Summary
मैक्रोफेज लंबे सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में मान्यता दी गई है. मैक्रोफेज और रोगाणुओं के बीच बातचीत की, विकासवादी आनुवंशिक, और जैव रासायनिक पहलुओं से संबंधित ज्ञान के हाल के विस्फोट मैक्रोफेज के लिए वैज्ञानिक ध्यान नए सिरे से किया गया है. यह लेख माउस अस्थि मज्जा से मैक्रोफेज अंतर करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है.
Abstract
मैक्रोफेज सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के महत्वपूर्ण घटक हैं, और वे क्योंकि उनके शक्तिशाली microbicidal गतिविधियों का विदेशी आक्रमणकारियों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति रहे हैं. मैक्रोफेज व्यापक रूप से पूरे शरीर में वितरित और lymphoid अंगों में मौजूद हैं, यकृत, फेफड़े, जठरांत्र संबंधी मार्ग, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, अस्थि, और त्वचा. क्योंकि उनके पुनर्विभाजन की, वे शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में भाग लेते हैं. मैक्रोफेज microenvironmental परिवर्तन को पहचान करने और ऊतक homeostasis को बनाए रखने में सक्षम हैं कि अत्यधिक बहुमुखी कोशिकाओं रहे हैं. कई रोगजनकों, जीवित रहने में दोहराने, और संक्रमित मनुष्यों और पशुओं दोनों और पूरे शरीर में प्रचार करने के लिए ट्रोजन घोड़े के रूप में मैक्रोफेज उपयोग करने के लिए तंत्र विकसित किया है. मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की, विकासवादी आनुवंशिक, और जैव रासायनिक पहलुओं में रुचि के हाल के विस्फोट मैक्रोफेज के बारे में वैज्ञानिक ध्यान नए सिरे से किया गया है. यहाँ, हम एक वर्णनमेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के साथ ही अन्य प्रक्रियाओं के लिए मैक्रोफेज की बड़ी संख्या प्रदान करेगा कि murine अस्थि मज्जा से मैक्रोफेज अलग करने और खेती करने के लिए प्रक्रिया.
Introduction
बृहतभक्षककोशिका समारोह का एक महत्वपूर्ण पहलू सहज और प्रतिरक्षा अनुकूली में उनकी भूमिका है. क्योंकि निष्क्रिय कण, जीवाणु या परजीवी phagocytose करने के लिए उनकी क्षमता के मैक्रोफेज विदेशी आक्रमणकारियों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति रहे हैं. एक बार भाँति, रोगाणुओं phagolysosomes भीतर अपमानित कर रहे हैं. मैक्रोफेज भी इस तरह के टी lymphocytes के रूप में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर भर्ती के लिए संकेत है और वर्तमान एंटीजन भेजें. मैक्रोफेज monocytes से निकाली गई है. Monocytes माइलॉयड स्टेम सेल से अस्थि मज्जा में पैदा होती है और वे मैक्रोफेज में अंतर जहां परिधीय रक्त और विभिन्न ऊतकों की ओर पलायन. यह एक स्वस्थ वयस्क माउस विभिन्न अंगों और ऊतकों (1 टेबल) 1,2 में शरीर भर में वितरित कर रहे हैं कि लगभग 10 8 मैक्रोफेज होता है कि अनुमान है. मैक्रोफेज क्योंकि उनके microenvironment 3,4 के लिए अनुकूल करने की क्षमता के महान प्ररूपी और कार्यात्मक विविधता प्रदर्शित करते हैं. सबसे महत्वपूर्ण macropहेग संपत्ति रोगाणुओं phagocytose और उन्हें नष्ट करने के लिए अपनी क्षमता से परिभाषित किया गया है जो उनके microbicidal गतिविधि है. phagocytic प्रतिक्रिया माइक्रोबियल संपर्क द्वारा प्रेरित कर रहे हैं कि जटिल नेटवर्क संकेतन की सक्रियता से परिभाषित किया गया है, इस प्रकार, मैक्रोफेज विविध उत्तेजनाओं के जवाब में उचित रूप से जीन अभिव्यक्ति मिलाना. Phagocytosis के बाद, रोगाणुओं phagolysosome नामक संरचना में समाप्त हो जाते हैं, लेकिन, कई रोगजनक रोगाणुओं मैक्रोफेज 5 की microbicidal समारोह नाश करने के लिए रणनीति विकसित किया है. विभिन्न माइक्रोबियल प्रजातियों द्वारा उपयोग किया जाता है कि तोड़फोड़ तंत्र की विविधता phagocytic प्रक्रिया 6 की जटिलता और phagolysosome जीवजनन के लिए एक वसीयतनामा है. संक्रामक रोगों के प्रमुख मानव स्वास्थ्य