Summary
Makrofager har länge setts som en viktig komponent i det medfödda och adaptiva immunsvar. Den senaste tidens explosion av kunskap som rör evolutionära, genetiska och biokemiska aspekter på samspelet mellan makrofager och mikrober har förnyat vetenskaplig uppmärksamhet på makrofager. Denna artikel beskriver en metod för att differentiera makrofager från mus-benmärg.
Abstract
Makrofager är viktiga komponenter i det medfödda och adaptiva immunsvar, och de är den första försvarslinjen mot främmande inkräktare på grund av deras starka mikrobicidala aktiviteter. Makrofager är vitt spridda i hela kroppen och är närvarande i de lymfoida organen, lever, lungor, mag-tarmkanal, centrala nervsystemet, ben och hud. På grund av deras fördelning, de deltar i en mängd olika fysiologiska och patologiska processer. Makrofager är mycket mångsidiga celler som har förmåga att känna igen microenvironmental förändringar och för att upprätthålla vävnads homeostas. Många patogener har utvecklats mekanismer för att använda makrofager som trojanska hästar för att överleva, replikera i och infektera både människor och djur och att propagera genom hela kroppen. Den senaste tidens explosion av intresset för evolutionära, genetiska och biokemiska aspekter av värd-patogen interaktioner har förnyat vetenskaplig uppmärksamhet rörande makrofager. Här beskriver vi enförfarande för att isolera och odla makrofager från murin benmärg som kommer att ge ett stort antal makrofager för att studera värd-patogen interaktioner liksom andra processer.
Introduction
En viktig aspekt av makrofagfunktion är deras roll i medfödd och adaptiv immunitet. På grund av deras förmåga att phagocytose inerta partiklar, bakterier eller parasiter, makrofager är en första försvarslinje mot främmande inkräktare. När internaliseras, är mikrober ned inom phagolysosomes. Makrofager skickar också rekryterings signaler för och presentera antigener till andra immunceller såsom T-lymfocyter. Makrofager är härledda från monocyter. Monocyter uppstår i benmärgen från myeloida stamceller och migrera till perifert blod och olika vävnader där de differentierar till makrofager. Det uppskattas att en frisk vuxen mus innehåller ungefär 10 8 makrofager som distribueras i hela kroppen i olika organ och vävnader (Tabell 1) 1,2. Makrofager visar stora fenotypiska och funktionella mångfald på grund av deras förmåga att anpassa sig till sin mikromiljö 3,4. Den viktigaste macrophage egenskap är deras mikrobicid aktivitet, som definieras av deras förmåga att fagocytera mikrober och förstör dem. Den fagocytiska svar definieras genom aktiveringen av komplexa signaleringsnätverk som stimuleras av mikrobiell kontakt, alltså, macrophages modulera genexpression på lämpligt sätt som svar på olika stimuli. Efter fagocytos är mikrober elimineras i en struktur som kallas phagolysosome, men har många sjukdomsalstrande mikrober utvecklat strategier för att undergräva mikrobicidal funktion av makrofager 5. Mångfalden av subversion mekanismer som utnyttjas av olika mikrobiella arter är ett bevis på komplexiteten i den fagocytiska processen 6 och phagolysosome biogenesis. Smittsamma sjukdomar är stora hälsoproblem, och många mekanismer och molekyler deltar i makrofag antimikrobiella aktiviteter. Vidare är de mål för den mikrobicida egenskaper som kapas av mikrober fortfarande okända, och därför finns det en eXplosion av intresse för de evolutionära, genetiska och biokemiska aspekter av värd-patogen interaktioner som har förnyade vetenskaplig uppmärksamhet rörande makrofager. För närvarande är den största delen av forskningen på området görs på makrofager cellinjer, vilka skiljer sig från primära makrofager i den fagocytiska aktiviteten, cytokiner produktionen och regleringen av den oxidativa skuren. Dessutom är de mindre lämpliga för mikroskopi. För att undersöka de samspelsmakrofager-patogener rekommenderas att använda primära makrofager, som t.ex. benmärg härledda Makrofager (BMDMs), som uppvisar flera fysiologiska funktioner. Dessutom är det möjligt att arbeta på genetiskt modifierade BMDMs, eftersom dessa makrofager kan isoleras direkt från transgena möss och, med tillgång till ny teknik som t.ex. lentiviral transfektion, deras genuttryck profil kan ändras genom gen överuttryck eller RNA-interferens. Här beskriver vi ett förfarande för att skilja murin skelett marrow in i makrofager som kommer att ge ett stort antal makrofager i 7 dagar för olika funktionella analyser såsom proteomik 7, transcriptomics 8, studerar intracellulär människohandel 9, dynamiska studier 10, genetiska skärmar (RNAi) och drog screening 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethics Uttalande
Protokollet för djurhantering godkändes av vårt institutionella Animal etikkommitté "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimentell Médico-kirurg" (CFREMC, projekttillstånd 10-300.122.013 till Eric Ghigo) från Aix-Marseille universitetet i enlighet med de regler i décret nr 87-848 av 1987/10/19. Experimenten utfördes vid Faculté de Medecine de la Timone (Experimentation tillståndets nummer 13,385 till Eric Ghigo).
