Summary
巨噬细胞一直被认为是先天免疫和适应性免疫应答的重要组成部分。知识的最近的爆炸关于巨噬细胞和微生物之间的相互作用的演化，遗传和生化方面已经更新的科学关注的巨噬细胞。本文介绍了一种方法，从小鼠骨髓巨噬细胞分化。
Abstract
巨噬细胞是先天免疫和适应性免疫应答的重要组成部分，它们是抵御外来入侵者，因为他们强大的杀菌活动的第一线。巨噬细胞广泛分布在整个身体和存在于淋巴器官，肝，肺，胃肠道，中枢神经系统，骨和皮肤。因为他们的再分配，他们参与广泛的生理和病理过程。巨噬细胞是高度通用的细胞，能够识别微环境的改变和维持组织稳态。许多病原体已经进化机制，使用巨噬细胞作为木马的生存，在复制和感染人类和动物的整个身体进行传播。在宿主 - 病原体相互作用的进化，遗传和生化方面的兴趣最近的爆炸已经更新有关的巨噬细胞科学的关注。在这里，我们描述了一个程序从小鼠骨髓，将提供大量的巨噬细胞为研究宿主 - 病原体相互作用，以及其他工艺分离和培养的巨噬细胞。
Introduction
巨噬细胞功能的显著方面是其在先天免疫和适应性免疫的作用。因为它们的吞噬惰性颗粒，细菌或寄生虫的能力，巨噬细胞是抵御外来入侵者的第一道防线。一旦内化，微生物被吞噬溶酶体中降解。巨噬细胞也送招募信号和呈递抗原给其他的免疫细胞，如T淋巴细胞。巨噬细胞衍生自单核细胞。单核细胞出现在骨髓从髓样干细胞和迁移到外周血和各种组织中，其中它们分化成巨噬细胞。据估计，一个健康的成年小鼠包含分布在整个身体中各种器官和组织（ 表1）1,2，大约10 8巨噬细胞。因为他们来适应自己的微环境3,4能力的巨噬细胞显示大表型和功能的多样性。最重要的macrop哈格财产是他们的抗菌活性，这是由它们的能力定义吞噬微生物并摧毁他们。吞噬反应是由是由微生物接触刺激复杂信号网络的激活所定义，因此，巨噬细胞响应各种刺激适当地调节基因表达。吞噬后，微生物在一个叫做吞噬溶酶体结构消除了，但是，许多病原微生物开发战略，颠覆巨噬细胞5的杀菌功能。由不同的微生物物种所利用的颠覆机制的多样性是证明了吞噬6过程的复杂性和吞噬溶酶体的生物合成。传染病是人类主要的健康问题，以及众多的机制和分子参与巨噬细胞的抗菌活性。此外，是由微生物劫持的杀菌性能的目标依然是未知，因此，有一个电子xplosion中的宿主 - 病原体相互作用的进化，遗传和生化方面已经就续约巨噬细胞科学的关注兴趣。目前，大部分的研究领域是做对巨噬细胞的细胞系，其中从初级巨噬细胞的吞噬活性，细胞因子产生和氧化爆发的调控有所不同。此外，它们更适合于显微镜。为了研究巨噬细胞的相互作用，其病原体是推荐使用初级巨噬细胞，如骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），它表现出多种生理功能。此外，它可以工作在转基因BMDMs，因为这些巨噬细胞可能直接从转基因小鼠中分离出来，并与新颖的技术，如慢病毒转染的可用性，它们的基因表达图谱可以通过基因过表达或RNA干扰而改变。在这里，我们描述了一个程序来区分小鼠骨髓米箭头为巨噬细胞，将提供大量的巨噬细胞在7天为各种功能分析，如7蛋白质组学，转录8，细胞内运输研究9，动态研究10，遗传筛选（RNAi）技术和药物筛选11。
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Protocol
操守准则
该协议为动物处理批准了我们的机构动物伦理委员会“行政法院科学研究都中心去形成等德RECHERCHE实验医学 - Chirurgical”（CFREMC，项目许可证10-300122013埃里克GHIGO）从埃克斯 - 马赛大学符合规则的DécretN°的1987年10月19日87-848。该实验是在Faculté德MEDECINE德拉蒂莫（实验许可证号13.385埃里克GHIGO）执行。
1。物质与文化媒体准备
- 消毒2钳子，剪刀2，2手术刀，用研钵和研杵。
- 得到含有10％胎牛血清（FCS），2mM谷氨酰胺，100 U / ml青霉素和100微克/毫升链霉素的完全DMEM。
- 稀释10倍的PBS在无菌馏水中得到的1X PBS。
- 获得冰冷的1X PBS，冰冷的完全DMEM，完全DMEM娃RMED至37°C。
2。的L929细胞上清液的制备
- 成长L929细胞，在37℃至汇合（20175厘米2烧瓶）在完全DMEM，5％的CO 2。
