Summary
H7 एक अद्वितीय आनुवंशिक मार्कर, Z3276 को लक्षित: एक qPCR परख कोलाई O157 का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था. qPCR लाइव सेल का पता लगाने के लिए propidium monoazide (पीएमए) के इलाज के साथ जोड़ दिया गया था. इस प्रोटोकॉल कई नमूनों की आसान और संगत से निपटने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप को संशोधित और अनुकूलित किया गया है
Abstract
एक अद्वितीय खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) Z3276 ई. के लिए एक विशिष्ट आनुवंशिक मार्कर के रूप में पहचान की थी कोलाई O157: H7. एक qPCR परख ई. का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था कोलाई O157: ओआरएफ Z3276 लक्षित करके H7. इस परख के साथ, हम ई. के डीएनए के जीनोम की कुछ प्रतियां जितनी कम पता लगा सकते हैं कोलाई O157: H7. परख की संवेदनशीलता और विशिष्टता ई. की एक बड़ी संख्या के साथ गहन सत्यापन परीक्षण द्वारा पुष्टि की गई कोलाई O157: H7 उपभेदों (एन = 369) और गैर O157 उपभेदों (एन = 112). इसके अलावा, हम मृत कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं के चुनिंदा पता लगाने के लिए नव विकसित qPCR प्रोटोकॉल के साथ propidium monoazide (पीएमए) प्रक्रिया संयुक्त है. पीएमए इलाज मृत कोशिकाओं से डीएनए का प्रवर्धन लगभग पूरी तरह से पीएमए इलाज जीवित कोशिकाओं से डीएनए के लगभग अप्रभावित प्रवर्धन के विपरीत हिचकते था. इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए एक आसान और संगत से निपटने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप को संशोधित और अनुकूलित किया गया है. टीउसकी विधि सटीक सूक्ष्मजीवविज्ञानी और खाद्य सुरक्षा और पर्यावरण स्रोत के महामारी विज्ञान निगरानी पर प्रभाव पड़ता है की उम्मीद है.
Introduction
पीसीआर ई. का पता लगाने के लिए एक सामान्य तकनीक है कोलाई O157: खाद्य और पर्यावरण के नमूनों से H7. ई. के लिए विशिष्ट biomarkers की पहचान कोलाई O157: H7 पीसीआर assays में सफल पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण कारकों में से एक है. आमतौर पर ई. का पता लगाने के लिए पीसीआर assays में इस्तेमाल किया बायोमार्कर कोलाई O157: H7 Shiga विषाक्त पदार्थों (STX 1 और STX 2) 1,2, uidA 3,4, eaeA 5,6, rfbE 7, और Flic जीन 8,9 शामिल हैं. इन biomarkers की पहचान के लिए चर दक्षता प्रदान कर सकते हैं, लेकिन, बायोमार्कर का सबसे ई. का पता लगाने के लिए एक अनूठा biomarker के रूप में प्रयोग नहीं किया जा सकता है कोलाई O157: H7. लक्ष्य जीन का भेदभाव शक्ति में इस अपर्याप्तता ई. की पहचान के लिए और अधिक विशिष्ट और मजबूत biomarker (ओं) के लिए कॉल कोलाई O157: H7 10.
ई. में जीन या काल्पनिक खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs) के लिए कई जांच कोलीO157: H7 11 हमारी प्रयोगशाला से डीएनए जीनोटाइपिंग प्रोटीन से और जैव प्रौद्योगिकी सूचना के लिए राष्ट्रीय केन्द्र के GenBank डेटाबेस के भीतर खोज से सुराग के आधार पर qPCR परख के लिए डिजाइन किए गए थे. एक fimbrial जीन 11 है जो Z3276 ओआरएफ, के अनुक्रम qPCR परख के लिए चुना गया था. इसके बाद, एक qPCR परख ऐसे प्राइमरों और जांच की सांद्रता, साथ ही annealing और विस्तार तापमान (नहीं दिखाया डेटा) के रूप में पीसीआर मापदंडों पर कई परीक्षणों के माध्यम से विकसित किया गया था. ऐसे ई. के रूप में संदर्भ उपभेदों पर प्रोत्साहन inclusivity और विशिष्टता परीक्षण के बाद कोलाई O157: qPCR में H7, गैर O157 और शिगेला उपभेदों, ओआरएफ Z3276 ई. की पहचान के लिए एक विशिष्ट और मजबूत आनुवंशिक मार्कर के रूप में पहचान की थी कोलाई O157: H7. तो फिर हम ई. की पहचान के लिए यह अनूठा biomarker का उपयोग कर एक नया qPCR विधि विकसित कोलाई O157: H7.