समस्याएं हैं, और कई तंत्र और अणुओं बृहतभक्षककोशिका रोगाणुरोधी गतिविधियों में भाग लेते हैं. इसके अलावा, रोगाणुओं द्वारा अपहरण कर रहे हैं कि microbicidal गुण का लक्ष्य अनजान रहते हैं, इस प्रकार, एक ई हैमैक्रोफेज के बारे में वैज्ञानिक ध्यान नए सिरे से किया गया है कि मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की, विकासवादी आनुवंशिक, और जैव रासायनिक पहलुओं में ब्याज की xplosion. वर्तमान में, क्षेत्र में अनुसंधान के बहुमत phagocytic गतिविधि, साइटोकिन्स उत्पादन और oxidative फट के नियमन में प्राथमिक मैक्रोफेज से अलग जो मैक्रोफेज सेल लाइनों, पर किया जाता है. इसके अलावा, वे माइक्रोस्कोपी के लिए कम उपयुक्त हैं. बातचीत मैक्रोफेज-रोगजनकों की जांच करने के लिए इसे और अधिक शारीरिक विशेषताएं जो प्रदर्शन ऐसे अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) के रूप में प्राथमिक मैक्रोफेज, उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. इन मैक्रोफेज ट्रांसजेनिक चूहों से सीधे पृथक और, इस तरह के lentiviral अभिकर्मक के रूप में उपन्यास प्रौद्योगिकियों की उपलब्धता के साथ किया जा सकता है, क्योंकि इसके अलावा, यह आनुवंशिक रूप से संशोधित BMDMs पर काम करने के लिए संभव है, उनके जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल जीन overexpression या शाही सेना के हस्तक्षेप से बदला जा सकता है. यहाँ, हम murine अस्थि एम अंतर करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णनकार्यात्मक ऐसे प्रोटिओमिक्स 7, transcriptomics 8 के रूप में विश्लेषित करती विभिन्न के लिए 7 दिनों में मैक्रोफेज की बड़ी संख्या प्रदान करेगा कि मैक्रोफेज में तीर, intracellular तस्करी 9, गतिशील पढ़ाई 10, आनुवंशिक स्क्रीन (आरएनएआई) और 11 स्क्रीनिंग दवा पढ़ाई.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
आचार विवरण
नियमों के साथ समझौते में ऐक्स मारसैल विश्वविद्यालय से जानवर से निपटने के लिए प्रोटोकॉल हमारे संस्थागत पशु आचार समिति "Conseil Scientifique डू सेंटर डी गठन एट डे Recherche प्रायोगिक चिकित्सा चिरूरजिकल" द्वारा अनुमोदित किया गया था (CFREMC, एरिक Ghigo परियोजना परमिट 10-300122013) के Décret एन 1987/10/19 के 87-848 °. प्रयोगों Faculté डे medecine डे ला Timone (एरिक Ghigo करने के लिए प्रयोग की अनुमति की संख्या 13.385) पर प्रदर्शन किया गया.
1. सामग्री और संस्कृति मीडिया तैयारी
- दो संदंश, दो कैंची, दो सर्जिकल ब्लेड, एक मोर्टार और मूसल जीवाणुरहित.
- 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 2 मिमी glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम युक्त पूरा DMEM प्राप्त करते हैं.
- 1x पीबीएस प्राप्त करने के लिए बाँझ distillated पानी में 10x पीबीएस पतला.
- ठंडा 1x पीबीएस, बर्फ ठंड पूरा DMEM, पूरा DMEM वा प्राप्त37 डिग्री सेल्सियस के rmed
2. L929 सेल Supernatants की तैयारी
- , 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरा DMEM में (बीस 175 सेमी 2 बोतल) 5% सीओ 2 के संगम L929 कोशिकाओं को विकसित.
नोट: कारक (जीएम-CSF) उत्तेजक granulocyte-बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी मैक्रोफेज 12 में hematopoietic सेल भेदभाव उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. L929 कोशिकाओं जीएम-CSF का उत्पादन.
- संगम पर ताजा पूरा DMEM के साथ संस्कृति मीडिया की जगह. 10 दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 बोतल स्थानांतरण.
- लीजिए, पूल और 10 मिनट के लिए 750 XG पर supernatants अपकेंद्रित्र. सेल छर्रों त्यागें.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीलीटर ट्यूब और दुकान में स्टोर supernatants
3. अस्थि मैक्रोफेज (BMDM) तैयार करना मज्जा व्युत्पन्न
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से 1 माउस बलिदान.
