Summary
Drosophila er berømt for sin kraftfulde genetisk manipulation, men ikke for sin egnethed dybdegående biokemisk analyse. Her præsenterer vi en TAP-baseret procedure til at identificere interagerende partnere i ethvert protein af interesse fra fluen hjernen. Denne procedure kan potentielt føre til nye muligheder for forskning.
Abstract
Genetiske skærme udført ved hjælp af Drosophila melanogaster (bananflue) har foretaget talrige milepæls opdagelser i fremskridt på biologiske videnskaber. Imidlertid blev brugen af biokemiske skærme med henblik på at udvide viden fra genetiske analyser udforsket nylig. Her beskriver vi en metode til at rense det protein kompleks, der forbinder med noget protein af interesse fra voksne flyve hoveder. Denne fremgangsmåde drager fordel af Drosophila GAL4/UAS systemet til at udtrykke et bait-protein fusioneret med et Tandem Affinitetsrensning (TAP) tag i flyve neuroner in vivo og derefter gennemfører to runder af oprensning under anvendelse af en TAP fremgangsmåde svarende til den, der oprindeligt blev etableret i gær 1 at rense interagerende protein kompleks. Ved afslutningen af denne procedure, er en blanding af flere protein komplekser opnået hvis molekylære identiteter kan bestemmes ved massespektrometri. Validering af kandidat proteinerne vil drage fordel af resource og let at udføre tab af funktion studier i fluer. Lignende metoder kan anvendes på andre flyve væv. Vi tror, at kombinationen af genetiske manipulationer og dette proteomisk tilgang i gylp modelsystemet rummer et enormt potentiale til at tackle grundlæggende problemer inden for neurobiologi og videre.
Introduction
Definition af molekylære veje eller netværk, der medierer en bestemt biologisk proces er en af de ultimative mål for biomedicinsk forskning. Flyve genetikere har stolet tungt på forward genetik, især modifikator genetiske skærme (både forstærker og suppressor skærme), at identificere faktorer, der arbejder sammen, parallelt med, eller opstrøms eller nedstrøms for et gen af interesse. Men forward genetik skærme ofte gange undlader at identificere væsentlige gener, der, når muteret, forårsager dødelighed i de tidlige udviklingsstadier, eller gener med funktionel redundans og kompensation, hvis tab af funktion kun forårsage subtile defekter, der er svære at score. En måde at overvinde denne vanskelighed er at screene for direkte interaktioner af protein-protein. For mere end et årti, en voksende liste af biokemiske metoder, herunder gær to-hybrid, fagvisning, kemisk krydsbinding, Co-IP, Tandem Affinitetsrensning (TAP) osv. er blevet anvendt til at undersøge protein-protein-interaktioner. Hver af disse metoder har sit eget sæt af styrker og svagheder i forhold til sensitivitet og specificitet. Blandt dem, TAP-metoden muliggør påvisning af fysisk interaktion under nær fysiologiske betingelser bevarer specificitet og konsekvens 2 og omfatter evnen til at udvide til high-throughput analyse 3,4.
TAP Metoden blev oprindeligt udviklet i gær ved Rigautand kolleger 1. I denne metode, er et protein af interesse udtrykkes med en TAP tag. TAP tag huser to uafhængige affinitetsbindingsfremgangsmåde domæner: et Protein et domæne, der binder sig til IgG og en calmodulin-bindende domæne. De to domæner er adskilt af en TEV (Tobacco Etch Virus) spaltningssted. En sådan kombination giver mulighed for to uafhængige runder af affinitet udrensninger i tilstrækkelig grad at reducere uspecifikke bindinger og berige specifikke bindinger 1. Til dette eksempel, TAP-metoden er en meget kraftfuld method for at identificere vivo vekselvirkningen mellem et givet protein, skønt der overudtrykker det exogene protein kan gøre det mere tilbøjelige til at associere med proteiner, der normalt ikke kompleks med dets endogene modstykke. Siden sin udvikling, har TAP-metoden været anvendt i mange andre systemer, herunder celle-kultur-baserede systemer 5,6 og andre in vivo modelsystemer 6-9. Her beskriver vi en tilpasning af TAP-metoden i Drosophila. Vi først generere pUAST-NTAP og pUAST-CTAP vektorer til at lette kloning og fusion af TAP tag til enten N-eller C-terminalen af genet af interesse. UAS-TAP-mærkede transgen udtrykkes derefter i nervesystemet under kontrol af en neuronal GAL4 driver 10. Dernæst vil et stort antal voksne flyve hoveder skal indsamles, som har et højt indhold af neurale celler og er nemme at adskille fra andre dele af kroppen efter frysning baseret på størrelsesforskelle. De voksne hoveder er homogeniseret og ryddet by sekventielle centrifugeringer og supernatanten er genstand for en TAP, der er beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Generer UAS-tap-mærket Transgene Fluer
- Generer pUAST-tap-mærkede DNA-konstruktioner.
