Summary
I macrofagi sono da tempo riconosciuti come una componente critica delle risposte immunitarie innate e adattative. La recente esplosione di conoscenze relative agli aspetti evolutivi, genetici e biochimici dell'interazione tra macrofagi e microbi ha rinnovato l'attenzione scientifica ai macrofagi. Questo articolo descrive un metodo per differenziare macrofagi da midollo osseo di topo.
Abstract
I macrofagi sono componenti critici delle risposte immunitarie innate e adattative, e sono la prima linea di difesa contro gli invasori stranieri a causa delle loro potenti attività microbicida. I macrofagi sono ampiamente distribuiti in tutto il corpo e sono presenti negli organi linfoidi, fegato, polmoni, tratto gastrointestinale, sistema nervoso centrale, le ossa e la pelle. A causa della loro ripartizione, partecipano in un'ampia gamma di processi fisiologici e patologici. I macrofagi sono cellule altamente versatile in grado di riconoscere alterazioni microambientali e per mantenere l'omeostasi tissutale. Numerosi agenti patogeni si sono evoluti meccanismi per utilizzare i macrofagi come cavalli di Troia per sopravvivere, replicarsi in, e infettare sia gli esseri umani e gli animali e per diffondere in tutto il corpo. La recente esplosione di interesse per gli aspetti evolutivi, genetici e biochimici delle interazioni ospite-patogeno ha rinnovato l'attenzione scientifiche per quanto riguarda i macrofagi. Qui, descriviamo unprocedura per isolare e coltivare macrofagi da midollo osseo murino che fornirà un gran numero di macrofagi per studiare le interazioni ospite-patogeno nonché altri processi.
Introduction
Un aspetto significativo della funzione dei macrofagi è il loro ruolo nella immunità innata e adattativa. A causa della loro capacità di fagocitare particelle inerti, batteri o parassiti, i macrofagi sono una prima linea di difesa contro gli invasori stranieri. Una volta interiorizzato, i microbi sono degradati all'interno phagolysosomes. I macrofagi anche inviare segnali di reclutamento per e gli antigeni presenti di altre cellule immunitarie come i linfociti T. I macrofagi sono derivati da monociti. Monociti sorgono nel midollo osseo da cellule staminali mieloidi e migrano sangue periferico e vari tessuti dove si differenziano in macrofagi. Si stima che un topo adulto sana contiene circa 10 8 macrofagi che sono distribuiti in tutto il corpo in vari organi e tessuti (Tabella 1) 1,2. I macrofagi mostrano grande fenotipica e diversità funzionale a causa della loro capacità di adattarsi al loro 3,4 microambiente. Il MACROP più importantestruttura hage è la loro attività microbicida, che è definito dalla capacità di fagocitare i microbi e distruggerli. La risposta fagocitaria è definita mediante l'attivazione di reti di segnalazione complesse che vengono stimolati dal contatto microbica, quindi, macrofagi modulano l'espressione genica in modo appropriato in risposta a diversi stimoli. Dopo la fagocitosi, i microbi vengono eliminati in una struttura chiamata fagolisosoma, tuttavia, molti microbi patogeni hanno sviluppato strategie per sovvertire la funzione microbicida dei macrofagi 5. La diversità dei meccanismi di sovversione che sono utilizzati da diverse specie microbiche è un testamento alla complessità del processo di fagocitosi 6 e fagolisosoma biogenesi. Le malattie infettive sono i principali problemi di salute umana, e numerosi meccanismi e molecole partecipano alle attività antimicrobiche macrofagi. Inoltre, gli obiettivi delle proprietà microbicida che vengono dirottati da microbi rimangono sconosciute, quindi, vi è una notificaxplosion di interesse per gli aspetti evolutivi, genetici e biochimici delle interazioni ospite-patogeno che ha rinnovato l'attenzione scientifiche per quanto riguarda i macrofagi. Attualmente, la maggior parte della ricerca nel campo viene fatta su macrofagi linee cellulari, che differiscono da macrofagi primari dell'attività fagocitaria, la produzione di citochine e la regolazione del burst ossidativo. Inoltre, sono meno adatti per microscopia. Per studiare l'interazione macrofagi-agenti patogeni si consiglia di utilizzare i macrofagi primari, come il midollo osseo macrofagi derivati (BMDMs), che presentano caratteristiche più fisiologiche. Inoltre, è possibile lavorare su BMDMs geneticamente modificati, perché questi macrofagi possono essere isolati direttamente da topi transgenici e, con la disponibilità di nuove tecnologie come transfezione lentivirale, il loro profilo di espressione genica può essere alterato da sovraespressione del gene o RNA interferenza. Qui, si descrive un procedimento per differenziare murino osso mfreccia in macrofagi che forniranno un gran numero di macrofagi in 7 giorni per varie analisi funzionale, come la proteomica 7, trascrittomica 8, traffico intracellulare studia 9, studi dinamici 10, schermi genetiche (RNAi) e lo screening di stupefacenti 11.