- प्रयोग के दौरान बाँझ सर्जिकल ब्लेड का प्रयोग करें. 70% ALCO साथ त्वचा कीटाणुरहितhol. प्रत्येक हिंद पैर के शीर्ष पर एक चीरा और मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए पैर की ओर त्वचा के नीचे खींच.
- पिछले पैरों कट, बाँझ कैंची और बाँझ संदंश के साथ त्वचा को हटा दें. बाँझ, ठंडा 1x पीबीएस (5 एमएल) युक्त एक बाँझ पेट्री डिश (35/10 मिमी) के भीतर पैर रखें.
- बाँझ कैंची और संदंश के साथ हड्डियों का पालन कर रहे हैं कि शरीर और मांसपेशियों निकालें.
- बहुत ठंडा, बाँझ 1x पीबीएस (5 एमएल) युक्त एक नया, बाँझ पेट्री डिश (35/10 मिमी) में हड्डियों स्थानांतरण. 5 मिलीलीटर ठंडा, बाँझ 1x पीबीएस के साथ हड्डियों दो बार धोएं.
- 5 मिलीलीटर ठंडा, बाँझ 1x पीबीएस युक्त एक बाँझ मोर्टार में हड्डी स्थानांतरण.
- बाँझ कैंची के साथ संयुक्त पर फीमर से टिबिया काटें. एक पैर का उपयोग 5 मिलीलीटर ठंडा, बाँझ 1x पीबीएस युक्त एक बाँझ मोर्टार में धीरे हड्डियों लूट.
- ठंडा 15 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए. इस कदम 3x दोहराएँ.
- एक 70 माइक्रोन नायलॉन सेल रणनीति के माध्यम से फ़िल्टरठोस टुकड़े को हटाने के लिए INER. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर छानना अपकेंद्रित्र
- धीरे सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 30 सेकंड के लिए 10 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिका lysis बफर में गोली अलग कर देना. 20 मिलीलीटर ठंडा, पूरा DMEM जोड़ें.
नोट: इस कदम का उद्देश्य लाल रक्त कोशिकाओं contaminating दूर करने के लिए है, इस प्रकार, इस चरण लाल रक्त कोशिका lysis बफर द्वारा hematopoietic सेल परिवर्तन से बचने के लिए 2 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र धीरे सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया है कि 20 मिलीलीटर पूरा DMEM में गोली अलग कर देना
- 2 पेट्री डिश (100/20 मिमी) में अलग कोशिकाओं स्थानांतरण. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए उन्हें सेते
- कमरे के तापमान पर 50 मिलीलीटर ट्यूब में supernatants लीजिए. निवासी मैक्रोफेज होते व्यंजन है कि त्यागें.
नोट: इस कदम का उद्देश्य निवासी हड्डी MARRO को खत्म करने के लिए हैसंस्कृति का इलाज प्लास्टिक का पालन करने की उनकी क्षमता से डब्ल्यू मैक्रोफेज. ये निवासी मैक्रोफेज अन्य प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 450 XG पर एकत्र supernatants अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- 10 मिलीलीटर 15% L929 सेल सतह पर तैरनेवाला युक्त पूरा DMEM में धीरे गोली अलग कर देना. एक 40 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं तक.
- छानना वसूल लेंगे. 140 मिलीलीटर 15% L929 सेल मीडिया के साथ पूरक किया गया है कि पूरा DMEM के लिए एकत्र छानना (10 मिलीग्राम) जोड़ें.
- पेट्री डिश (15 पेट्री डिश, 100/20 मिमी) प्रति सेल निलंबन के 10 एमएल बांटो. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं.
- 3 दिनों के लिए कोशिकाओं को विकसित
- 10 मिलीलीटर 15% L929 के साथ पूरक किया गया है कि पूरा DMEM जोड़ें. 4 अतिरिक्त दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
नोट: एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ समय समय पर सेल के विकास की निगरानी (3.14-3.16 कदम). पक्षपाती मैक्रोफेज हो जाएगासंस्कृति के 3 दिन बाद मनाया.
4. फसल काटने BMDMs
- सतह पर तैरनेवाला निकालें. पूरा DMEM साथ BMDMs 2 बार धोएं
- 5 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया है कि पूरा DMEM जोड़ें धीरे एक रबर पुलिसकर्मी के साथ scraping द्वारा BMDMs अलग करें.