- Beslutte, hvilken side (N-eller C-terminalen) af agn protein TAP tag skal fusioneres til, baseret på proteinets struktur / funktion. Se diskussion for flere detaljer.
- Subklone cDNA'et kodende region af genet af interesse i de multiple kloningssteder (MCS) af pUAST-NTAP eller pUAST-CTAP vektorer til at generere N-eller C-terminal-mærkede UAS-TAP transgener, hhv. Se figur 1 for detaljerede kort og brugbare restriktionssteder og læserammer.
- Generer UAS-tap-tagget transgene fluer.
- Generer transgene fluer efter standardprotokoller anvendelse af p-element-medieret indsættelse 11. En række injektion tjenester er kommercielt tilgængelige.
- Kryds neuronal GAL4 driver (dvs. BG380-GAL4) til hver enkelt transgene linje og bestemme protein udtryk niveaueraf hver linje ved Western blot (med peroxidase anti-peroxidase-antistof) og / eller immunfarvning (med anti-TAP antistof). I almindelighed er en transgen linje med et protein udtryk niveau, der er tæt på det endogene protein anbefales til TAP procedurer. Se diskussion for flere detaljer.
- PerformGAL4/UAS-based rednings eksperimenter for at bekræfte funktionaliteten af TAP-mærkede transgener, hvis tab af funktion mutanter af gener af interesse er til rådighed. Vælg et transgen, der væsentligt kan redde mutant fænotyper for følgende TAP eksperimenter.
2. Forbered Prøver for TAP Procedure
- Generer en flue bestand, der bærer både en neuronal GAL4 driver (f.eks BG380-Gal4) og den valgte TAP-mærket transgen for at lette udvidelsen af flyve prøver. Saml F1 afkom af GAL4 føreren og UAS-transgen kryds i sjældne tilfælde, hvor den ovennævnte kombination forårsager overlevelse og vækst ulempe. </ Li>
- Saml skala prøver små og optimere lysis betingelse for at solubilisere TAP-mærkede protein.
- Lav en serie af lyse-buffere ved en kombination af de ikke-ioniske detergenter NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) og Triton X-100 (0,05-0,5%). Se Tabel 1 og diskussion for mere information.
- På toppen af en CO2-pad, bruge # 5 pincet til at dissekere 20 voksne hoveder fra TAP transgen udtrykke fluer og samle dem i en 1,5 ml rør til at teste hver lysispuffer tilstand.
- Tilsæt 100 ul test lysepuffer til røret og homogeniseres hovederne ved at kæle op og ned med en plastik pistil, tilsæt derefter yderligere 100 ul test buffer.
- Spin hovedet lysatet ved 21.500 x g i 10 minutter (4 ° C) og adskille supernatanten og pelleten efter centrifugering. Tilføj 25 ul 2x SDS loading buffer til pillen og 10 ul 4x SDS loading buffer til 30 ul supernatant hhv.
- Kog de to prøver i 5 minutter og analysere dem ved siden af-Side ved hjælp af SDS-PAGE og efterfølgende Western Blot med PAP-antistof. Bestem opløseligheden ved forholdet mellem TAP-protein-niveauer i supernatanten vs pellet.
- Forbered prøve i stor skala
- Udvid og indsamle voksne fluer.
- Udvid neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene lager i flasker og flip flaskerne hver 3 dage til akkumulerende 250 flasker er anvendt til indsamlingen.
- Saml 1-3 dage gammel voksen flyver i 50 ml koniske rør, sætte røret i flydende kvælstof straks at dybfryser fluerne. Opbevar fluer i en -80 ° C fryser. Bemærk, at mængden af fluer ikke må overstige 2/3 af de 50 ml tube.
- Saml flyve hoveder (udføre dette trin på toppen af pulveriseret tøris).
- Tag de forafkølet sigter og morter og støder fra -80 ° C fryseren og læg dem på tøris, ideelt inde i en stor isspand. Stak to USA standard testsigter med en nr. 25 på the top og nr. 40 i bunden.