注意：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）来诱导造血细胞分化成巨噬细胞12。 L929细胞产生GM-CSF。
- 在汇合，用新鲜完全DMEM更换培养基。瓶转移至32℃，5％CO2 10天。
- 收集，游泳池和离心的上清液在750×g离心10分钟。丢弃细胞沉淀。
- 在15ml试管和储存在-20°C店上清液
3。骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）准备
- 牺牲1小鼠颈椎脱臼。
- 用无菌手术刀在整个实验。消毒用70％的资产负债管理委员会的皮肤HOL。做一个切口在每个后腿的顶部和拉扯皮肤向下朝向脚露出肌肉。
- 切断后腿，取出用无菌剪刀和无菌镊子皮肤。内含有无菌的，冰冷的1×PBS（5ml）中的无菌培养皿中（35 / 10mm）的放置的腿。
- 除去果肉及肌肉都秉承了骨头，用无菌剪刀和镊子。
- 转移到骨头含有冰冷无菌的1×PBS（5ml）的一个新的无菌培养皿中（35/10毫米）。用5毫升冰冷的无菌1×PBS中洗骨头2倍。
- 转移到骨含有5毫升冰冷的无菌的1×PBS的无菌研钵。
- 从股骨切开胫骨处用无菌剪刀关节。在含有5毫升冰冷的无菌1×PBS中利用杵无菌研钵轻轻粉碎骨头。
- 收集在冰冷的15ml试管上清液。重复此步骤3次。
- 通过70微米尼龙细胞过滤STRA核研所，除去固体碎片。离心滤液在450×g离心10分钟，在4℃下
- 轻轻弃上清。分离沉淀在10ml红细胞裂解缓冲液，持续30秒。加20毫升的冰冷，完全DMEM。
注意：该步骤的目的是为了除去污染的红细胞，因此，该步骤必须在2分钟内进行，以避免造血细胞改变的红细胞裂解缓冲液。
- 离心机在450×g离心10分钟，在4℃下轻轻弃上清。分离的沉淀物在20ml完全DMEM，已加热到37℃。
- 转移分离的细胞分成2培养皿（100/20毫米）。在37°C孵育他们4小时
- 收集上清液在50ml试管在室温下。丢弃包含居民的巨噬细胞的菜肴。
注意：该步骤的目的是为了消除驻地骨MARRO瓦特巨噬细胞由他们坚持培养处理的塑料的能力。这些常驻的巨噬细胞可在其它实验中使用。
- 离心收集上清液，在450×g离心10分钟，在4℃下弃上清。
- 轻轻分离沉淀在10毫升含有15％的L929细胞上清液完全DMEM。通过一个40微米的尼龙细胞滤网过滤细胞。
- 回收滤液。添加所收集的滤液（10毫升）中，以140毫升已补充了15％的L929细胞培养基完全DMEM。
- 分发10毫升每培养皿（15培养皿中，100/20毫米）的细胞悬浮液。孵育的细胞在37℃，5％CO 2。
- 生长细胞3天
- 加入10 mL已补充了15％的L929完全DMEM。孵育细胞4额外的天数。
注：定期监测细胞的生长与倒置显微镜（步骤3.14-3.16）。贴壁的巨噬细胞会后培养3天观察到。
4。收获BMDMs
- 除去上清液。用完全DMEM洗BMDMs 2倍
- 加入5 ml已被加热到37℃。完全DMEM通过用橡皮警察轻轻一刮分离BMDMs。
- 在450×g离心10分钟收集BMDMs在50ml试管并离心。轻轻地解离的细胞沉淀在20ml完全DMEM。
- 计数BMDMs在台盼蓝的存在（不超过10％的死亡率，应观察到的）。
注：一般情况下，约6-7.5×10 7巨噬细胞巨噬细胞的15培养皿（100/20毫米）获得。大约有4-5×10 6的巨噬细胞/培养皿（100/20毫米）。
- 按要求准备实验BMDMs。 16小时在完全培养基中，在37℃后，5％CO 2，巨噬细胞会再次附着到载体上。
5。存储BMDMs
- 收集分离BMDMs（步骤4.3）。离心机在450×g离心10分钟。注意：BMDMs可以在液氮中冷冻。
- 重悬细胞沉淀在冷冻培养基由10％DMSO和90％FCS中的4×10 6个细胞/ ml和吸管1毫升到每个安瓿的最终浓度。
- 冷冻的细胞以1℃/ min的冷却速率。 24小时后，将安瓿转移到长期存储液氮容器。
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Representative Results