- 10 मिनट के लिए 450 XG पर 50 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में BMDMs लीजिए. धीरे 20 मिलीलीटर पूरा DMEM में सेल छर्रों अलग कर देना.
- Trypan नीले रंग की उपस्थिति में BMDMs गणना (कोई 10 से अधिक% मृत्यु दर मनाया जाना चाहिए).
नोट: आम तौर पर, लगभग 6-7.5 10 x 7 मैक्रोफेज मैक्रोफेज की 15 पेट्री डिश (100/20 मिमी) से प्राप्त कर रहे हैं. लगभग 4-5 एक्स 10 6 मैक्रोफेज / पेट्री डिश (100/20 मिमी) कर रहे हैं.
- प्रयोग के लिए आवश्यक रूप BMDMs तैयार करें. 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरा मीडिया में 16 घंटे के बाद, 5% सीओ 2, मैक्रोफेज फिर समर्थन का पालन करना होगा.
5. BMDMs के संचय
- पृथक BMDMs (4.3 चरण) लीजिए. 10 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र. नोट: BMDMs तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा सकता है.
- प्रत्येक इंजेक्शन की शीशी में / एमएल और पिपेट 1 मिलीलीटर 4 x 10 6 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता में 10% DMSO और 90% FCS से मिलकर मीडिया ठंड में Resuspend सेल छर्रों.
- 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट की एक शीतलन दर पर कोशिकाओं रुक. 24 घंटे के बाद, लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन कंटेनर के लिए इंजेक्शन की शीशी हस्तांतरण.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस पद्धति का लक्ष्य आसानी से कुछ ही दिनों में मैक्रोफेज की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए था. अस्थि मज्जा सेल तैयारी चित्रा 1 में सचित्र है. हिंद पैर से हड्डियां एकत्र की है और एक मोर्टार में मिटा रहे थे. निवासी मैक्रोफेज अस्थि मज्जा कोशिका तैयार करने से हटा दिया गया है एक बार, अस्थि मज्जा की कोशिकाओं जीएम-CSF (0 दिन) के साथ incubated रहे थे. 3 दिनों के बाद, संस्कृति पहले दौर और nonadherent थे जो कोशिकाओं, मैक्रोफेज में अंतर और (चित्रा 1 ए) के पालन करने के लिए शुरू करते हैं. Cytometry विश्लेषण F4/80 का उपयोग और एचएलए डीआर मार्करों कोशिकाओं इस प्रकार वे मैक्रोफेज (चित्रा 1 बी) में भेदभाव कर रहे हैं साबित करना है कि दोनों मार्करों व्यक्त किया कि पता चला. 7 दिनों के बाद, एक BMDM monolayer 6-7.5 10 x 7 BMDM / माउस के साथ प्राप्त हुई थी. मैक्रोफेज प्रयोगों के विभिन्न प्रकार (चित्रा 2) में इस्तेमाल किया जा सकता है. BMDMs के कार्यात्मक गतिविधियों अलग अलग तरीकों से निर्धारित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, BMDM phagocytosहै लेटेक्स मनका internalization द्वारा नजर रखी थी. सेल प्रति मोतियों की संख्या समय (2A चित्रा) से अधिक की वृद्धि हुई. BMDM endocytic क्षमता (चित्रा 2 बी), जीवाणु रोगज़नक़ बातचीत (चित्रा -2) और संकेत पारगमन मार्ग (चित्रा 2 डी) भी मूल्यांकन किया गया.
| स्थान | सेल प्रकार |
| हड्डी | अस्थिशोषक |
| अस्थि - मज्जा | समर्थक एककेंद्रकश्वेतकोशिका, बृहतभक्षककोशिका |
| केंद्रीय तंत्रिका तंत्र | Microglial सेल |
| लामिना propria | निवास बृहतभक्षककोशिका |
| जिगर | Kupffer सेल |
| फेफड़ा | वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका |
| परिधीय रक्त | एककेंद्रकश्वेतकोशिका |
| उदरावण गह्वर | पेरिटोनियल बृहतभक्षककोशिका |
| त्वचा | Langerhans सेल |
| तिल्ली | निवास बृहतभक्षककोशिका |
| थाइमस | निवास बृहतभक्षककोशिका |
ऊतकों और तरल पदार्थ में तालिका 1. मैक्रोफेज सूत्रों.