1. Material och kultur Media Förberedelse
- Sterilisera två pincett, två saxar, två kirurgiska knivar, en mortel och en mortelstöt.
- Erhåll komplett DMEM innehållande 10% fetalt kalvserum (FCS), 2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin.
- Späd 10x PBS i sterilt destilleras vatten för att erhålla 1x PBS.
- Skaffa iskall 1x PBS, iskall kompletta DMEM, kompletta DMEM waRMED till 37 ° C.
2. Framställning av L929-cellsupernatanter
- Väx L929-celler till konfluens (tjugo 175 cm 2 kolvar) i komplett DMEM vid 37 ° C, 5% CO2.
Anm: granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) krävs för att framkalla hematopoetisk celldifferentiering in i makrofager 12. L929-celler producerar GM-CSF.
- Vid sammanflödet, byt odlingsmedia med färska komplett DMEM. Överför-kolvar till 32 ° C, 5% CO2 under 10 dagar.
- Samla, pool och centrifugera supernatanterna vid 750 xg under 10 min. Kassera cellpelletar.
- Store supernatanterna i 15 ml rör och förvaras vid -20 ° C.
3. Härledd från benmärg Macrophage (BMDM) Förberedelse
- Offra 1 mus genom halshuggning.
- Använd sterila kirurgiska blad under hela försöket. Desinficera huden med 70% alkoholhol. Gör ett snitt i toppen av varje bakben och dra huden ner mot foten för att exponera den muskeln.
- Klipp av bakbenen, ta bort huden med steril sax och steril pincett. Placera ben inom en steril petriskål (35/10 mm) innehållande steril iskall 1x PBS (5 ml).
- Ta ut köttet och muskler som ansluter sig till skelettet med steril sax och pincett.
- Överför de ben i en ny, steril petriskål (35/10 mm) innehållande iskall, steril 1x PBS (5 ml). Tvätta benen två gånger med 5 ml iskall, steril 1x PBS.
- Överför benet i en steril mortel innehållande 5 ml iskall, steril 1x PBS.
- Skär skenbenet från lårbenet vid leden med steril sax. Krossa benen försiktigt i en steril mortel innehållande 5 ml iskall, steril 1x PBS med användning av en mortelstöt.
- Samla upp supernatanten i iskall 15 ml rör. Upprepa detta steg 3x.
- Filtrera genom ett 70 ìm nylon cell straIner att avlägsna fasta fragment. Centrifugera filtratet vid 450 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Kassera försiktigt supernatanten. Dissociera pelleten i 10 ml av röda blodkroppar lyser buffert under 30 sek. Tillsätt 20 ml iskall, komplett DMEM.
Obs: Syftet med detta steg är att avlägsna kontaminerande röda blodkroppar, och därför måste detta steg utföras inom 2 min för att undvika hematopoetisk cell förändring av den röda blodkroppen lysbuffert.
- Centrifugera vid 450 x g under 10 min vid 4 ° C. Kassera försiktigt supernatanten. Dissociera pelleten i 20 ml fullständigt DMEM, som har värmts till 37 ° C.