该方法的目的是为了容易地得到大量的巨噬细胞中几天。骨髓细胞的制备示于图1。从后腿骨头收集砸在研钵。一旦定居巨噬细胞是从骨髓细胞去除制剂，骨髓细胞与GM-CSF（第0天）。 3天后，细胞，它呈圆形和非贴壁培养前，开始分化成巨噬细胞和坚持（ 图1A）。流式细胞术分析使用F4/80和HLA-DR的标记显示，细胞表达两种标记从而证明它们分化 成巨噬细胞（ 图1B）。 7天后，用6-7.5×10 7 BMDM /鼠标获得BMDM单层。巨噬细胞可在不同类型的实验（ 图2）可以使用。该BMDMs的功能活动可能以不同的方式来确定。例如，BMDM phagocytos就是由乳胶珠内化监控。每个细胞珠的数量随时间增加（ 图2A）。 BMDM内吞潜力（ 图2B），细菌性病原体相互作用（ 图2C）和信号转导通路（ 图2D）也进行了评估。
| 位置 | 细胞类型 |
| 骨 | 破骨细胞 |
| 骨髓 | 亲单核细胞，巨噬细胞 |
| 中枢神经系统 | 小胶质细胞 |
| 固有层 | 居民巨噬细胞 |
| 肝脏 | 枯否细胞 |
| 肺 | 肺泡巨噬细胞 |
| 外周血 | 单核细胞 |
| 腹膜腔 | 腹腔巨噬细胞 |
| 皮肤 | 朗格汉斯细胞 |
| 脾 | 居民巨噬细胞 |
| 胸腺 | 居民巨噬细胞 |
表1。巨噬细胞来源的组织和体液。
图1。 BMDM生产的示意图。（a）本图显示的步骤BMDM分化的祖细胞分化（0天），以成熟的巨噬细胞（第7天）。 （ 二）流式细胞仪分析显示分离出的细胞在第7天用巨噬细胞标记物HLA-DR和F4/80的纯洁性。 点击这里查看大R图。
图2。实验是可能的BMDMs实例 （ 一 ）吞噬试验。 BMDMs孵育与乳胶珠不同的时间段，并且珠摄取观察用显微镜。 （二）细胞内贝氏柯克斯体脂多糖（LPS）本地化BMDMs。脂多糖（红色）定位于该窝藏溶酶体相关膜蛋白-1（LAMP-1）的隔室（蓝色），但不组织蛋白酶D（绿色）。该实验表明，内毒素是存在于晚期内涵体是无法融合与溶酶体。 （ 三）感染Tropheryma whipplei（红色）BMDMs未在隔间怀有组织蛋白酶D本地化（绿色）。 （四）代表immunob很多展示总（t）和磷酸化（P）p38α的MAP激酶水平在大肠杆菌 LPS刺激BMDMs（1微克/毫升）。标尺代表5微米。
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Discussion
本文所述的协议细节的方法来产生大量的BMDMs的。 BMDM是原代细胞和有生物功能的巨噬细胞和单核细胞分化的性能，因为有成熟，而相比之下，巨噬细胞的细胞系，这是不成熟。 BMDMs可用于遗传筛查（RNAi）技术，药物筛选，功能研究，宿主 - 病原体相互作用的研究和调查等诸多领域。
本文中所呈现的过程是很简单的，并且不需要任何特殊的设备，因此，它可以很容易地在实验室或教室进行。这种方法需要一些练习和手巧。另外，也可以以存储BMDMs在液氮中，从而有利于以后的实验。
有成功的BMDM文化的几个关键步骤：1）保持无菌，健康的文化; 2）骨髓提取必须是有效的; 3）L929燮ernatant质量是至关重要的; 4）不暴露细胞的红细胞裂解缓冲液超过2分钟，以避免造血细胞的损伤。
它是可以做到的协议作出一些修改，但也有在限制次数。 1）的DMEM可通过RPMI 1640代替，但BMDM生产效率较低，2）商业M-CSF（500-1000 UI /毫升）可以用来代替L929上清，但它是昂贵的和M-CSF必须在分化过程中加入，每2天给细胞; 3）可替换地骨髓可以从骨用装有25号针头，而不是使用一个杵粉碎骨头在无菌研钵注射器挤出。
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Disclosures
有没有申报利益冲突。
Acknowledgments
这项工作是由法国国家科学研究中心（PICS 2012-2014 EG）和由REGIONE坎帕尼亚（LR N.5，2002年3月28日至乔凡娜莫托拉）的资助。菲利波·孔蒂是科学合作基金会'' Infectiopole南德意志集团的资深会员。''尼古拉Boucherit是法国教育部研究和技术的资深会员。资金来源有在研究设计，数据收集，数据分析，发布的决定，或手稿的准备没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