- Tag de frosne fluer ud og slippe dem i flydende nitrogen og holde fluerne i der for omkring 10 min. Vortex eller ryst rørene kraftigt til at bryde hoveder, ben og vinger fra ligene.
- Hæld blandingen i den øverste sigte, og derefter ryste soldene kraftigt, mens du holder begge soldene sammen. Efter sigtning, vil de organer, forblive på den øverste sigte, flyve hoveder vil blive tilbageholdt på den nederste sigte og ben, vinger og andet snavs vil falde til tøris. Adskil de to sigter og omhyggeligt overføre flyve hoveder til den kolde mørtel.
- Homogeniser flyve hoveder
- Oven på tøris, slibe hovederne med morter og pistil til pulverformige partikler, derefter overføre pulveret til et 15 ml glas Dounce vævsmølle der blev forafkølet på is.
- Mål vægtene i kværnen før og efter hovedet prøven blev hældt ind i det, og derefter beregne, hvor meget hovedet Sample vejer. I alt 6-15 gram flyve hoveder vil være tilstrækkeligt for hver TAP eksperiment tilpasning derfor at ekspressionsniveauerne af proteinet. Tilsættes 15 ml iskold homogeniseringspuffer (lysepuffer optimeret i trin 2.2) til pulver og derefter slag med den store frigang pistil, indtil det er let for pistil til at gå op og ned. Holde glasset grinder is på alle tidspunkter.
- Forbered supernatanten for TAP
- Overfør homogenatet til en højhastigheds-centrifuge-rør og centrifugering i 20 min ved ~ 50.000 xg (4 ° C). Overfør supernatanten til et nyt high-speed centrifugeglas og gentag centrifugeringen en gang mere.
- Supernatanten overføres til et ultracentrifugerør og udføre en 40 min ~ 250.000 xg spin til yderligere at rydde supernatanten. Supernatanten er klar til tandem Affinitetsoprensning procedurer efter ultracentrifugering.
- Udvid og indsamle voksne fluer.
3. TAP Oprensning De følgende afsnit blev afledt af Seraphin lab TAP protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )
- Udfør IgG vulst affinitetsoprensning
- Forbered IgG sepharose perle mens prøverne bliver centrifugeret. Vask 400 pi IgG perle 3x i et 15 ml Falcon-rør med 10 ml kold IgG vaskepuffer. For hver vask, klippe røret forsigtigt i 2 minutter og derefter spin ned perlerne ved 1.000 xg i yderligere 2 min. Ved slutningen af den tredje vask, fjerne buffer og kun efterlade perlerne i røret.
- Overføre forsigtigt klarede supernatant (~ 15 ml) i 15 ml rør, som indeholder IgG-perler. Inkubér perler og hjerne lysat mix ved 4 º C på en nutator i 2 timer.
- Opsæt en ren og tom micro kolonne med omkring 15 ml samlede volumen i det kolde rum. Indlæse IgG perleblandingen ved støt hælde blandingen ind i kolonnen, prøv ikke at fælde nogenluft bobler inde i kolonnen. Lad perlerne at bosætte sig i søjlen og buffer for langsomt dræne ved tyngdekraften flow.
- Kolonnen udvaskes grundigt med 10 ml kold IgG vaskebuffer efter hele hjernen lysat er strømmet gennem fast IgG kolonne. Gentag vask 2x. Bemærk: aldrig lade perlen tørre i luften.
- Udfør TEV spaltning
- Efter den tredje vask, vaske søjlen igen med 10 ml TEV spaltning buffer. Dette trin forbereder IgG perlen der sequestrates agn kompleks for TEV spaltning.
- Lige før den sidste dråbe TEV buffer er ved at dryppe af, sætte en hætte på bunden af søjlen for at blokere for strømmen, tilsættes 1,3 ml TEV-puffer indeholdende 130 enheder af TEV-enzymet til kolonnen og derefter sikkert cap toppen af kolonnen. Sørg for, at kolonnen er forseglet godt i begge ender.
- Drej søjlen ved 18 ° C i 2 timer for at tillade TEV enzym for at spalte peptidet på TEV stedet og frigive protein-kompleks WHIle efterlader protein A-domæne-peptid bundet til IgG-sepharose-perler.
- Udfør Calmodulin vulst affinitetsoprensning
- Forbered Calmodulin perler, mens IgG-perler inkuberes med TEV enzymet. Vask 200 pi Calmodulin perler i et 15 ml Falcon-rør 3x, hver gang med 10 ml kold calmodulinbindende buffer. For hver vask Vip forsigtigt røret i 2 min på en nutator og derefter spin ned perlerne ved 1.000 xg i 2 min. Ved slutningen af den tredje vask, tage alle bufferen og kun efterlade perlerne i røret.