चित्रा 1. BMDM उत्पादन के योजनाबद्ध देखें. (ए) यह आंकड़ा मैक्रोफेज (day7) परिपक्व करने के पूर्वज भेदभाव (0 दिन) से BMDM भेदभाव के इस कदम को दिखाता है. (बी) FACS विश्लेषण मैक्रोफेज मार्करों एचएलए डीआर और F4/80 के रूप में उपयोग करते हुए दिन 7 पर अलग कक्षों की पवित्रता को दिखाता है. बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंआर आंकड़ा.
चित्रा 2. BMDMs के साथ संभव हो रहे हैं कि प्रयोगों के उदाहरण. (ए) Phagocytosis परख. BMDMs लेटेक्स मोतियों के साथ समय के विभिन्न अवधियों के लिए incubated रहे थे, और मनका तेज माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया गया. (बी) BMDMs में intracellular Coxiella burnetii (LPS) lipopolysaccharide स्थानीयकरण. LPS (लाल रंग में) (नीला) में प्रोटीन -1 (दीपक -1) lysosomal जुड़े झिल्ली बंदरगाहों कि एक डिब्बे में स्थानीयकृत लेकिन डी (हरे रंग में) cathepsin नहीं किया गया था. इस प्रयोग LPS लाइसोसोम के साथ फ्यूज करने में असमर्थ हैं कि देर endosomes में मौजूद है कि यह दर्शाता है. (लाल रंग में) Tropheryma whipplei से संक्रमित (सी) BMDMs (हरे रंग में) cathepsin डी बंदरगाहों कि डिब्बे में अनुवादित नहीं किया गया था. (डी) प्रतिनिधि immunobबहुत कुल (टी) और phosphorylated (पी) p38α कोलाई LPS उत्तेजित BMDMs (1 ग्राम / एमएल) में नक्शा kinase के स्तर का प्रदर्शन है. स्केल सलाखों 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ बताया प्रोटोकॉल BMDMs की बड़ी संख्या का उत्पादन करने के लिए एक विधि का विवरण. BMDM प्राथमिक कोशिकाओं रहे हैं और अपरिपक्व हैं जो बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों, के विपरीत, परिपक्व क्योंकि वहाँ जैविक समारोह और monocytes से भेदभाव मैक्रोफेज के गुण होते हैं. BMDMs आनुवंशिक स्क्रीनिंग (आरएनएआई), दवा स्क्रीनिंग, कार्यात्मक अध्ययन, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन और जांच के कई अन्य क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रक्रिया बहुत सरल है और किसी भी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है, इसलिए यह आसानी से एक प्रयोगशाला या कक्षा में प्रदर्शन किया जा सकता है. इस विधि कुछ अभ्यास और मैनुअल निपुणता की आवश्यकता है. यह इस प्रकार भविष्य प्रयोगों की सुविधा, तरल नाइट्रोजन में BMDMs स्टोर करने के लिए भी संभव है.
सफल BMDM संस्कृति के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) एक बाँझ, स्वस्थ संस्कृति को बनाए रखने के लिए, 2) अस्थि मज्जा निकासी कुशल होने की जरूरत है, 3) L929 समर्थनernatant गुणवत्ता महत्वपूर्ण है, 4) hematopoietic सेल क्षति से बचने के लिए अधिक से अधिक 2 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिका lysis बफर करने के लिए कोशिकाओं का खुलासा नहीं करते.
यह प्रोटोकॉल का कुछ संशोधन करने के लिए संभव है, लेकिन संख्या को सीमित करने में कर रहे हैं. 1) DMEM RPMI 1640 द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन BMDM उत्पादन कम कुशल है, 2) वाणिज्यिक एम सीएसएफ (500-1000 यूआई / एमएल) के बजाय L929 पर तैरनेवाला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह महंगा है और एम सीएसएफ हो गया है भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को 2 दिनों हर गयी, 3) वैकल्पिक रूप से अस्थि मज्जा के बजाय एक मूसल का उपयोग कर एक बाँझ मोर्टार में हड्डियों मुंहतोड़ के 25 ग्राम सुई से लैस एक सिरिंज का उपयोग हड्डी से extruded किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई घोषित संघर्ष कर रहे हैं.
Acknowledgments
इस काम CNRS (pics जैसे 2012-2014) द्वारा और Regione Campania (एलआर n.5, Giovanna Mottola के लिए 2002/03/28) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. फिलिपो कोंटी वैज्ञानिक सहयोग फाउंडेशन'' Infectiopole सूद के एक साथी है.'' निकोला Boucherit अनुसंधान और प्रौद्योगिकी के लिए फ्रेंच मंत्रालय के एक साथी है. धन स्रोतों का अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह, डेटा विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि तैयार करने में कोई भूमिका नहीं थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