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Protocol
Dichiarazione Etica
Il protocollo per la gestione degli animali è stato approvato dal nostro Comitato Etico istituzionale Animal "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Sperimentale Médico-Chirurgical" (CFREMC, permesso Progetto 10-300.122.013 a Eric Ghigo) da Aix-Marseille University in accordo con le regole di Décret N ° 87-848 del 1987/10/19. Gli esperimenti sono stati condotti presso la Faculté de Médecine de la Timone (permesso Sperimentazione numero 13,385 a Eric Ghigo).
1. Materiali e Culture Media Preparazione
- Sterilizzare due pinze, due forbici, due lame chirurgiche, un mortaio e un pestello.
- Ottenere DMEM completo contenente 10% di siero fetale bovino (FCS), glutammina 2 mM, 100 U / ml di penicillina e 100 pg / ml streptomicina.
- Diluire 10x PBS in acqua distillata sterile per ottenere 1x PBS.
- Ottenere ghiacciata 1x PBS, DMEM completo ghiacciata, completi wa DMEMrmed a 37 ° C.
2. Preparazione di L929 surnatanti cellulari
- Crescere cellule L929 a confluenza (venti 175 centimetri 2 beute) in DMEM completo a 37 ° C, 5% CO 2.
Nota: granulociti-macrofagi colonie factor (GM-CSF), stimola è necessario per indurre la differenziazione delle cellule ematopoietiche in macrofagi 12. L929 cellule producono GM-CSF.
- Alla confluenza, sostituire coltura con DMEM fresco completo. Trasferire beute a 32 ° C, 5% CO 2 per 10 giorni.
- Raccogliere, piscina e centrifugare il surnatante a 750 xg per 10 min. Gettare pellet cellulari.
- Conservare surnatanti in provette da 15 ml e conservare a -20 ° C.
3. Derivate dal midollo osseo macrofagi (BMDM) Preparazione
- Sacrifica 1 mouse dislocazione cervicale.
- Utilizzare lame chirurgiche sterili tutto l'esperimento. Disinfettare la pelle con il 70% AlcoHol. Fare un'incisione nella parte superiore di entrambe le zampe posteriori e tirare la pelle verso il piede per esporre il muscolo.
- Tagliare le zampe posteriori, togliere la pelle con le forbici sterili e pinze sterili. Posizionare gambe di un piastra di Petri sterile (35/10 mm) contenente sterile, ghiacciata PBS 1x (5 ml).
- Togliere la carne e muscoli che sono aderente alle ossa con le forbici sterili e pinze.
- Trasferire le ossa in una nuova piastra di Petri sterile (35/10 mm) contenente ghiacciata, sterile PBS 1x (5 ml). Lavare le ossa due volte con 5 ml ghiacciata, sterile PBS 1x.
- Trasferire l'osso in un mortaio sterile contenente 5 ml ghiacciata, sterile PBS 1x.
- Tagliare la tibia dal femore alla giuntura con forbici sterili. Rompete le ossa dolcemente in un mortaio sterile contenente 5 ml di ghiacciata, sterile 1x PBS utilizzando un pestello.
- Raccogliere il surnatante in provette da 15 ml ghiacciate. Ripetere questa operazione 3 volte.
- Filtrare attraverso un 70 micron stra cellulare Nyloniner per rimuovere i frammenti solidi. Centrifugare il filtrato a 450 xg per 10 min a 4 ° C.
- Eliminare delicatamente il surnatante. Dissociare il pellet in 10 ml di tampone di lisi dei globuli rossi per 30 sec. Aggiungere 20 ml ghiacciata, DMEM completo.
Nota: Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere contaminanti globuli rossi, quindi, questa operazione deve essere eseguita entro 2 minuti per evitare alterazioni delle cellule ematopoietiche dal buffer sangue rosso lisi cellulare.
