전한 DMEM을 추가합니다.
주 :이 단계의 목적은 적혈구 오염 제거하는 것이다, 따라서,이 단계는 적혈구 세포 용해 완충액에 의해 조혈 세포의 변질을 방지하기 위해 2 분 이내에 수행해야한다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 450 XG에 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 버린다. 37 ℃로 가온 한 20 ㎖ 완전한 DMEM에서 펠렛을 떼어 놓다
- 2 페트리 접시 (20분의 100 ㎜)로 분해 세포를 전송합니다. 37 ℃에서 4 시간 동안 그들을 품어
- 실온에서 50 ML 튜브에 상층 액을 수집합니다. 상주 대식 세포를 포함하는 요리를 폐기하십시오.
참고 :이 단계의 목적은 주민 뼈 MARRO을 제거하는 것입니다문화 처리 된 플라스틱을 준수 할 수있는 능력에 의해 w 식세포. 이러한 상주 식세포는 다른 실험에 사용될 수있다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 450 XG에서 수집 된 상층 액을 원심 분리기 상층 액을 버린다.
- 10 ㎖의 15 % L929 세포의 상층 액을 포함하는 완전한 DMEM 부드럽게 펠렛을 떼어 놓다. 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다.
- 여과 액을 복구 할 수 있습니다. 140 ㎖의 15 % L929 휴대 미디어로 보충 된 완전한 DMEM에 수집 된 여과 액 (10 ㎖)를 추가합니다.
- 페트리 접시 (15 페트리 접시, 20분의 100 ㎜) 당 세포 현탁액 10 ㎖를 배포합니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 품어.
- 3 일 동안 세포를 성장
- 10 ㎖의 15 % L929 보충 된 완전한 DMEM을 추가합니다. 4 추가 일 동안 세포를 품어.
참고 : 거꾸로 현미경으로 주기적으로 세포 성장을 모니터 (3.14-3.16 단계). 식세포가 될 것입니다문화의 3 일 후에 관찰했다.
4. 수확 BMDMs
- 뜨는을 제거합니다. 완전한 DMEM으로 BMDMs을 2 회 반복
- 5 ㎖를 37 ℃로 예열 된 완전한 DMEM 추가 부드럽게 고무 경찰관으로 긁어 BMDMs를 분리합니다.
- 10 분 450 XG에 50 ML 튜브와 원심 분리기에 BMDMs를 수집합니다. 조심스럽게 20 ML 완전한 DMEM으로 세포 펠렛을 떼어 놓다.
- 트리 판 블루의 존재에 BMDMs 카운트 (더 이상 10 % 이상 사망률이 관찰 될 수 없습니다).
참고 : 일반적으로, 약 6-7.5 × 10 7 대식 세포는 대 식세포의 15 페트리 접시 (20분의 100 ㎜)에서 얻을 수 있습니다. 약 4 ~ 5 × 10 6 대 식세포 / 페트리 접시 (20분의 100 밀리)가있다.
- 실험에 필요한 BMDMs를 준비합니다. 37 ° C에서 전체 미디어의 16 시간 후, 5 % CO 2, 대식 세포는 다시 지원을 준수합니다.
5. BMDMs 저장
- 고립 BMDMs (4.3 단계)를 수집합니다. 10 분 450 XG에 원심 분리기. 참고 : BMDMs은 액체 질소에 냉동 할 수있다.
- 각 앰풀에 / ㎖ 피펫 1 ㎖ 4 × 10 6 세포의 최종 농도 10 % DMSO 및 90 % FCS로 구성된 미디어를 동결을 Resuspend 세포 펠렛.
- 1 ° C / 분의 냉각 속도로 세포를 동결. 24 시간 후, 장기간 저장을 위해 액체 질소 용기에 앰플을 전송.
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Representative Results
이 방법의 목적은 쉽게 몇 일 대식 세포의 큰 숫자를 얻을 수 있었다. 골수 세포의 제조는도 1에 도시되어있다. 뒷다리의 뼈를 수집 및 박격포에서 격돌했다. 상주 식세포는 골수 세포 제제로부터 제거 된 후에, 골수 세포를 GM-CSF (0 일)와 함께 배양 하였다. 3 일 후에, 문화 전 라운드와 비 접착 있던 세포, 대 식세포로 분화 및 (그림 1A)을 준수하기 시작합니다. 세포 계측법 분석 F4/80를 사용하여 HLA-DR 마커는 세포 따라서 그들은 대식 세포 (그림 1B)로 분화하는 것을 증명 모두 마커를 표명 것으로 나타났다. 7 일 후에, BMDM 단층는 6-7.5 × 10 7 BMDM / 마우스를 얻었다. 대 식세포는 실험의 다양한 유형 (도 2)에서 이용 될 수있다. BMDMs의 기능적 활동은 다른 방식으로 결정될 수있다. 예를 들어, BMDM는 phagocytosIS는 라텍스 구슬의 내면화에 의해 감시되었다. 셀 당 구슬의 수는 시간 (그림 2A) 이상 증가했다. BMDM 세포 내 이입의 전위 (도 2B)은, 세균성 병원체 상호 작용 (도 2C) 및 신호 전달 경로 (도 2D)도 평가 하였다.
