Summary
En qPCR analysen ble utviklet for påvisning av Escherichia coli O157: H7 målretting en unik genetisk markør, Z3276. QPCR ble kombinert med propidium monoazide (PMA) behandling for levende celle gjenkjenning. Denne protokoll er blitt modifisert og tilpasset til en 96-brønn plate-format for enkel og jevn behandling av mange prøver
Abstract
En unik åpen leseramme (ORF) Z3276 ble identifisert som en spesifikk genetisk markør for E. coli O157: H7. En qPCR assay ble utviklet for påvisning av E. coli O157: H7 ved å målrette ORF Z3276. Med denne måling kan vi påvise så lite som noen få kopier av genomet av DNA av E. coli O157: H7. Sensitiviteten og spesifisiteten av analysen ble bekreftet ved intensiv valideringstester med et stort antall E. coli O157: H7 stammer (n = 369) og ikke-O157 stammer (n = 112). Videre har vi kombinert propidium monoazide (PMA) prosedyre med den nyutviklede qPCR protokoll for selektiv påvisning av levende celler fra døde celler. Amplifikasjon av DNA fra PMA-behandlede døde celler ble nesten fullstendig hemmet, i motsetning til praktisk talt upåvirket amplifisering av DNA fra PMA-behandlede levende celler. I tillegg har den protokoll er modifisert og tilpasset til en 96-brønn plate-format for en lett og jevn behandling av et stort antall prøver. Thans metode er forventet å ha en innvirkning på nøyaktig mikrobiologiske og epidemiologiske overvåking av matvaresikkerhet og miljø kilde.
Introduction
PCR er en vanlig teknikk for påvisning av E. coli O157: H7 fra mat og miljøprøver. Identifisere spesifikke biomarkører for E. coli O157: H7 er en av de viktigste faktorene for vellykket deteksjon i PCR-analyser. De biomarkører som vanligvis brukes i PCR-analyser for påvisning av E. coli O157: H7 er Shiga toksiner (STX 1 og STX 2) 1,2, uidA 3,4, eaeA 5,6, rfbE 7, og Flic gener 8,9. Disse biomarkører kan gi varierende effektivitet for identifikasjon, men da kan det meste av biomarkører ikke brukes som en unik biomarkør for deteksjon av E. coli O157: H7. Dette utilstrekkelighet i differensiering kraft målgener krever mer spesifikke og sterkere biomarkør (er) for identifisering av E. coli O157: H7 10.
Tallrike prober for gener eller hypotetiske åpne leserammer (ORF'er) i E. coliO157: H7 11 ble designet for qPCR analysen basert på ledetråder fra DNA genotyping mikromatriser fra vårt laboratorium og ved å søke innenfor GenBank database av National Center for Biotechnology Information. Sekvensen av Z3276 ORF, som er en fimbrial gen 11, ble valgt for qPCR assay. Deretter ble en qPCR assay utviklet gjennom tallrike forsøk på PCR-parametere som for eksempel konsentrasjon av primere og prober, samt annealing og forlengelsestemperatur (data ikke vist). Etter insentiv inclusivity og eksklusivitet tester på referansestammer som E. coli O157: H7, non-O157 og Shigella-stammer i qPCR ble ORF Z3276 identifisert som en spesiell og sterk genetisk markør for identifisering av E. coli O157: H7. Deretter utvikler vi en ny qPCR metode å bruke denne unike biomarkør for identifisering av E. coli O157: H7.
En annen utfordring i påvisning av E. coli O157: H7 i forurenset foods og miljø er nøyaktig bestemmelse av levende celler fra prøvene. Den utvidede tilstedeværelse av DNA fra døde celler og manglende evne til å skille levedyktighet i PCR-analyse kan føre til falske positive resultater, noe som resulterer i overvurdering av levende celle tall i deteksjon. Derfor begrenser denne bruken PCR i nøyaktig påvisning av matbårne patogener 12. En ny tilnærming til å skille DNA av de døde cellene har blitt tatt ved å kombinere propidium monoazide (PMA) behandling med PCR prosedyre i de siste årene 13-15. PMA er i stand til å gå inn i døde celler, og intercalate i DNA når de utsettes for lys, men den kan ikke gå på innsiden av levende celler til å reagere med DNA av de levende celler. Således, i PMA-behandlede blandinger av levende og døde celler, DNA av døde celler kan ikke bli forsterket i PCR 13. Vi kombinerte PMA behandling med den nyutviklede qPCR analyse for å selektivt påvise levende E. coli O157: H7 celler. I tillegg har vi gjort PMA-qPCR enssay mulig for høy gjennomstrømning deteksjon.
Protocol
En. Bakteriestammer og DNA Mal Forberedelse
- Grow bakteriestammer av E. coli O157: H7, ikke-O157, og andre patogene arter, slik som Salmonella og Shigella, ved 37 ° C over natten med risting.