- Centrifugare a 450 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare delicatamente il surnatante. Dissociare il pellet in 20 ml di DMEM completo che è stato riscaldato a 37 ° C.
- Trasferire le cellule dissociate in 2 piastre di Petri (100/20 mm). Incubare per 4 ore a 37 ° C.
- Raccogliere i surnatanti in 50 ml provette a temperatura ambiente. Eliminare i piatti che contengono i macrofagi residenti.
Nota: L'obiettivo di questa fase è quello di eliminare il Marro osso residentemacrofagi w per la loro capacità di aderire alla plastica coltura trattata. Questi macrofagi residenti possono essere utilizzati in altri esperimenti.
- Centrifugare i surnatanti raccolti a 450 xg per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Dissociare delicatamente il pellet in 10 ml di DMEM completo contenente il 15% L929 surnatante cellulare. Filtrare le cellule attraverso un filtro di 40 micron cella in nylon.
- Recuperare il filtrato. Aggiungere il filtrato raccolto (10 ml) a 140 ml di DMEM completo che è stato integrato con il 15% delle cellule L929 supporti.
- Distribuire 10 ml di sospensione cellulare per Petri dish (15 capsule di Petri, 100/20 mm). Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2.
- Crescere cellule per 3 giorni
- Aggiungere 10 ml di DMEM completo che è stato supplementato con 15% L929. Incubare le cellule per 4 giorni aggiuntivi.
Nota: Controllare la crescita delle cellule periodicamente con un microscopio invertito (passi 3,14-3,16). Macrofagi aderenti sarannoosservata dopo 3 giorni di coltura.
4. BMDMs di raccolta
- Rimuovere il surnatante. Lavare BMDMs 2 volte con DMEM completo
- Aggiungere 5 ml DMEM completo che è stata scaldato a 37 ° C. Staccare BMDMs raschiando delicatamente con un poliziotto di gomma.
- Raccogliere BMDMs in provette da 50 ml e centrifugare a 450 xg per 10 min. Dissociare delicatamente pellet cellulari in 20 ml di DMEM completo.
- Contare BMDMs in presenza di blu tripano (senza mortalità superiore al 10% deve osservare).
Nota: Generalmente, circa 6-7,5 x 10 7 macrofagi sono ottenuti da 15 piastre di Petri (100/20 mm) dei macrofagi. Ci sono circa 4-5 x 10 6 / macrofagi capsula di Petri (100/20 mm).
- Preparare BMDMs come richiesto per l'esperimento. Dopo 16 ore in completo supporto a 37 ° C, 5% CO 2, macrofagi sarà nuovamente aderire al supporto.
5. Memorizzazione BMDMs
- Raccogliere BMDMs isolate (passo 4,3). Centrifugare a 450 xg per 10 min. Nota: BMDMs possono essere congelati in azoto liquido.
- Risospendere pellet cellulari in congelamento supporto costituito da 10% DMSO e 90% FCS ad una concentrazione finale di 4 x 10 6 cellule / ml e pipetta 1 ml in ciascuna fiala.
- Congelare le cellule ad una velocità di raffreddamento di 1 ° C / min. Dopo 24 ore, trasferire la fiala ad un contenitore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
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Representative Results
Lo scopo di questo metodo era di ottenere facilmente un gran numero di macrofagi in pochi giorni. La preparazione di cellule di midollo osseo è illustrato in Figura 1. Le ossa della zampa posteriore sono stati raccolti e fracassato in un mortaio. Una volta che i macrofagi residenti sono stati rimossi dalla preparazione di cellule di midollo osseo, cellule del midollo osseo sono state incubate con GM-CSF (giorno 0). Dopo 3 giorni, le cellule, che erano intorno e nonadherent prima cultura, iniziano a differenziarsi in macrofagi e aderire (Figura 1A). Citometria analisi utilizzando F4/80 e marcatori HLA-DR ha rivelato che le cellule hanno espresso entrambi i marcatori dimostrando così che essi si differenziano in macrofagi (Figura 1B). Dopo 7 giorni, un monostrato BMDM stato ottenuto con 6-7.5 x 10 7 BMDM / mouse. I macrofagi possono essere utilizzati in diversi tipi di esperimenti (Figura 2). Le attività funzionali del BMDMs possono essere determinati in modi diversi. Per esempio, phagocytos BMDMIS è stato monitorato da lattice tallone internalizzazione. Il numero di perline per cella aumentata nel tempo (Figura 2A). BMDM potenziale endocitica (Figura 2B), sono stati valutati anche patogeno batterico (Figura 2C) e trasduzione del segnale (Figura 2D).
