Summary
En qPCR analys utvecklades för detektion av Escherichia coli O157: H7 riktar en unik genetisk markör, Z3276. Den qPCR kombinerades med propidium monoazide (PMA) behandling för levande cell upptäckt. Detta protokoll har ändrats och anpassats till en 96-brunnar format för enkel och konsekvent hantering av många prover
Abstract
En unik öppen läsram (ORF) Z3276 identifierades som en särskild genetisk markör för E. coli O157: H7. En qPCR analys utvecklades för detektion av E. coli O157: H7 genom att rikta ORF Z3276. Med denna analys, kan vi upptäcka så lite som några få kopior av genomet av DNA av E. coli O157: H7. Känsligheten och specificiteten hos analysen bekräftades genom intensiva valideringstester med ett stort antal E. coli O157: H7-stammar (n = 369) och icke-O157-stammar (n = 112). Dessutom har vi kombinerat förfarande propidium monoazide (PMA) med den nyutvecklade qPCR protokoll för selektiv detektering av levande celler från döda celler. Amplifiering av DNA från PMA-behandlade döda celler var nästan helt inhiberade i motsats till nästan opåverkad amplifiering av DNA från PMA-behandlade levande celler. Dessutom har det protokoll som modifierats och anpassats till ett 96-brunnsplattformat för en enkel och konsekvent hantering av ett stort antal prover. Thans metod förväntas påverka korrekt mikrobiologiska och epidemiologisk övervakning av livsmedelssäkerheten och miljö källa.
Introduction
PCR är en vanlig teknik för detektion av E. coli O157: H7 från mat-och miljöprover. Identifiering av specifika biomarkörer för E. coli O157: H7 är en av de viktigaste faktorerna för framgångsrik detektering i PCR-analyser. De biomarkörer som vanligen användes i PCR-analyser för detektion av E. coli O157: H7 inkluderar Shiga toxiner (STX 1 och STX 2) 1,2, uidA 3,4, EAEA 5,6, rfbE 7, och flic gener 8,9. Dessa markörer kan ge variabel effektivitet för identifiering, men de flesta av de biomarkörer kan inte användas som en unik biomarkör för detektering av E. coli O157: H7. Denna otillräcklighet i differentiering makt målgener kräver mer specifik och starkare biomarkör (ar) för identifiering av E. coli O157: H7 10.
Talrika prober för gener eller hypotetiska öppna läsramar (ORF) i E. coliO157: H7 11 utformades för qPCR analys baserad på ledtrådar från DNA-genotypning microarrays från vårt laboratorium och genom att söka i databasen GenBank av National Center for Biotechnology Information. Sekvensen hos Z3276 ORF, som är ett fimbrialt gen 11, valdes för qPCR assay. Därefter gjordes en qPCR analys utvecklats genom många prövningar av PCR-parametrar såsom koncentrationer av primers och prober, samt glödgning och förlängningstemperaturer (data visas ej). Efter incitament integrering och exklusivitet tester på referensstammar såsom E. coli O157: H7, non-O157 och Shigella-stammar i qPCR, var ORF Z3276 identifieras som en specifik och stark genetisk markör för identifiering av E. coli O157: H7. Sedan utvecklar vi en ny qPCR metod att använda denna unika biomarkör för identifiering av E. coli O157: H7.
En annan utmaning i upptäckt av E. coli O157: H7 i förorenat foods och miljö är noggrann bestämning av levande celler från prover. Den utökade närvaron av DNA från döda celler och oförmåga att skilja livskraften i PCR-analys kan orsaka falskt positiva värden, vilket leder till överskattning av levande cell nummer i upptäckt. Följaktligen begränsar detta PCR-användning i exakt upptäckt av livsmedelsburna patogener 12. En ny metod för att skilja DNA av döda celler har tagits genom att kombinera propidium monoazide (PMA) behandling med PCR-metoden under de senaste åren 13-15. PMA kan gå inuti döda celler, och interkalera i DNA när den utsätts för ljus, men det kan inte gå in i levande celler att reagera med DNA i levande celler. Således, i PMA-behandlade blandningar av levande och döda celler, DNA från döda celler kan inte amplifieras i PCR-13. Vi kombinerade PMA behandling med den nyutvecklade qPCR analys som detekterar levande E. coli O157: H7 celler. Dessutom har vi gjort PMA-qPCR assay möjligt för hög genomströmning detektering.
Protocol
1. Bakteriestammar och DNA Mall Förberedelse
- Väx bakteriestammar av E. coli O157: H7, icke-O157 och andra patogena arter, såsom Salmonella och Shigella, vid 37 ° C över natten med skakning.