- Överför de dissocierade cellerna in i två Petriskålar (100/20 mm). Inkubera dem under 4 h vid 37 ° C.
- Samla upp supernatanter i 50 ml rör vid rumstemperatur. Släng de rätter som innehåller de inhemska makrofager.
Obs: Syftet med detta steg är att eliminera den inhemska ben Marrow makrofager genom sin förmåga att hålla sig till kultur-behandlad plast. Dessa residenta makrofager kan användas i andra experiment.
- Centrifugera insamlade supernatanterna vid 450 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Kasta bort supernatanten.
- Dissociera försiktigt pelleten i 10 ml komplett DMEM innehåller 15% L929 cellsupernatant. Filtrera cellerna genom en 40 pm nylon cell sil.
- Åter filtratet. Lägg det uppsamlade filtratet (10 ml) för att 140 ml fullständigt DMEM som kompletterats med 15% L929-cell media.
- Fördela 10 ml av cellsuspensionen per petriskål (15 petriskålar, 100/20 mm). Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2.
- Odla cellerna under 3 dagar
- Tillsätt 10 ml komplett DMEM som kompletterats med 15% L929. Inkubera cellerna under ytterligare 4 dagar.
Anm: Övervaka celltillväxt periodvis med ett inverterat mikroskop (steg från 3,14 till 3,16). Vidhäftande makrofager kommer att varaobserveras efter 3 dagars odling.
4. Skörd BMDMs
- Avlägsna supernatanten. Tvätta BMDMs två gånger med fullständigt DMEM
- Tillsätt 5 ml fullständigt DMEM, som har värmts till 37 ° C. Drag BMDMs genom försiktig skrapning med en gummiskrapa.
- Samla BMDMs i 50 ml rör och centrifugera vid 450 xg under 10 min. Dissociera försiktigt cellpellets i 20 ml komplett DMEM.
- Räkna BMDMs i närvaro av trypanblått (bör inte mer än 10% dödlighet observeras).
Notera: I allmänhet är ungefär 6-7,5 x 10 7 makrofager som erhållits från 15 petriskålar (100/20 mm) av makrofager. Det finns ca 4-5 x 10 6 makrofager / petriskål (100/20 mm).
- Förbered BMDMs som krävs för försöket. Efter 16 h i fullständigt medium vid 37 ° C, 5% CO2, makrofager kommer återigen att vidhäfta till bäraren.
5. Lagra BMDMs
- Samla isolerade BMDMs (steg 4,3). Centrifugera vid 450 x g under 10 min. Anm: BMDMs kan frysas i flytande kväve.
- Återsuspendera cellpelletarna i frysmedia bestående av 10% DMSO och 90% FCS vid en slutlig koncentration av 4 x 10 6 celler / ml och pipett 1 ml i varje ampull.
- Frys cellerna vid en kylningshastighet av 1 ° C / min. Efter 24 tim, överför ampullen till en flytande kväve behållare för långtidsförvaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med denna metod var att enkelt erhålla ett stort antal makrofager i några dagar. Benmärgen cellberedningen illustreras i figur 1. Ben från bakbenet uppsamlades och krossas i en mortel. När de residenta makrofager avlägsnades från benmärgsceller framställning togs benmärgsceller inkuberades med GM-CSF (dag 0). Efter 3 dagar, cellerna, som var runda och nonadherent innan kulturen börjar att differentiera till makrofager och vidhäftar (Figur 1A). Cytometri analys med F4/80 och HLA-DR markörer visade att celler uttryckte båda markörerna som styrker att de är differentierade i makrofager (Figur 1B). Efter 7 dagar tillsattes en BMDM monoskikt erhölls med 6 till 7,5 x 10 7 BMDM / mus. Makrofager kan användas i olika typer av experiment (figur 2). De funktionella aktiviteter BMDMs kan bestämmas på olika sätt. Exempelvis BMDM phagocytossäga övervakades genom latexpärla intemalisering. Antalet kulor per cell ökade med tiden (figur 2A). BMDM endocytic potential (Figur 2B), var bakterie patogen interaktioner (figur 2C) och signalöverföringsvägar (Figur 2D) också utvärderas.