| 위치 | 세포 유형 |
| 뼈 | 파골 세포 |
| 골수 | 프로 단핵구, 대 식세포 |
| 중추 신경계 | 미세 아교 세포 |
| 고유 층 | 주민 식세포 |
| 간 | 쿠퍼 세포 |
| 폐 | 폐포 대 식세포 |
| 말초 혈액 | 단핵구 |
| 복강 | 복막 대 식세포 |
| 피부 | 랑게르한스 세포 |
| 비장 | 주민 식세포 |
| 흉선 | 주민 식세포 |
조직과 체액 표 1. 식세포 소스.
그림 1. BMDM 생산의 개략도. (A)이 그림은 대 식세포 (DAY7를) 성숙 전구 차별화 (0 일)에서 BMDM 분화의 단계를 보여줍니다. (B) FACS 분석 대식 세포 마커 HLA-DR과 F4/80로 사용 7 일째에 고립 된 세포의 순도를 보여줍니다. 큰를 보려면 여기를 클릭하십시오R 그림.
그림 2. BMDMs와 가능 실험의 예. (A) 식균 작용의 분석. BMDMs 라텍스 구슬 시간의 다른 기간 동안 배양하고, 비드 흡수는 현미경으로 관찰되었다. (B) BMDMs의 세포 내 Coxiella burnetii 지질 다당류 (LPS) 번역. LPS는 (빨간색) (파란색) 단백질 1 (LAMP-1) 리소좀 관련 막을 항구 구획 지역화하지만 D (녹색)를 카 텝신되지 않았습니다. 이 실험은 LPS는 리소좀과 융합 할 수없는 말 엔도 솜에 있는지 보여줍니다. (빨간색) Tropheryma whipplei 감염 (C) BMDMs는 (녹색) 카 텝신 D를 비호하는 구획에서 지역화되지 않았습니다. (D) 대표 immunob많은 전체 (t)와 인산화 (P) p38α 대장균 LPS 자극 BMDMs (1 ㎍ / ㎖)의 MAP 키나제 수준을 보여주는. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다.
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Discussion
본원에 기재된 프로토콜은 BMDMs 다수 생산하는 방법을 상세. BMDM은 일차 전지이며 미성숙 대 식세포 세포주 달리, 성숙한 있기 때문에 생물학적 기능 및 단핵구로부터 분화 된 대식 세포의 특성을 갖는다. BMDMs는 유전자 검사 (RNAi의), 약물 스크리닝, 기능적 연구 기주 - 연구 및 조사의 많은 다른 분야에 사용될 수있다.
본원에 제시된 절차는 매우 간단하고 특수 장비를 필요로하지 않으며, 따라서 용이 실험실 또는 교실에서 수행 될 수있다. 이 방법은 약간의 연습과 손재주를 필요로한다. 그것은 따라서 향후 실험을 용이하게 액체 질소에 BMDMs를 저장하는 것도 가능하다.
성공적인 BMDM 문화에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 : 1) 멸균, 건강한 문화를 유지하고는, 2) 골수 추출을 효율적으로 필요 3) L929 SUPernatant 품질이 중요하다, 4) 조혈 세포의 손상을 방지하기 위해 2 개 이상의 분 동안 적혈구 세포 용해 버퍼에 세포를 노출하지 않습니다.
이 프로토콜의 일부 수정을 할 수 있습니다 만, 수를 제한에 있습니다. 1) DMEM는 RPMI 1640으로 대체 될 수 있지만 BMDM 생산이 덜 효율적이며, 2) 시판의 M-CSF (500-1000 UI / ml)을 대신 L929 상등액 중에서 사용될 수 있지만 고가이고 M-CSF가이어야 분화 과정 동안 세포 이일마다 추가 3) 다르게는 골수 대신 유봉을 사용하여 멸균 박격포 뼈 스매싱 25 G 바늘을 탑재 주사기를 사용하여 뼈로부터 압출 될 수있다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 CNRS (PICS EG에 2012-2014)에 의해 Regione 캄파니아 (LR의 N.5, 지오 반나 모톨라에 2002년 3월 28일)에서 부여에 의해 지원되었다. 필리포 콘티 과학 협력 재단 'Infectiopole 수드의 동료입니다.'니콜라 Boucherit은 연구 및 기술에 대한 프랑스 정부의 동료입니다. 자금 출처는 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고 준비에 역할을했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