ई. का पता लगाने में एक और चुनौती कोलाई O157: H7 में लिए दूषितODS और पर्यावरण के नमूनों से जीवित कोशिकाओं के सही निर्धारण है. मृत कोशिकाओं और पीसीआर परख में व्यवहार्यता अंतर करने में असमर्थता से डीएनए की विस्तारित उपस्थिति का पता लगाने में लाइव सेल नंबर की overestimation में जिसके परिणामस्वरूप, झूठी सकारात्मक रीडिंग कारण बन सकता है. नतीजतन, यह खाद्य जनित रोगजनकों 12 की सटीक पहचान में पीसीआर के उपयोग को सीमित करता है. मृत कोशिकाओं के डीएनए को अलग करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण पिछले कुछ साल 13-15 में पीसीआर प्रक्रिया के साथ propidium monoazide (पीएमए) उपचार के संयोजन के द्वारा लिया गया है. पीएमए मृत कोशिकाओं के अंदर जाना है, और प्रकाश के संपर्क में जब डीएनए में intercalate करने में सक्षम है, लेकिन यह जीवित कोशिकाओं के डीएनए के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए जीवित कोशिकाओं के अंदर नहीं जा सकते. इस प्रकार, रहते हैं और मृत कोशिकाओं की पीएमए इलाज मिश्रण में, मृत कोशिकाओं के डीएनए पीसीआर 13 में परिलक्षित नहीं किया जा सकता. हम चुनिंदा लाइव ई. का पता लगाने के लिए नव विकसित qPCR परख के साथ पीएमए उपचार संयुक्त कोलाई O157: H7 कोशिकाओं. इसके अतिरिक्त, हम PMA-qPCR एक बना दिया हैउच्च throughput का पता लगाने के लिए संभव ssay.
Protocol
1. बैक्टीरियल उपभेदों और डीएनए खाका तैयार
- ई. के जीवाणु उपभेदों बढ़ो कोलाई O157: H7, गैर O157, और रात भर झटकों के साथ इस तरह के 37 डिग्री सेल्सियस पर साल्मोनेला और शिगेला के रूप में अन्य रोगजनक प्रजातियों.
- उपयुक्त किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करते हुए और निर्माता के निर्देशों का पालन बैक्टीरियल संस्कृतियों से डीएनए निकालने.
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए सांद्रता निर्धारित करने के लिए ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट 260) उपाय.
2. प्राइमर और qPCR परख के लिए जांच डिजाइन
- ई. कोलाई O157: H7 दृश्यों परिग्रहण संख्या AE00517411 से कर रहे हैं. डिजाइन प्राइमरों और (विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें) रियल टाइम पीसीआर के लिए प्राइमर और जांच डिजाइन के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर जांच.
प्राइमर और जांच के दृश्यों के रूप में निम्नानुसार हैं: Z3276-फॉरवर्ड (एफ) 5'-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT -3 '
Z3276-रिवर्स (नि.) 5'-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG -3 '
Z3276 जांच, परिवार CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ - एक किताब के काम समाधान के रूप में 10 माइक्रोन की एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप, पानी के साथ प्राइमर पाउडर Reconstitute.
- जांच कार्य के समाधान के रूप में 10 माइक्रोन तक जांच पतला. लेबल्ड जांच बैचों के साथ शक्ति में भिन्नता है. इसलिए, इष्टतम qPCR प्रदर्शन के लिए उपयोग करने से पहले लेबल जांच के प्रत्येक बैच टाइट्रेट.
3. QPCR परख स्थितियां स्थापना
- 2x वास्तविक समय पीसीआर मास्टर मिश्रण का 25.0 μl, आगे प्राइमर के 200 एनएम, रिवर्स प्राइमर के 200 एनएम, और जांच की 100 एनएम के होते हैं जो प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें.
- 50 μl के अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए 5 नमूना डीएनए (100 पीजी) की μl और पानी का एक उचित मात्रा में जोड़ें.
- Nontemplate नियंत्रण के लिए, डीएनए नमूने को बदलने के लिए पानी के 5 μl का उपयोग करें.