- Ved slutningen af TEV inkubation (trin 3.2.3) returnere IgG kolonnen tilbage til det kolde rum og sætte det lige op. Lad perlerne nøjes med 10 min.
- Fjern det øverste låg, og derefter den nederste cap, og indsamle de 1,3 ml TEV spaltning produkt i et 15 ml Falcon rør så. Lad puffer fuldstændig afdrypning. Tilføj yderligere 200 ul TEV buffer til kolonnen til at skubbe den døde volumen af kolonnen, indsamle flav i det samme rør.
- Tilføj 4,5 ml calmodulin bindingspuffer og 4,5 pi 1 M CaCl2 til 1,5 ml TEV spaltningsprodukt indsamlet ovenfor. CaCl2 tjener til at titrere EDTA i TEV buffer. Overfør blandingen 6 ml til røret indeholdende Calmodulin perler og dreje røret ved 4 º C på en nutator i 1 time.
- Opsæt en anden ren og tom micro kolonne med omkring 10 ml samlede volumen i det kolde rum. Load kalmodulin perleblandingen til søjlen, og gør det muligt at dræne ved tyngdekraften.
- Når hele opløsningen er strømmet gennem det afgjort Calmodulin kolonnen, skylles kolonnen to gange, hver med 10 ml kold calmodulinbindende buffer. Bemærk: Undgå at forstyrre Calmodulin perler og forsøge at holde overfladen af perlerne så flad som muligt under vask.
- Eluere agn kompleks fra Calmodulin kolonne.
Lige efter vask, eluering af Calmodulin kolonnen med fem fraktioner af 200 ul kold Calmodulin elueringspuffer. For hver fraktion, forsigtigt tilsættes 200 ul elueringsbuffer til kolonnen, og eluatet opsamles med en markant 1,5 ml Eppendorf rør. Gentag dette 4x. - Analyser proteinkomplekset ved SDS-PAGE
- Tage en lille portion fra hver af de fem fraktioner (ca. 30 ul) og tilføje SDS loading buffer. Kog prøverne i 5 minutter og indlæse prøverne side-by-side med protein molekylære markører i en gradient (4-15%) SDS-PAGE-gel.
- Når prøverne er fuldt afklaret i gelen, stop elektroforese og plette gelen med eventuelle G-250-baserede følsomme kolloide Coomassiefarvning procedurer såsom "blå sølv 'farvning 13.. Sølvfarvning er valgfri, men ikke at foretrække, fordi det ikke er fuldt ud forenelig med den efterfølgende massespektrometri analyse. Opbevar resten af eluatet i en -80 ° C fryser for yderligere analyse som massespektrometri til at afdække de molekylære identiteter af det oprensede protein kompleks. See diskussion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her demonstrerer vi vores bestræbelser på at identificere Highwire-interagerende proteiner i gylp hjernen. Highwire (HIW) og hvirveldyr og hvirvelløse homologer er enorme ubiquitin ligaser, der regulerer udviklingen og reparation af nervesystemet 14. De deler et antal meget konserverede funktionelle domæner. Men deres molekylære aktioner er ikke helt klar. Arbejde udført i ormen, flyve og mus førte til den aktuelle arbejds model, HIW fungerer som en E3 ligase og som et stillads protein for at fremme dannelsen af en multi-subunit ubiquitination kompleks, som regulerer tid-og celletype-specifikke neuronale funktioner gennem kombination af interaktion med forskellige cofaktorer og rettet mod forskellige ubiquitin-substrater. At identificere den HIW-associerede ubiquitination kompleks, vi først skabt en N-terminal mærkede UAS-TAP-HIW transgen, der er fuldt funktionel med at redde hiw mutantfænotypen 15. Ca. 10 g af voksne fly hoveder, der kun udtrykker TAP eller TAP-HIW transgene proteiner blev opsamlet og udsat for TAP procedurer ved siden af hinanden som beskrevet ovenfor. Afsluttende eluater fra begge oprensninger blev analyseret ved SDS-PAGE og derefter sølvfarvning. Massespektrometri identificerede en liste over proteiner kun TAP-HIW prøve, herunder Drosophila FSN (DFsn, en F-box-protein) og Rae1 (figur 2). Efterfølgende genetiske og biokemiske analyser viste, at HIW og DFsn arbejder sammen som SCF-lignende E3 ubiquitinligase kompliceret at regulere synaptiske struktur og funktion 16, og Rae1 associerede virksomheder med HIW in vivo og fastholder synaptisk tilgroning 17. Denne funktion Rae1 er mindst delvist nået ved dets evne til at fremme HIW protein stabilitet via beskytte HIW fra autophagic nedbrydning, som afslører en ny mekanisme, der selektivt styrer HIW protein overflod under synaptisk udvikling 17..