- Extrahera DNA från bakteriekulturer med användning av lämplig kit (se tabell av material) och i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Mät den optiska densiteten (OD 260) för att bestämma DNA-koncentrationer med användning av en spektrofotometer.
2. Primer och Probe Design för qPCR analys
- E. coli O157: H7 sekvenser från GenBank tillträdesnummer AE00517411. Design primers och sond med lämplig programvara för primer och sond design för realtids-PCR (se materialtabellen för detaljer).
Sekvenserna för primers och prob är som följer: Z3276-Framåt (F) 5'-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 '
Z3276-bakåt (R) 5'-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 '
Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ - Rekonstituera primer pulvret med vatten, vilket resulterar i en koncentration av 10 | iM som primer arbetslösning.
- Späd probema till 10 | iM som sond arbetslösningar. Märkta sökfragment som varierar i styrka med satser. Därför titrera varje sats av märkta sönder innan den används för optimal qPCR prestanda.
3. Inställning av qPCR Analysbetingelser
- Framställ reaktionsblandning, som består av 25,0 pl av 2x realtids-PCR Master Mix, 200 nM framåtriktad primer, 200 nM reverse primer och 100 nM sond.
- Lägg till 5 l av prov-DNA (100 pg) och en lämplig mängd vatten för att nå en slutlig volym på 50 pl.
- För nontemplate kontroll, använd 5 l vatten för att byta ut DNA-provet.
- Ställ in qPCR betingelser enligt följande: 95 ° C under 10 minuter för aktivering av TaqMan, följt av 40 cykler av 95 ° C under 10 sekunder för denaturering och 60 &# 176; C i 1 min för glödgning / förlängning.
4. qPCR Känslighetstest
- Lägg till en seriell 10-faldig utspädning från en kultur av mid-exponentiell fas (OD600 = 0,5, omkring 1,5 x 10 8 CFU / ml genom plätering).
- Tillsätt 100 ml cellspädningar på en 96-brunnar i triplikat.
- Centrifugera plattan vid 2500 xg under 10 min.
- Tillsätt 50 ml av DNA-extraktion lösning till varje brunn.
- Återsuspendera cellpelletarna med en multikanalpipett.
- Förslut plattan med en film, koka plattan i ett vattenbad under 10 min, och centrifugera vid 2500 x g under 2 min.
5. Förbereda levande och döda cell Blandningar för PMA behandling
- Grow 10 ml av E. coli O157: H7 vid 37 ° C till mid-exponentiell fas och delar upp kultur i två alikvoter.
- Koka en alikvot av celler under 10 minuter i ett vattenbad i döda celler och lämnar den andra alikvoten för levande celler.
- Verifierare är inga levande celler från värmedödade alikvot genom utstrykning av cellerna på LB-agarplattor.
- Ta 2 ml av de levande och värmedödade celler och justera koncentrationen till 8 x 10 6 CFU / ml med LB-medium. Skapa fyra uppsättningar av cellspädningar som sträcker sig från 8 x 10 0-8 x 10 6 CFU / ml.
- Använd de första två cellspäd för levande celler behandlade med PMA eller obehandlad.
- För det tredje och fjärde uppsättningar av cellspädningar, till 8 x 10 6 döda celler till varje cell utspädning (8 x 10 0 - 8 x 10 6) för att göra levande och döda cellblandningar.
- Behandla den tredje uppsättningen av utspädning med PMA och använda den fjärde uppsättningen av utspädning för kontroll.
6. Att behandla celler med PMA
- Lös PMA i dimetylsulfoxid (eller vatten) för att göra 10 mM stamlösning och förvarades vid -20 ° C i mörker.
- Alikvot 400 | il av de levande celler, döda celler och blandning av levande och döda celler itre separata mikrorör.
- Lägg till 2,0 ml av 10 mM PMA till varje cell alikvot till en slutlig koncentration av 50 pM.
- Inkubera proverna vid rumstemperatur under 5 minuter i mörker, skakade försiktigt några gånger, 3 sek varje gång.
- Addera 100 pl av prover på en 96-brunnars platta.
- Förslut plattan med en optisk film och sätta plattan på is.
- Ställ plattan 20 cm från en 650 W halogen ljuskälla och exponera i 2 min för ljusexponering.
- Centrifugera plattan vid 2500 xg under 10 min, försiktigt kassera supernatanten och försiktigt rinna plattan på ett stycke av absorberande papper.
- Återsuspendera cellpelletarna i 50 fil av DNA-extraktion lösning genom att pipettera upp och ner tjugo gånger med en flerkanalig Pipetman.
- Förslut plattan med en film, koka i 10 minuter i ett vattenbad och centrifugera vid 2500 xg under 2 minuter. Supernatanten i plattan är DNA från celler behandlade med PMA och redo för qPCR.