- ; 10 विकृतीकरण के लिए सेकंड और 60 एवं 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों के बाद 95 डिग्री सेल्सियस TaqMan के क्रियान्वयन के लिए 10 मिनट के लिए इस प्रकार है: qPCR की स्थिति निर्धारित करें# 176; सी annealing / विस्तार के लिए 1 मिनट के लिए.
4. qPCR संवेदनशीलता परीक्षण
- (; चढ़ाना द्वारा लगभग 1.5 x 10 8 CFU / एमएल 600 आयुध डिपो = 0.5) के मध्य घातीय चरण की संस्कृति से एक धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने बनाओ.
- तीन प्रतियों में एक 96 अच्छी तरह से थाली पर सेल dilutions की 100 मिलीलीटर जोड़ें.
- 10 मिनट के लिए 2500 XG पर थाली अपकेंद्रित्र.
- प्रत्येक अच्छी तरह से डीएनए निष्कर्षण समाधान के 50 मिलीलीटर जोड़ें.
- एक मल्टी चैनल विंदुक के साथ Resuspend सेल छर्रों.
- 10 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में थाली फोड़ा, एक फिल्म के साथ थाली सील, और 2 मिनट के लिए 2500 XG पर अपकेंद्रित्र.
5. पीएमए उपचार के लिए रहते हैं और मृत सेल मिश्रण की तैयारी
- ई. के 10 मिलीलीटर बढ़ो कोलाई O157: मध्य घातीय चरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर H7 और दो aliquots में संस्कृति विभाजित करते हैं.
- मृत कोशिकाओं के लिए एक पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं का एक विभाज्य उबाल लें और जीवित कोशिकाओं के लिए अन्य विभाज्य छोड़ दें.
- सत्यापित करनापुन लेग अगर प्लेटों पर चढ़ाना कोशिकाओं द्वारा गर्मी मारे विभाज्य से कोई जीवित कोशिकाओं रहे हैं.
- लाइव और गर्मी मारे कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर ले लो और 8 के लिए एकाग्रता समायोजित x 10 6 CFU / लेग माध्यम के साथ मिलीलीटर. 8 x 10 0 से 8 x 10 6 CFU / एमएल से लेकर सेल dilutions के चार सेट बनाएँ.
- पीएमए या अनुपचारित साथ इलाज जीवित कोशिकाओं के लिए सेल dilutions के पहले दो सेट का उपयोग करें.
- रहते हैं और मृत सेल मिश्रण बनाने के लिए - सेल dilutions के तीसरे और चौथे सेट करने के लिए, प्रत्येक सेल कमजोर पड़ने (8 x 10 6 से 8 x 10 0) को 8 x 10 6 मृत कोशिकाओं को जोड़ने.
- पीएमए के साथ कमजोर पड़ने के तीसरे सेट का इलाज और नियंत्रण के लिए कमजोर पड़ने के चौथे सेट का उपयोग करें.
6. पीएमए के साथ कोशिकाओं के इलाज
- 10 मिमी शेयर समाधान और अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए डाइमिथाइल sulfoxide (या पानी) में पीएमए भंग.
- जीवित कोशिकाओं, मृत कोशिकाओं, और रहते हैं और मृत कोशिकाओं में के मिश्रण से विभाज्य 400 μlतीन अलग microtubes.
- 50 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक कक्ष विभाज्य 10 मिमी पीएमए के 2.0 मिलीलीटर जोड़ें.
- धीरे से एक बार कुछ, 3 सेकंड हर बार मिलाते हुए, अंधेरे में 5 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर नमूने सेते हैं.
- एक 96 अच्छी तरह से थाली पर नमूनों की 100 μl जोड़ें.
- एक ऑप्टिकल फिल्म के साथ प्लेट को सील करने और बर्फ पर थाली रख दिया.
- 20 सेमी एक 650 डब्ल्यू हलोजन प्रकाश स्रोत से थाली सेट और प्रकाश जोखिम के लिए 2 मिनट के लिए बेनकाब.
- 10 मिनट के लिए 2500 XG पर थाली अपकेंद्रित्र, धीरे सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ध्यान से अवशोषित कागज के एक टुकड़े पर थाली नाली.
- ऊपर pipetting द्वारा और एक मल्टी चैनल Pipetman साथ बीस गुना नीचे डीएनए निष्कर्षण समाधान के 50 μl में Resuspend सेल छर्रों.