| Plats | Celltyper |
| Bone | Osteoklast |
| Benmärg | Pro-monocyt, makrofag |
| Centrala nervsystemet | Microglial cell |
| Lamina propria | Resident makrofag |
| Lever | Kupffercell |
| Lung | Alveolära makrofag |
| Perifert blod | Monocyt |
| Bukhålan | Peritoneal makrofag |
| Hud | Langerhans cell |
| Mjälte | Resident makrofag |
| Thymus | Resident makrofag |
Tabell 1. Macrophage källor i vävnader och vätskor.
Figur 1. Schematisk bild av BMDM produktion. (A) Denna figur illustrerar stegen BMDM differentiering från stamfader differentiering (dag 0) för att mogna makrofager (Dag7). (B) FACS-analys visar renheten hos isolerade celler vid dag 7 använder som makrofager markörer HLA-DR och F4/80. Klicka här för att visa storar siffra.
Figur 2. Exempel på experiment som är möjliga med BMDMs. (A) Fagocytos assay. BMDMs inkuberades under olika tidsperioder med latexpärlor och pärlor upptag observerades genom mikroskopi. (B) Intracellulär Coxiella burnetii-lipopolysackarid (LPS) lokalisering i BMDMs. LPS (i rött) lokaliserades till ett fack som hyser lysosomalt-associerat membranprotein-1 (LAMP-1) (i blått) men inte cathepsin D (i grönt). Detta experiment visar att LPS är närvarande i sena endosomer som inte kan smälta samman med lysosomer. (C) BMDMs infekterade med Tropheryma whipplei (i rött) inte var lokaliserad i utrymmet som hyser cathepsin D (i grönt). (D) Representant immunobmassa visar total (t) och fosforylerat (p) p38a MAP-kinas-nivåer i Escherichia coli-LPS-stimulerade BMDMs (1 | ig / ml). Skalstrecken representerar 5 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs häri specificerar en metod för att producera ett stort antal BMDMs. BMDM är primära celler och har den biologiska funktionen och egenskaperna hos makrofager differentierade från monocyter, därför att det är mogna, till skillnad mot makrofag-cellinjer, vilka är omogna. BMDMs kan användas för genetisk screening (RNAi), drog screening, funktionella studier, värd-patogen interaktionsstudier och många andra områden i undersökningen.
Det förfarande som presenteras häri är mycket enkel och kräver inte någon speciell utrustning, och därför kan det lätt utföras i ett laboratorium eller i klassrummet. Den här metoden kräver lite övning och fingerfärdighet. Det är också möjligt att lagra BMDMs i flytande kväve, vilket underlättar framtida experiment.
Det finns flera viktiga steg för lyckad BMDM kultur: 1) upprätthålla en steril, hälsosam kultur, 2) benmärg utvinning måste vara effektiva, 3) L929 supernatant kvalitet är kritisk; 4) att inte utsätta cellerna för att de röda blodkropparna lysbuffert under mer än 2 min för att undvika hematopoetisk cellskada.
Det är möjligt att göra vissa ändringar av protokollet, men det finns i att begränsa antalet. 1) DMEM kan ersättas av RPMI 1640, men BMDM produktion är mindre effektiva, 2) kommersiellt M-CSF (500 till 1000 Ul / ml) kan användas i stället för L929 supernatanten, men det är dyrt och M-CSF måste vara tillkommer varje 2 dagar till celler under differentieringsprocessen, 3) alternativt benmärg kan extruderas från ben med hjälp av en spruta med 25 G nål i stället för att krossa benen i en steril mortel med hjälp av en mortelstöt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga deklarerade intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av CNRS (PICS 2012-2014 till EU) och genom ett bidrag från Regione Campania (LR N.5, 28.03.2002 till Giovanna Mottola). Filippo Conti är en kamrat av vetenskapligt samarbete Foundation'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit är en kamrat av det franska ministeriet för forskning och teknik. De finansieringskällor hade ingen roll i studiedesign, datainsamling, dataanalys, beslut att publicera, eller manuskript beredning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
