Summary
Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.
Abstract
Os macrófagos são componentes críticos das respostas imune inata e adaptativa, e eles são a primeira linha de defesa contra invasores estrangeiros por causa de suas poderosas atividades microbicidas. Os macrófagos são amplamente distribuído por todo o corpo e estão presentes nos órgãos linfóides, fígado, pulmões, tracto gastrointestinal, sistema nervoso central, ossos e pele. Por causa da sua repartição, que participam numa vasta gama de processos fisiológicos e patológicos. Os macrófagos são células altamente versáteis que são capazes de reconhecer alterações do microambiente e para manter a homeostase do tecido. Numerosos agentes patogénicos desenvolveram mecanismos para usar macrófagos como cavalos de Tróia para sobreviver, replicam em, e infectam os seres humanos e animais e para propagar ao longo do corpo. A recente explosão de interesse em aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos de interação patógeno-hospedeiro renovou atenção científica sobre macrófagos. Aqui, descrevemos umProcesso para isolar e cultivar macrófagos de medula óssea de murino que irá proporcionar um grande número de macrófagos para estudar interacções hospedeiro de organismos patogénicos, assim como outros processos.
Introduction
Um aspecto importante da função dos macrófagos é o seu papel na imunidade inata e adaptativa. Devido à sua capacidade de fagocitar partículas inertes, bactérias ou parasitas, os macrófagos são a primeira linha de defesa contra os invasores externos. Uma vez internalizado, micróbios são degradados dentro de fagolisossomas. Os macrófagos também enviam sinais de recrutamento para e antígenos presentes a outras células do sistema imunológico, como os linfócitos T. Os macrófagos são derivados dos monócitos. Os monócitos surgem na medula óssea a partir de células-tronco mielóides e migrar para o sangue periférico e vários tecidos, onde eles diferenciam-se em macrófagos. Estima-se que um rato adulto saudável contém aproximadamente 10 8 macrófagos que são distribuídos ao longo do corpo em vários órgãos e tecidos (Tabela 1) 1,2. Os macrófagos exibem grande diversidade fenotípica e funcional por causa de sua capacidade de se adaptar ao seu microambiente 3,4. O mais importante macrophage propriedade é a sua actividade microbicida, a qual é definida pela sua capacidade de fagocitose de micróbios e as destroem. A resposta fagocítica está definido pela activação de redes de sinalização complexas que são estimulados por contacto microbiana, assim, para modular a expressão de genes de macrófagos de forma apropriada em resposta a diversos estímulos. Após a fagocitose, os micróbios são eliminados em uma estrutura chamada fagolisossomo, no entanto, muitos micróbios patogénicos têm desenvolvido estratégias para subverter a função microbicida dos macrófagos 5. A diversidade de mecanismos de subversão que são utilizadas por diferentes espécies microbianas é uma prova da complexidade do processo de fagocitose 6 e fagolisossomo biogênese. As doenças infecciosas são os principais problemas de saúde humana, e vários mecanismos e moléculas de participar de atividades antimicrobianas de macrófagos. Além disso, os alvos das propriedades microbicidas que são sequestradas por micróbios permanecem desconhecidos, assim, existe uma mensagemxplosion de interesse nos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos de interação patógeno-hospedeiro, que renovou a atenção científica sobre macrófagos. Atualmente, a maioria das pesquisas no campo é feito em macrófagos linhagens celulares, que diferem de macrófagos primários na atividade fagocitária, a produção de citocinas e da regulação do burst oxidativo. Além disso, eles são menos adequados para microscopia. Investigar a interação macrófagos-patógenos é recomendado o uso de macrófagos primários, tais como medula macrófagos derivados (BMDMs), que apresentam características mais fisiológicas. Além disso, é possível trabalhar em BMDMs geneticamente modificados, porque estes macrófagos pode ser isolado directamente a partir de ratinhos transgénicos e, com a disponibilidade de novas tecnologias, tais como a transfecção lentiviral, o perfil de expressão do gene podem ser alterados por sobre-expressão do gene ou ARN de interferência. Aqui, descrevemos um procedimento para diferenciar murino osso marrow em macrófagos que irão proporcionar um grande número de macrófagos em 7 dias para várias análises funcionais, como a proteômica 7, 8 transcriptômica, tráfico intracelular estuda 9, estudos dinâmicos 10, telas genéticos (RNAi) e triagem de drogas 11.