- 2 मिनट के लिए 2500 XG पर 10 एक नहाने के पानी में मिनट, और अपकेंद्रित्र के लिए फोड़ा, एक फिल्म के साथ थाली सील. थाली में सतह पर तैरनेवाला पीएमए और qPCR के लिए तैयार के साथ इलाज किया कोशिकाओं से डीएनए है.
- Descri रूप qPCR प्रदर्शन करनाऊपर बिस्तर, डीएनए के 5 μl का उपयोग कर.
Representative Results
ई. की जांच कोलाई O157: ओआरएफ Z3276 उपयोग कर qPCR द्वारा H7
इस परख के प्रमुख कारकों में से एक qPCR में इस्तेमाल Z3276 जांच की संवेदनशीलता और विशिष्टता है. यह ई. के डीएनए के जीनोम की कुछ प्रतियां जितनी कम पता लगा सकते हैं कोलाई O157: H7 चित्रा 1 ए में दिखाया गया है. छह प्रमुख गैर O157 एसटीईसी उपभेदों, O104 सहित जांच की 120 गैर O157 उपभेदों की: तालिका 1 में दिखाया गया है H4 उपभेदों, साल्मोनेला, शिगेला उपभेदों, कोई पार जेट, पाया गया था.
QPCR साथ पीएमए उपचार के संयोजन
Incubating ई. कोलाई O157: 5 अंधेरे में मिनट और 2 मिनट के लिए प्रकाश को उजागर करने के लिए पीएमए (50 मिमी) के साथ H7 कोशिकाओं पीएमए उपचार स्थितियों के लिए चयन किया गया था. इसके अतिरिक्त, हम पीएमए उपचार प्रक्रिया संशोधित. पार से जोड़ने कदम में प्रयुक्त विभिन्न पारदर्शी microtubes के साथ तुलना में, एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए और अधिक कुशल हो पाया थाइष्टतम पार से जोड़ने प्रभाव और प्रकाश जोखिम प्रक्रिया के दौरान नमूना ट्यूब की एक बड़ी संख्या को संभालने से ज्यादा सुविधाजनक तक पहुँचने.
QPCR में पीएमए इलाज रहते हैं और मृत कोशिकाओं से डीएनए का प्रवर्धन
इस qPCR परख पर मृत कोशिकाओं से डीएनए के प्रवर्धन की पीएमए की मध्यस्थता निषेध का प्रभाव दो धारावाहिक 10 गुना रहते हैं या मृत सेल dilutions से व्युत्पन्न डीएनए का उपयोग करके चित्र 1 में दिखाया गया. परिणाम पीएमए (लाल वक्र) के साथ और पीएमए (नीला वक्र) के बिना इलाज जीवित कोशिकाओं से उत्पन्न घटता रैखिक और एक दूसरे के लिए लगभग समान लग रहे हैं कि दिखा. मामूली सीटी मूल्य मतभेद पीएमए उपचार qPCR में जीवित कोशिकाओं के डीएनए के प्रवर्धन पर खास असर नहीं पड़ा, सुझाव है कि पीएमए के साथ और पीएमए (चित्रा 1 ए) के बिना इलाज जीवित कोशिकाओं के बीच दिखाया गया. लेकिन एक 15 - सीटी मूल्य अंतर (32,000 गुना) पीएमए के साथ इलाज मृत कोशिकाओं के बीच और पीएमए, डेमो के बिना दिखाया गया थापीएमए उपचार कुशलता से मृत कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) से डीएनए प्रवर्धन दबा कि nstrating.