- Utför qPCR som descrisäng ovan, med användning av 5 pl av DNA.
Representative Results
Detektion av E. coli O157: H7 av qPCR använda ORF Z3276
En av de viktigaste faktorerna för denna analys är känsligheten och specificiteten hos Z3276 sonden används i qPCR. Den kan upptäcka så lite som några få kopior av genomet av DNA av E. coli O157: H7 som visas i Figur 1A. Av de 120 icke-O157-stammar som undersöktes, inklusive de sex stora icke-O157 STEC stammar, O104: H4 stammar, Salmonella och Shigella-stammar ades ingen korsreaktivitet hittas, såsom visas i tabell 1.
Kombination av PMA-behandling med qPCR
Inkubera E. coli O157: H7-celler med PMA (50 mM) under 5 minuter i mörker och exponering för ljus under 2 min valdes för PMA-behandlingsbetingelser. Dessutom ändrade vi PMA behandlingsförfarande. Jämfört med olika transparenta mikrorör som används i tvärbindningssteget genomfördes en 96-brunnar visade sig vara mer effektivt attnå den optimala tvärbindningseffekt och mer praktiskt än att hantera ett stort antal provrör under ljusexponering processen.
Förstärkning av DNA från PMA-behandlade levande och döda celler i qPCR
Effekten av PMA-medierad hämning av amplifiering av DNA från döda celler på detta qPCR-analysen visas i Figur 1 genom användning av DNA härrörande från två seriella 10-faldiga levande eller döda cellspädningar. Resultaten visar att de kurvor som genereras från de levande celler behandlade med PMA (röd linje) och utan PMA (blå kurva) verkar linjära och nästan identiska med varandra. Små skillnader CT värde visades mellan de levande celler som behandlats med PMA och utan PMA (figur 1 A), vilket tyder på att PMA behandling hade liten effekt på amplifiering av DNA av levande celler i qPCR. Men en 15 - CT-värde skillnad (32.000 gånger) visades mellan de döda celler som behandlats med PMA och utan PMA, demonstrating att PMA behandling effektivt undertryckte DNA-förstärkning från de döda celler (Figur 1B).
Detektion av levande celler från levande och döda cellblandningar i qPCR
Två uppsättningar av levande cellspädningar (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU) behandlades med PMA eller utan PMA att detektera levande celler från levande / döda cellblandningar. De qPCR resultat (Figur 2A) visade en parallell omvänt progressiv trend av CT-värden relaterade till antalet behandlade levande celler (lila staplar) till de obehandlade proverna (blå staplar). De behandlade levande celler gav en något högre CT-värden än de hos obehandlade levande celler. En liknande omvänt progressiv trend i CT-värdena observerades med det verkliga antalet levande celler i levande / döda blandningar cell behandlade med PMA (gröna staplar) samt i figur 2B. Dessutom var den nedåtgående trenden i CT-värdenobserverats med antalet levande celler i blandningarna trots närvaron av 106 döda celler. Dessa resultat visade att CT-värdena för de levande / döda cellblandningar representerade DNA från de ensamma levande celler, under det att DNA-amplifiering från de döda cellerna var effektivt undertryckas genom PMA-behandling. Men, CT-värdena för levande / döda blandningar cell behandlade med PMA var varierat och misslyckats med att återspeglade de levande cell nummer i blandningarna i figur 2B (gula staplar).
Figur 1. Levande och döda celler behandlade med PMA eller utan PMA i qPCR analys. (A) En serie av 10-faldigt utspädda levande E. coli O157: H7 cellspädningar (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU) behandlades med PMA eller utan PMA.CT-värden representerar de genomsnittliga CT-värdena för de tre exemplar på qPCR-analysen. (B) Jämförelse av DNA-amplifiering av levande celler och döda celler som behandlats med PMA och utan PMA i q jämförelse qPCR analys. ΔRn hänvisar till fluorescens intensitet förändring. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Differentiering av levande celler från levande / döda cellblandningar av PMA-qPCR Fyra uppsättningar av 10-faldiga spädningar av cellkulturer (8 x 10 0-8 x 10 6 CFU). Gjordes såsom anges. (A) Första uppsättning cellspäd behandlades med PMA, medan den andra cellen utspädning eller obehandlad innan DNA-extraktion.(B) 8 x 10 6 döda celler blandades med de tredje och fjärde grupper av cellspädningar för att göra två uppsättningar av levande / döda cellblandningar, såsom anges. En uppsättning av cellblandningar behandlades med PMA och den andra uppsättningen behandlades utan PMA innan DNA-extraktion. Varje stapel representerar de genomsnittliga CT-värden av en tre exemplar experiment ± SD.