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Protocol
Declaração de Ética
O protocolo para manejo dos animais foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional nosso Animal "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimental Médico-Cirúrgica" (CFREMC, licença Projeto 10-300122013 para Eric Ghigo) da Universidade de Aix-Marseille de acordo com as regras Décret de N ° 87-848 de 1987/10/19. Os experimentos foram realizados na Faculté de Médecine de la Timone (número de autorização Experimentação 13,385 para Eric Ghigo).
1. Material e Meios de Cultura Preparação
- Esterilizar duas pinças, duas tesouras, duas lâminas cirúrgicas, um almofariz e um pilão.
- Obter DMEM completo contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 2 mM de glutamina, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina.
- Diluir 10x PBS em água destilada estéril para obter 1x PBS.
- Obter gelada PBS 1x, gelada DMEM completo, wa DMEM completormed a 37 ° C.
2. Preparação de sobrenadantes de células L929
- Crescer as células L929 até à confluência (vinte e dois frascos de 175 centímetros) em DMEM completo a 37 ° C, 5% de CO 2.
Nota: granulócitos-macrófagos colónia factor (GM-CSF) estimulante é necessária para induzir a diferenciação de células hematopoiéticas em macrófagos 12. L929 células produzem GM-CSF.
- Na confluência, substituir meios de cultura com DMEM completo fresco. Transferir para frascos de 32 ° C, 5% de CO 2 durante 10 dias.
- Coletar, piscina e centrifugar o sobrenadante a 750 g durante 10 min. Descartar sedimentos celulares.
- Sobrenadantes Armazene em tubos de 15 ml e armazenar a -20 ° C.
3. Bone Marrow-derivado do macrófago (BMDM) Preparação
- Sacrifique um rato por deslocamento cervical.
- Use lâminas cirúrgicas estéreis durante todo o experimento. Desinfetar a pele com 70% alcohol. Realizar uma incisão na parte superior de cada perna traseira e puxe a pele para baixo em direcção ao pé para expor o músculo.
- Corte as pernas traseiras, retire a pele com uma tesoura estéril e pinças esterilizadas. Coloque as pernas numa placa de Petri estéril (35/10 mm) contendo estéril gelada 1x PBS (5 ml).
- Retire a carne e músculos que estão aderindo aos ossos com tesouras e pinças esterilizadas.
- Transfira os ossos para uma nova placa de Petri estéril (35/10 mm) contendo gelado, estéril 1x PBS (5 ml). Lave os ossos duas vezes com 5 ml de gelado, estéril PBS 1x.
- Transferir o osso em um almofariz estéril contendo 5 ml de gelado, estéril PBS 1x.
- Corte a tíbia do fêmur na articulação com tesoura esterilizada. Esmagar os ossos suavemente num almofariz estéril contendo 5 ml de gelado, estéril 1x PBS utilizando um pilão.
- Recolhe-se o sobrenadante em tubos de 15 ml de gelo-frio. Repita este passo 3x.
- Filtrar com um 70 um stra célula NylonIner para remover fragmentos sólidos. Centrifuga-se o filtrado a 450 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Delicadamente, desprezar o sobrenadante. Dissociar o sedimento em 10 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos para 30 seg. Adicionar 20 ml de gelado, DMEM completo.
Nota: O objectivo deste passo é o de remover contaminantes de células vermelhas do sangue, portanto, este passo deve ser realizado no prazo de 2 minutos, para evitar a alteração de células hematopoiéticas por o tampão de lise de glóbulos vermelhos.
- Centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Delicadamente, desprezar o sobrenadante. Dissociar o sedimento em 20 ml de DMEM completo que foi aquecido a 37 ° C.
- Transferir as células dissociadas em duas placas de Petri (100/20 mm). Incubar durante 4 horas a 37 ° C.