QPCR में रहते हैं और मृत सेल मिश्रण से जीवित कोशिकाओं की जांच
जीवित कोशिका dilutions (8 X 10 0-8 एक्स 10 6 CFU) के दो सेट लाइव / मृत सेल मिश्रण से जीवित कोशिकाओं का पता लगाने में पीएमए के साथ या पीएमए के बिना इलाज किया गया. qPCR परिणाम (2A चित्रा) अनुपचारित नमूने (नीली पट्टियों) को इलाज जीवित कोशिकाओं (बैंगनी सलाखों) की संख्या से संबंधित के रूप में सीटी मूल्यों का एक समानांतर उलटा प्रगतिशील प्रवृत्ति का प्रदर्शन किया. इलाज जीवित कोशिकाओं अनुपचारित जीवित कोशिकाओं की तुलना में एक हद तक उच्च सीटी मूल्यों झुकेंगे. सीटी मूल्यों में एक समान उलटा प्रगतिशील प्रवृत्ति चित्रा 2B में के रूप में अच्छी तरह से पीएमए (हरे रंग की सलाखों) के साथ इलाज लाइव / मृत सेल मिश्रण में जीवित कोशिकाओं की वास्तविक संख्या के साथ मनाया गया. इसके अलावा, सीटी मूल्यों की इस गिरावट थी106 मृत कोशिकाओं की मौजूदगी के बावजूद मिश्रण में जीवित कोशिकाओं की संख्या के साथ मनाया. इन परिणामों से मृत कोशिकाओं से डीएनए प्रवर्धन कुशलतापूर्वक पीएमए उपचार द्वारा दबा दिया गया था जबकि लाइव / मृत सेल मिश्रण की सीटी मूल्यों, अकेले जीवित कोशिकाओं से डीएनए प्रतिनिधित्व दिखाया. लेकिन, पीएमए के साथ इलाज लाइव / मृत सेल मिश्रण की सीटी मूल्यों fluctuated और चित्रा 2 बी (पीला सलाखों) में मिश्रण में लाइव सेल नंबर परिलक्षित करने में विफल रहे थे.
चित्रा 1. रहते हैं और मृत कोशिकाओं पीएमए के साथ या qPCR परख में पीएमए के बिना इलाज किया. (ए) के एक धारावाहिक लाइव ई. 10 गुना पतला कोलाई O157: H7 सेल dilutions (8 X 10 0-8 एक्स 10 6 CFU) पीएमए के साथ या पीएमए के बिना इलाज किया गया.सीटी मूल्यों qPCR परख में triplicates का औसत सीटी मूल्यों का प्रतिनिधित्व. (बी) क्यू तुलना qPCR परख में पीएमए के साथ और पीएमए बिना इलाज जीवित कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं के डीएनए प्रवर्धन की तुलना करें. ΔRn तीव्रता परिवर्तन प्रतिदीप्ति को दर्शाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. . PMA-qPCR सेल संस्कृतियों का 10 गुना dilutions (8 X 10 0-8 एक्स 10 6 CFU) के चार सेट द्वारा रहते / मृत सेल मिश्रण से जीवित कोशिकाओं के भेदभाव संकेत के रूप में बनाया गया था. दूसरा सेल कमजोर पड़ने डीएनए निष्कर्षण से पहले या अनुपचारित था, जबकि सेल कमजोर पड़ने की (ए) पहला सेट पीएमए के साथ इलाज किया गया था.(बी) 8 x 10 6 मृत कोशिकाओं को संकेत के रूप में रहते / मृत सेल मिश्रण के दो सेट बनाने के लिए सेल dilutions के तीसरे और चौथे सेट के साथ मिलाया गया. सेल मिश्रण का एक सेट पीएमए के साथ इलाज किया गया था और दूसरे सेट डीएनए निष्कर्षण से पहले पीएमए के बिना इलाज किया गया था. प्रत्येक बार एसडी ± एक तीन प्रतियों प्रयोग की औसत सीटी मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है.
| जीव | सीरोटाइप | परीक्षण किया उपभेदों की संख्या |
| ई. कोलाई | 2006 पालक O157: H7 प्रकोप वियोजन | 186 |
| 2006 टैको बेल O157: H7 वियोजन | 58 | |
| 2006 टैको जॉन O157: H7 वियोजन | 11 | |
| अन्य O157 से डीएमबी तनाव संग्रह: H7 प्रकोप | 112 | |
| O104: H4 | 3 | |
| O26 | 18 | |
| O103 | 13 | |
| O111 | 24 | |
| O121 | 2 | |
| O45 | 5 | |
| O145 | 9 | |
| O113 | 2 | |
| O91 | 1 | |
| O55 | 9 | |
| अन्य | 19 | |
| साल्मोनेला | Typhi | 1 |
| न्यूपोर्ट | 2 | |
| शिगेला dysenteriae | 6 | 2 |
| शिगेला sonnei | अज्ञात | 2 |
| शिगेला flexneri | 4 | 1 |
| शिगेला boydii | 1 | 1 |
| संपूर्ण | 481 | |
टीसक्षम 1. ई. की पहचान के लिए वास्तविक समय पीसीआर परख में मान्यता के लिए इस्तेमाल खींच कोलाई O157: H7.