- Utdrag DNA fra bakteriekulturer ved hjelp av riktig kit (se tabell av materialer) og følge produsentens anvisninger.
- Måle optisk tetthet (OD 260) for å bestemme DNA-konsentrasjoner ved å bruke et spektrofotometer.
2. Primer og Probe Design for qPCR analysen
- E. coli O157: H7 sekvenser er fra GenBank tiltredelse nummer AE00517411. Design primere og probe ved hjelp av egnet programvare for primer og probe design for real-time PCR (se materialer tabell for detaljer).
Sekvensene av primerne og proben er som følger: Z3276-Forover (F) 5'-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 '
Z3276-revers (R) 5'-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 '
Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ - Rekonstituer primer pulver med vann, noe som resulterer i en konsentrasjon på 10 uM som en primer arbeidsløsning.
- Fortynn probene til 10 uM som probe arbeidsløsninger. Merkede prober varierer i styrke med grupper. Derfor titrere hvert parti av merkede prober før bruk for optimal qPCR ytelse.
Tre. Innstilling av qPCR analyseforhold
- Forbered reaksjonsblanding, som består av 25,0 ul av 2x real-time PCR konsentrat-blanding, 200 nM av forover-primer, 200 nM av revers primer, og 100 nM for probe.
- Tilsett 5 ul av prøve-DNA (100 pg) og en passende mengde vann for å oppnå et sluttvolum på 50 pl.
- For nontemplate kontrollen med 5 pl vann for å erstatte DNA-prøve.
- Sett qPCR betingelser som følger: 95 ° C i 10 minutter for aktivering av TaqMan, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 10 sek for denaturering og 60 &# 176, C i 1 min for annealing / forlengelse.
4. qPCR Følsomhetstest
- Gjør en seriell 10 gangers fortynning av en kultur av mid-eksponensiell fase (OD 600 = 0,5, omtrent 1,5 x 10 8 CFU / ml ved plettering).
- Legg 100 ml celle fortynninger på en 96-brønns plate i triplikat.
- Sentrifuger plate ved 2500 xg i 10 min.
- Tilsett 50 ml av DNA-ekstraksjon løsning til hver brønn.
- Suspender celle pellets med en flerkanals pipette.
- Forsegl plate med en film, koke platen i et vannbad i 10 min, og sentrifuger ved 2500 xg i 2 min.
5. Forbereder levende og døde Cell blandinger for PMA behandling
- Grow 10 ml av E. coli O157: H7 ved 37 ° C til midten av eksponentiell fase og dele kultur inn to mengder.
- Kok en aliquot av celler i 10 minutter i et vannbad for døde celler og lar den andre alikvot for levende celler.
- Verifiserere er ingen levende celler fra den varme-drepte aliquot ved plating av cellene på LB agarplater.
- Ta 2 ml av levende og varme-drepte celler og justere konsentrasjonen til 8 x 10 6 CFU / ml med LB medium. Lag fire sett med celle fortynninger som strekker seg fra 8 x 10 0-8 x 10 6 CFU / ml.
- Bruk av de to første settene med celle fortynninger for levende celler behandlet med PMA eller ubehandlet.
- Til tredje og fjerde sett med celle fortynninger, tilsett 8 x 10 6 døde celler til hver celle fortynning (8 x 10 0 - 8 x 10 6) for å gjøre levende og døde celle blandinger.
- Behandles det tredje settet med fortynning med PMA og bruke det fjerde settet med fortynning for kontroll.
6. Behandling Cells med PMA
- Oppløs PMA i dimetylsulfoksyd (eller vann) for å gjøre 10 mM stamløsning og lagret ved -20 ° C i mørket.
- Delmengde 400 mL av levende celler, døde celler, og blanding av levende og døde celler itre separate mikrorør.
- Til 2,0 ml av 10 mM PMA til hver celle alikvot til en endelig konsentrasjon på 50 uM.
- Inkuber prøvene ved omgivelsestemperatur i 5 min i mørke, riste forsiktig noen få ganger, i 3 sekunder hver gang.
- Tilsett 100 ul av prøver på en 96-brønns plate.
- Tett plate med en optisk film og sette platen på is.
- Sett platen 20 cm fra en 650 W halogen lyskilde og utsett for 2 min for lyseksponering.
- Sentrifuger plate ved 2500 xg i 10 minutter, forsiktig kast supernatant og nøye tapp plate på et stykke absorberende papir.
- Suspender celle pellets i 50 mL av DNA-ekstraksjon løsning ved pipettering opp og ned tjue ganger med en multi-kanal Pipetman.
- Forsegl plate med en film, kok i 10 min i et vannbad, og sentrifuger ved 2500 xg i 2 min. Supernatanten i platen er DNA fra celler behandlet med PMA og klar for qPCR.