- Recolhe-se os sobrenadantes em tubos de 50 ml à temperatura ambiente. Rejeitar os pratos que contêm os macrófagos residentes.
Nota: O objetivo deste passo é eliminar o marro osso residentemacrófagos w por sua capacidade de aderir ao plástico tratados com cultura. Estes macrófagos residentes podem ser usados em outras experiências.
- Centrifugar os sobrenadantes recolhidos a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Dissociar suavemente o sedimento em 10 ml de DMEM completo contendo 15% de sobrenadante de células L929. Filtrar as células através de um coador de células de 40 mM de nylon.
- Recuperar o filtrado. Adicionar o filtrado recolhido (10 ml) a 140 ml de DMEM completo que foi suplementado com 15% de meios de células L929.
- Distribuir 10 ml da suspensão de células por placa de Petri (15 placas de Petri, 100/20 mm). Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Crescer as células durante 3 dias
- Adicionar 10 ml de DMEM completo que foi suplementado com 15% L929. Incubar as células durante 4 dias adicionais.
Nota: Monitorar periodicamente o crescimento de células com um microscópio invertido (passos 3,14-3,16). Macrófagos aderentes seráobservado após 3 dias de cultura.
4. BMDMs Colheita
- Remover o sobrenadante. Lavar BMDMs 2 vezes com DMEM completo
- Adicionar 5 ml de DMEM completo que foi aquecido a 37 ° C. Retire BMDMs raspando suavemente com um policial de borracha.
- Recolhe BMDMs em tubos de 50 ml e centrifugar a 450 xg durante 10 min. Suavemente dissociar os sedimentos celulares em 20 ml de DMEM completo.
- Contagem BMDMs na presença de azul de tripano (não houve mortalidade de mais de 10% devem ser observados).
Nota: Em geral, cerca de 6-7,5 x 10 7 macrófagos são obtidos a partir de 15 placas de Petri (100/20 mm) dos macrófagos. Há cerca de 4-5 x 10 6 macrófagos / placa de Petri (100/20 mm).
- Prepare BMDMs conforme necessário para o experimento. Depois de 16 horas em meio completo a 37 ° C, 5% de CO 2, macrófagos vai novamente aderir ao suporte.
5. Armazenar BMDMs
- Colete BMDMs isolados (passo 4.3). Centrifugar a 450 xg durante 10 min. Nota: BMDMs podem ser congeladas em nitrogênio líquido.
- Os sedimentos de células ressuspender em meio de congelação consistindo em 10% de DMSO e 90% de FCS a uma concentração final de 4 x 10 6 células / ml e pipeta de 1 ml em cada ampola.
- Congelar as células a uma taxa de arrefecimento de 1 ° C / min. Após 24 horas, transferir a ampola a um contentor de azoto líquido para o armazenamento a longo prazo.
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Representative Results
O objectivo deste método é obter facilmente um grande número de macrófagos em poucos dias. A preparação de células da medula óssea é ilustrada na Figura 1. Ossos da perna foram coletadas e esmagado num almofariz. Uma vez que os macrófagos residentes foram removidos a partir da preparação de células de medula óssea, células da medula óssea foram incubadas com GM-CSF (Dia 0). Após 3 dias, as células, que foram rodada e não aderentes antes da cultura, começam a diferenciar-se em macrófagos e aderir (Figura 1A). A análise por citometria usando F4/80 e marcadores HLA-DR revelou que as células de ambos os marcadores expressos provando assim que eles se diferenciam em macrófagos (Figura 1B). Após 7 dias, uma monocamada BMDM foi obtido com 6-7,5 x 10 7 BMDM / rato. Os macrófagos podem ser usados em diferentes tipos de ensaios (Figura 2). As actividades funcionais do BMDMs pode ser determinada de maneiras diferentes. Por exemplo, phagocytos BMDMé foi monitorizada por látex talão internalização. O número de pérolas por célula aumentou ao longo do tempo (Figura 2A). BMDM potencial endocítico (Figura 2B), as interações patógeno bacteriano (Figura 2C) e vias de transdução de sinal (Figura 2D) também foram avaliadas.