| Posizione | Tipi di cellule |
| Osso | Osteoclasti |
| Midollo osseo | Pro-monociti, macrofagi |
| Sistema nervoso centrale | Cellule microgliali |
| Lamina propria | Macrofagi Resident |
| Fegato | Cellule Kupffer |
| Polmone | Macrofagi alveolari |
| Sangue periferico | Monocita |
| Cavità peritoneale | Macrofagi peritoneali |
| Pelle | Cellule di Langerhans |
| Milza | Macrofagi Resident |
| Timo | Macrofagi Resident |
Tabella 1. Fonti macrofagi nei tessuti e fluidi.
Figura 1. Rappresentazione schematica della produzione BMDM. (A) Questa figura illustra le fasi di BMDM differenziazione da differenziazione capostipite (giorno 0) per maturare macrofagi (Day7). (B) analisi FACS illustra la purezza delle cellule isolate al giorno 7 utilizzando come macrofagi marcatori HLA-DR e F4/80. Clicca qui per vederer figura.
Figura 2. Esempi di esperimenti che sono possibili con BMDMs. (A) saggio fagocitosi. BMDMs sono state incubate per diversi periodi di tempo con perle di lattice, e perlina assorbimento è stata osservata al microscopio. (B) intracellulare Coxiella burnetii lipopolisaccaride (LPS) localizzazione in BMDMs. LPS (in rosso) è stato localizzato ad un vano che ospita membrana lisosomiale associata proteina-1 (LAMP-1) (in blu), ma non catepsina D (in verde). Questo esperimento dimostra che LPS è presente in endosomi tardivi che sono in grado di fondersi con i lisosomi. (C) BMDMs infettati con Tropheryma whipplei (in rosso) non è stata localizzata nel vano che ospita catepsina D (in verde). (D) immunob Rappresentantelotto dimostrando totale (t) e fosforilato (p) p38α livelli MAP chinasi in Escherichia coli BMDMs LPS-stimolate (1 mg / ml). Barre di scala rappresentano il 5 micron.
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Discussion
Il protocollo qui descritto dettaglia un metodo per produrre un gran numero di BMDMs. BMDM sono cellule primarie e hanno la funzione e le proprietà dei macrofagi differenziati da monociti biologico perché ci sono maturo, in contrasto con linee cellulari di macrofagi, che sono immaturi. BMDMs possono essere utilizzati per lo screening genetico (RNAi), screening di farmaci, studi funzionali, studi di interazione ospite-patogeno e molte altre aree di indagine.
La procedura qui presentata è molto semplice e non richiede attrezzature specializzate, pertanto, può essere facilmente eseguita in un laboratorio o in classe. Questo metodo richiede una certa pratica e destrezza manuale. È anche possibile memorizzare le BMDMs in azoto liquido, facilitando così esperimenti futuri.
Ci sono diversi passaggi critici per la cultura BMDM successo: 1) il mantenimento di un sterile, sana cultura; 2) l'estrazione del midollo osseo deve essere efficiente, 3) L929 supqualità ernatant è critico; 4) non esporre le cellule nel buffer di rosso sangue lisi cellulare per più di 2 minuti per evitare danni alle cellule ematopoietiche.
E 'possibile fare qualche modifica del protocollo ma ci sono in numero limitante. 1) DMEM può essere sostituito da RPMI 1640, ma la produzione BMDM è meno efficiente; 2) commerciale M-CSF (500-1000 UI / ml) può essere usata al posto di L929 supernatante, ma è costoso e M-CSF deve essere aggiunti ogni 2 giorni per cellule durante il processo di differenziazione, 3) in alternativa midollo osseo può essere estruso da osso utilizzando una siringa dotata di ago G 25 invece di distruggere le ossa in un mortaio sterile utilizzando un pestello.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal CNRS (PICS 2012-2014 a EG), e da una sovvenzione della Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 a Giovanna Mottola). Filippo Conti è un collega della Cooperazione Scientifica Fondazione'' Infectiopole Sud''. Nicola Boucherit è un collega del Ministero francese per la Ricerca e la Tecnologia. Le fonti di finanziamento hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati, analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
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