- Utfør qPCR som descriSengen ovenfor, under anvendelse av 5 ul av DNA.
Representative Results
Påvisning av E. coli O157: H7 ved qPCR hjelp ORF Z3276
En av de viktigste faktorene for denne analysen er følsomheten og spesifisiteten av Z3276 sonden som brukes i qPCR. Det kan detektere så lite som noen få kopier av genomet av DNA av E. coli O157: H7 som vist i figur 1A. Av de 120 ikke-O157 stammer undersøkt, herunder de seks store non-O157 STEC stammer, O104: H4 stammer, Salmonella og Shigella-stammer, ble ingen kryss-reaktivitet funnet, som vist i tabell 1.
Kombinasjon av PMA behandling med qPCR
Ruger E. coli O157: H7 celler med PMA (50 mm) for 5 min i mørket og utsette for lys i to minutter ble valgt for PMA behandlingsforhold. I tillegg endret vi PMA behandlingsprosedyren. Sammenlignet med en rekke gjennomsiktige mikrorør som benyttes i det tverrbindende trinn, ble en 96-brønns plate funnet å være mer effektivt ånå det optimale tverrbindingseffekt, og mer fordelaktig enn å håndtere et stort antall prøverør under lyseksponering prosessen.
Forsterkning av DNA fra PMA-behandlede levende og døde celler i qPCR
Virkningene av PMA-mediert inhibering av amplifisering av DNA fra døde celler på denne qPCR assay ble vist i figur 1 ved hjelp av DNA avledet fra to serielle 10-fold levende eller døde celle fortynninger. Resultatene viser at kurvene som genereres fra de levende celler behandlet med PMA (rød kurve) og uten PMA (blå kurve) virker lineært og nesten identiske med hverandre. Små CT verdiforskjeller ble vist mellom de levende celler behandlet med PMA og uten PMA (figur 1A), noe som tyder på at PMA behandling hadde liten effekt på forsterkning av DNA av de levende cellene i qPCR. Men en 15 - CT verdi forskjell (32000 ganger) ble vist mellom de døde cellene behandlet med PMA og uten PMA, demonstrating at PMA behandling undertrykte effektivt DNA forsterkning fra de døde cellene (Figur 1b).
Påvisning av levende celler fra levende og døde celle blandinger i qPCR
To sett med live celle fortynninger (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU) ble behandlet med PMA eller uten PMA å påvise levende celler fra levende / døde celle blandinger. QPCR resultater (Figur 2A) viste en parallell inverse progressive trenden med CT-verdier som er relatert til antall behandlede levende celler (lilla søyler) til de ubehandlede prøvene (blå søyler). De behandlede levende celler gitt en noe høyere CT verdier enn de av ubehandlede levende celler. En lignende invers progressive trend i CT-verdier ble observert med den virkelige antall levende celler i live / døde Celleblandingene behandlet med PMA (grønne søyler) samt i figur 2B. I tillegg har denne nedadgående trenden med CT-verdier varobservert med antallet levende celler i blandinger til tross for tilstedeværelsen av 106 døde celler. Disse resultatene viste at CT-verdiene for de levende / døde celle blandinger representert DNA fra de levende celler alene, mens DNA amplifisering fra de døde cellene ble effektivt undertrykt av PMA-behandling. Men, ble CT-verdiene av levende / døde Celleblandingene behandlet med PMA svingt og klarte ikke å reflektert live celle tall i blandinger i figur 2B (gule søyler).
Figur 1. Lever og døde celler behandlet med PMA eller uten PMA i qPCR assay. (A) En seriell av 10-fold-fortynnet levende E. coli O157: H7 celle fortynninger (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU) ble behandlet med PMA eller uten PMA.CT-verdiene representerer den gjennomsnittlige CT verdier av triplicates i qPCR analysen. (B) Sammenligning av DNA-amplifisering av levende celler og døde celler behandlet med PMA og uten PMA i q sammenligning qPCR assay. ΔRn refererer til Fluorescensintensitet endring. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Differensiering av levende celler fra levende / døde celle blandinger av PMA-qPCR Fire sett med ti-gangers fortynning av cellekulturer (8 x 10 0-8 x 10 CFU 6). Ble foretatt som angitt. (A) Første sett av celle fortynning ble behandlet med PMA, mens den andre cellen fortynning var ubehandlet før DNA-ekstraksjon.(B) 8 x 10 6 døde celler ble blandet med den tredje og fjerde sett av celle fortynninger for å gjøre to sett av levende / døde celle blandinger som angitt. Ett sett av celle blandinger ble behandlet med PMA og det andre settet ble behandlet uten PMA før DNA-ekstraksjon. Hver søyle representerer gjennomsnitts CT verdier av et tre eksemplarer eksperiment ± SD.