| Localização | Tipos de células |
| Osso | Osteoclastos |
| Medula óssea | Pro-monócito, macrófago |
| Sistema nervoso central | Célula Microglial |
| A lâmina própria | Macrófagos Residente |
| Fígado | Células Kupffer |
| Pulmão | Macrófagos alveolares |
| O sangue periférico | Monocyte |
| Cavidade peritoneal | Macrófago peritoneal |
| Pele | Células de Langerhans |
| Baço | Macrófagos Residente |
| Thymus | Macrófagos Residente |
Tabela 1. Fontes de macrófagos nos tecidos e fluidos.
Figura 1. Representação esquemática da produção BMDM. (A) Esta figura ilustra as etapas de diferenciação BMDM de diferenciação progenitor (dia 0) para amadurecer macrófagos (day7). (B) análise FACS ilustra a pureza das células isoladas no dia 7 usando como macrófagos marcadores HLA-DR e F4/80. Clique aqui para ver grandefigura r.
Figura 2. Exemplos de ensaios que são possíveis com BMDMs. (A) ensaio de fagocitose. BMDMs foram incubadas por diferentes períodos de tempo com esferas de látex, e a captação do grânulo foi observada por microscopia. (B) intracelular Coxiella burnetii lipopolissacarídeo (LPS) localização em BMDMs. LPS (a vermelho) foi localizada para um compartimento que alberga associada à membrana lisossomal-protein-1 (LAMP-1) (em azul), mas não a catepsina D (em verde). Esta experiência demonstra que o LPS está presente em endossomas tardios que não são capazes de se fundirem com os lisossomas. (C) BMDMs infectados com Tropheryma whipplei (em vermelho) não foi localizada no compartimento que abriga catepsina D (em verde). (D) immunob representativaslote demonstrando total de (t) e fosforilado (p) p38a níveis MAP quinase em Escherichia coli BMDMs estimuladas com LPS (1 ug / ml). As barras de escala representam 5 um.
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Discussion
O protocolo aqui descrito detalha um método para produzir grandes números de BMDMs. BMDM são células primárias e têm a função biológica e as propriedades dos macrófagos diferenciados a partir de monócitos, porque há madura, em contraste com as linhas celulares de macrófagos, que são imaturos. BMDMs podem ser utilizados para o rastreio genético (RNAi), a triagem de drogas, estudos funcionais, estudos de interação patógeno-hospedeiro e muitas outras áreas de investigação.
O procedimento aqui apresentado é muito simples e não requer nenhum equipamento especializado e, portanto, pode ser facilmente realizado num laboratório ou em sala de aula. Este método requer um pouco de prática e destreza manual. Também é possível armazenar os BMDMs em azoto líquido, facilitando, assim, as experiências futuras.
Há vários passos críticos para a cultura BMDM sucesso: 1) manutenção de uma cultura saudável estéril, 2) extração de medula óssea precisa ser eficiente, 3) L929 supqualidade ernatant é fundamental, 4) não exponha pilhas para o tampão de lise de glóbulos vermelhos por mais de 2 minutos para evitar danos às células hematopoiéticas.
É possível fazer uma modificação do protocolo mas existem em número limitativo. 1) DMEM pode ser substituído por meio RPMI 1640, mas a produção BMDM é menos eficiente, 2) comercial de M-CSF (500-1000 Ul / ml) pode ser usado em vez de sobrenadante de L929, mas é caro e FEC-M tem que ser adicionados a cada 2 dias para as células durante o processo de diferenciação, e 3) como alternativa a medula óssea pode ser extrudido a partir do osso utilizando uma seringa equipada com 25 L de agulha em vez de esmagar os ossos em um almofariz com um pilão estéreis.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo CNRS (PICS 2012-2014 a GE) e por uma bolsa da Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 para Giovanna Mottola). Filippo Conti é membro da Cooperação Científica Foundation'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit é um companheiro do Ministério Francês de Pesquisa e Tecnologia. As fontes de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise de dados, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
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