| Organism | Serotyp | Antal testade stammar |
| E. coli | 2006 spenat O157: H7 utbrotts isolat | 186 |
| 2006 Taco Bell O157: H7-isolat | 58 | |
| 2006 Taco John O157: H7-isolat | 11 | |
| DMB stam samlingar från andra O157: H7 utbrott | 112 | |
| O104: H4 | 3 | |
| O26 | 18 | |
| O103 | 13 | |
| O111 | 24 | |
| O121 | 2 | |
| O45 | 5 | |
| O145 | 9 | |
| O113 | 2 | |
| O91 | 1 | |
| Ø55 | 9 | |
| Annat | 19 | |
| Salmonella | Typhi | 1 |
| Newport | 2 | |
| Shigella dysenteriae | 6 | 2 |
| Shigella sonnei | Okänd | 2 |
| Shigella flexneri | 4 | 1 |
| Shigella boydii | 1 | 1 |
| Totalt | 481 | |
Tkunna 1. Stammar som används för validering inom realtids-PCR-analys för identifiering av E. coli O157: H7.
Discussion
Ett primärt syfte med studien innebär användning av en ORF Z3276, en unik för E. coli O157: H7, som en enda biomarkör för qPCR analys. För närvarande är de flesta qPCR analyser targeting virulensgener, såsom stx1, stx2 och EAEA 1,2,5,6 eller delade fenotypiska gener, såsom uidA 3,4, rfbE och FLIC gener 8,9. Ibland kan en art eller stam kan inte definitivt identifieras av virulens gen (er), såsom stx 1och stx två gener, såsom de gener som är närvarande i olika arter eller stammar som 16 också. Använda rfbE och FLIC för målgener är båda gener som behövs för att kunna användas för fullständig identifikation 17. Använda ORF Z3276 som biomarkör har detta qPCR analys visats vara känslig och specifik analys (tabell 1). Denna analys har utsatts för långtgående integrering, samt exklusivitet tester, inklusive O157: H7-stammar (n = 367), över 100 icke-O157-stammar och andra patogena arter, såsom Salmonella och Shigella. Alla O157: H7-stammar som undersöktes var positivt upptäcktes, och ingen korsreaktivitet hittades från de icke-O157-stammar (tabell 1), vilket tyder på att ORF Z3276 är en unik och stark biomarkör för detektion av E. coli O157: H7.
Det andra syftet med studien är att selektivt upptäcka levande celler från döda celler av PMA-behandling innan DNA-extraktion. PMA kan penetrera in i döda celler med nedsatt membran och binder till DNA och hämmar på DNA-amplifiering av döda celler i PCR 13. Vi har modifierat PMA-behandling förfarande, och anpassas till en 96-brunnsplattformat för förfarandet. Rätt ljusintensitet exponeringen är avgörande för att uppnå den optimala tvärbindningseffekt. Tidigare har mikrorör använts i detta steg 13 till 15. Emellertid separata mikrorör är svåra att hantera i ljuset exexponering för steg, och dessa rör är inte helt transparent för att erhålla den bästa tvär böjelse. Med hjälp av en 96-brunnsplatta förbättrade vi effektiviteten för PMA-behandling. Dessa förändringar kan påverka analysen på flera sätt: de gör det lättare att erhålla en noggrann och enhetlig tvärbindande verkan, speciellt med ett stort antal prover, de behandlade proverna kan flyttas från en platta till en annan för att göra det möjligt för detektion av ett stort antal av prover, och de ger denna PMA-qPCR analys med automatiseringspotential för hela processen. Begränsningen av denna PMA-qPCR-analysen är att PMA behandling ökar PCR-analys kostnaden något och något minskad känslighet PCR-analys.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar US Department of Homeland Security för att ge en del av finansieringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
| 2x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
| PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
| Primer Express | ABI | ||
| Probes | ABI | Top of Form | |
| PMA | Biodium | 40013 | |
| Puregen cell and tissue kit | Qiagene | ||
| DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
| Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
| 650 W Halogen light source | Britek | H8061S | |
| Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
| Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |
References
- Barletta, F., et al. Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).
- Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).
- Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).
- Li, Y., Mustapha, A. Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR. J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).
- Schmidt, H., et al. Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes. Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).
- Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).
- Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide. J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).
- Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM. J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).
- Fricker, M., Messelhäußer, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).
- Li, B., Chen, J. Q. Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker. Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).
- Perna, N. T., et al. Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature. 409, 529-533 (2001).
- Wang, S., Levin, R. E. Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR. J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).
- Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).
- Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide. J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).
- Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).
- Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).