| Organisme | Serotype | Antall stammer testet |
| E. coli | 2006 spinat O157: H7 utbrudds isolater | 186 |
| 2006 Taco Bell O157: H7 isolater | 58 | |
| 2006 Taco John O157: H7 isolater | 11 | |
| DMB belastningsskader samlinger fra andre O157: H7 utbrudd | 112 | |
| O104: H4 | 3 | |
| O26 | 18 | |
| O103 | 13 | |
| O111 | 24 | |
| O121 | 2 | |
| O45 | 5 | |
| O145 | 9 | |
| O113 | 2 | |
| Bokmerke O91 | 1 | |
| O55 | 9 | |
| Annet | 19 | |
| Salmonella | Bakterien | 1 |
| Newport | 2 | |
| Shigella dysenteriae | 6 | 2 |
| Shigella sonnei | Ukjent | 2 |
| Shigella flexneri | 4 | 1 |
| Shigella boydii | 1 | 1 |
| Total | 481 | |
Tstand en. Stammer brukes til validering i real-time PCR-analyse for identifisering av E. coli O157: H7.
Discussion
Et hovedmål med studien innebærer bruk av en ORF Z3276, en unik for E. coli O157: H7, som en eneste biomarkør for qPCR analysen. I dag er de fleste qPCR analyser rettet virulens gener, for eksempel stx1, stx2, og eaeA 1,2,5,6 eller delte fenotypiske gener, for eksempel uidA 3,4, rfbE og Flic gener 8,9. Av og til, en art eller stamme kan ikke definitivt identifisert av virulens-genet (er), for eksempel 1 og STX STX to gener, så disse gener er til stede i forskjellige arter eller stammer 16 i tillegg. Ved hjelp av rfbE og FLIC for målgener, er begge gener som er nødvendig for å bli brukt til fullstendig identifisering 17.. Ved hjelp av ORF Z3276 som en biomarkør, har dette qPCR analyse vist seg å være sensitiv og spesifikk analyse (tabell 1). Denne analysen har vært utsatt for strenge inclusivity og eksklusivitet tester, inkludert O157: H7 stammer (n = 367), over 100 ikke-O157-stammer, og andre patogene arter, slik som Salmonella og Shigella. Alle O157: H7 stammer undersøkt ble positivt oppdaget, og ingen kryss-reaktivitet ble funnet fra de ikke-O157 stammer (Tabell 1), noe som indikerer at ORF Z3276 er en unik og sterk biomarkør for påvisning av E. coli O157: H7.
Den andre Målet med studien er å selektivt detektere levende celler fra døde celler ved PMA behandling før DNA-ekstraksjon. PMA kan trenge inn i de døde celler med nedsatt membran og binder seg til DNA, og således inhiberer DNA-amplifiseringen av døde celler i PCR 13. Vi har modifisert PMA-behandling prosedyre, og er tilpasset det til en 96-brønn plate-format for prosedyren. Den riktige intensitet lyseksponering er nødvendig for å oppnå optimal tverrbinding i kraft. Tidligere har mikrorør blitt brukt i dette trinnet 13-15. Imidlertid separate mikrorør er vanskelige å håndtere i lys exposure trinn, og i disse rør ikke er helt gjennomsiktig for å oppnå best tverr smak. Ved hjelp av en 96-brønns plate, forbedret vi effektiviteten av PMA-behandling. Disse endringene kan påvirke analysen på flere måter: de gjør det lettere å oppnå en grundig, ensartet tverrbindingseffekt, særlig med en rekke prøver, har de behandlede prøvene kan flyttes fra en plate til en annen for å gjøre det mulig for påvisning av mange av prøvene, og de gir denne PMA-qPCR analysen med automatisering potensial for hele prosessen. Begrensningen av denne PMA-qPCR analysen er at PMA behandling øker PCR analysen kostnadene noe, og litt redusert følsomhet for PCR-analyse.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker det amerikanske Department of Homeland Security for å gi en del av finansieringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
| 2x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
| PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
| Primer Express | ABI | ||
| Probes | ABI | Top of Form | |
| PMA | Biodium | 40013 | |
| Puregen cell and tissue kit | Qiagene | ||
| DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
| Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
| 650 W Halogen light source | Britek | H8061S | |
| Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
| Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |
References
- Barletta, F., et al. Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).
- Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).
- Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).
- Li, Y., Mustapha, A. Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR. J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).
- Schmidt, H., et al. Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes. Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).
- Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).
- Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide. J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).
- Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM. J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).
- Fricker, M., Messelhäußer, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).
- Li, B., Chen, J. Q. Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker. Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).
- Perna, N. T., et al. Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature. 409, 529-533 (2001).
- Wang, S., Levin, R. E. Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR. J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).
- Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).
- Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide. J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).
- Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).
- Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).