Discussion
अध्ययन के एक प्राथमिक उद्देश्य ई. को एक ओआरएफ Z3276, एक अद्वितीय का उपयोग शामिल है कोलाई O157: H7, qPCR परख के लिए एक एकल biomarker के रूप में. वर्तमान में, सबसे qPCR assays ऐसे stx1, stx2, और eaeA 1,2,5,6 या ऐसे uidA 3,4, rfbE और Flic जीन 8,9 के रूप में साझा प्ररूपी जीन, के रूप में डाह जीन, लक्षित कर रहे हैं. उन जीनों विभिन्न प्रजातियों या के रूप में अच्छी तरह से उपभेदों 16 में मौजूद हैं के रूप में कभी कभी, एक प्रजाति या तनाव निश्चित रूप से, इस तरह के STX 1and STX 2 जीन के रूप में, डाह जीन (एस) द्वारा की पहचान नहीं की जा सकती. लक्ष्य जीन के लिए rfbE और Flic का प्रयोग, दोनों जीनों पूरी पहचान 17 के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है. एक biomarker के रूप में ओआरएफ Z3276 उपयोग करना, इस qPCR परख संवेदनशील और विशिष्ट परख (1 टेबल) होना प्रदर्शित किया गया है. H7 उपभेदों (n = 3: यह परख O157 सहित कड़े inclusivity और विशिष्टता परीक्षण के अधीन कर दिया गया हैऐसे साल्मोनेला और शिगेला के रूप में 67), 100 से अधिक गैर O157 उपभेदों, और अन्य रोगजनक प्रजातियों. सभी O157: जांच H7 उपभेदों सकारात्मक पाया गया है, और कोई पार जेट गैर O157 उपभेदों (1 टेबल) से मिला था, ओआरएफ Z3276 ई. का पता लगाने के लिए एक अनूठा और मजबूत biomarker है कि यह दर्शाता है कोलाई O157: H7.
अध्ययन के अन्य उद्देश्य चुनिंदा डीएनए निष्कर्षण से पहले पीएमए उपचार से मृत कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं का पता लगा है. पीएमए समझौता झिल्ली के साथ मृत कोशिकाओं में घुसना और डीएनए के लिए बाध्य है, और इस तरह पीसीआर 13 में मृत कोशिकाओं के डीएनए प्रवर्धन रोकता कर सकते हैं. हम पीएमए उपचार प्रक्रिया संशोधित, और प्रक्रिया के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली स्वरूप को ढाल लिया है. प्रकाश जोखिम का सही तीव्रता इष्टतम पार से जोड़ने प्रभाव प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इससे पहले, microtubes इस कदम 13-15 में इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, अलग microtubes प्रकाश पूर्व में संभालना मुश्किल हैंposure कदम है, और इन ट्यूबों सबसे अच्छा पार पसंद प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से पारदर्शी नहीं हैं. एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करना, हम पीएमए उपचार की दक्षता में सुधार हुआ. ये बदलाव कई मायनों में परख प्रभाव हो सकता है: वे विशेष रूप से कई नमूनों के साथ, यह आसान एक पूरी तरह से और वर्दी पार से जोड़ने प्रभाव प्राप्त करने के लिए बना, इलाज के नमूने लिए यह संभव बनाने के लिए एक से दूसरे की थाली से ले जाया जा सकता बड़ी संख्या का पता लगाने के नमूने के लिए, और वे पूरी प्रक्रिया के लिए स्वचालन क्षमता के साथ इस PMA-qPCR परख प्रदान करते हैं. इस PMA-qPCR परख की सीमा पीएमए उपचार कुछ हद तक पीसीआर परख लागत बढ़ जाती है और थोड़ा पीसीआर परख की संवेदनशीलता कम है.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम धन का हिस्सा प्रदान करने के लिए होमलैंड सुरक्षा विभाग के अमेरिकी धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
| 2x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
| PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
| Primer Express | ABI | ||
| Probes | ABI | Top of Form | |
| PMA | Biodium | 40013 | |
| Puregen cell and tissue kit | Qiagene | ||
| DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
| Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
| 650 W Halogen light source | Britek | H8061S | |
| Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
| Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |
References
- Barletta, F., et al. Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).
- Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).
- Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).
- Li, Y., Mustapha, A. Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR. J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).
- Schmidt, H., et al. Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes. Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).
- Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).
- Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide. J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).
- Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM. J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).
- Fricker, M., Messelhäußer, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).
- Li, B., Chen, J. Q. Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker. Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).
- Perna, N. T., et al. Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature. 409, 529-533 (2001).
- Wang, S., Levin, R. E. Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR. J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).
- Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).
- Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide. J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).
- Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).
- Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).