Fig. 1. Vektorer til frembringelse af TAP-mærket transgene fluer. (A) kort af pUAST-NTAP konstruktionen. (B) Kortet over pUAST-CTAP konstruktionen. De multiple kloningssteder (MCS) i begge konstruktioner er markeret med et beslag, hvor single-cut restriktionssteder er præsenteret med rød farve. (C) Primær sekvens viser de multiple kloningssteder af TAP vektorer med læserammen af TAP tag. For at lette subkloning er to NTAP konstruktioner genereret fra den oprindelige pUAST-NTAP: pUAST-NTAP +1 og pUAST-NTAP +2. Sammen tre NTAP konstruerer dækker alle tre mulige læserammer at tilpasse brugen af MCS. Alle vektorer er konstrueret ved hjælp af NTAP eller CTAP fragmenter oprindeligt genereret påSeraphin Lab 1.. Klik her for at se større billede.
. Figur 2. Oprensning af Highwire-interagerende proteiner fra flue hjerne ved TAP rensning Voksen hoveder fra fluer udtrykker TAP. (BG380-GAL4, UAS-TAP) eller TAP-HIW (BG380-GAL4, UAS-TAP-HIW) i nervesystemet indsamles, homogeniseres, og udsat for TAP rensning, hhv. De endelige eluater blev analyseret ved en-dimensionel SDS-PAGE-gel efterfulgt af sølvfarvning. Pilen hoved angiver agn protein HIW og stjerne angiver et afkortet TAP protein grundet TEV spaltning. I TAP-HIW prøve, er en liste af proteiner identificeret ved massenspektrometri, herunder HSC-70 β-tubulin, Rae1 og DFsn (angivet med pile). Dette tal er ændret fra figur 1a i Tian et al. 17 Klik her for at se større billede.
| Buffer | Sammensætning | Kommentarer |
| Lysebuffer | 50 mM Tris-HCI pH 7,5 | BEMÆRK: 1) Tilføj DTT og protease-og proteasominhibitorer lige før brug. |
| 125 mM NaCl | 2) Viser her er en lyseringspuffer med 0,5% NP40. Se Diskussion for ændringer på ioniske detergenter. | |
| 5% glycerol | ||
| 0,5% NP40 | ||
| 1,5 mM MgCl2 | ||
| 25 mM NaF | ||
| 0,2 mM DTT | ||
| (Følgende er protease og proteasominhibitorer) | ||
| 1 mM Na 3 VO 4 | ||
| 0,05 mM MG-115 | ||
| 1 mM PMSF | ||
| Proteasehæmmer mix (Sigma P8340) | ||
| Proteasehæmmer cocktail (Roche 04693159001) | ||
| IgG vaskepuffer | 10 mM Tris-CI pH 8,0 (0,5 ml 2 M stamopløsning) | |
| 150 mM NaCI (3 ml af 5 M stamopløsning) | ||
| 0,1% NP40 (1,0 ml 10% lager) | <td>||
| H 2 0 til 100 ml endelig | ||
| TEV spaltningsbuffer | 10 mM Tris-CI pH 8,0 (0,5 ml 2 M stamopløsning) | BEMÆRK: tilføj DTT lige før brug. |
| 150 mM NaCI (3 ml af 5 M stamopløsning) | ||
| 0,1% NP40 (1,0 ml 10% lager) | ||
| 0,5 mM EDTA (100 pi 0,5 M stamopløsning) | ||
| 1 mM DTT (100 ul 1 M stamopløsning) | ||
| H 2 O til 100 ml endelig | ||
| Calmodulin bindingsbuffer | 10 mM β-mercaptoethanol (69.7 pi lager) | |
| 10 mM Tris-CI pH 8,0 (0,5 ml 2 M stamopløsning) | ||
| 150 mM NaCI (3 ml af 5 M stamopløsning) | ||
| 1 mM Mg-acetat (100 ul 1 M stamopløsning) | ||
| 1 mM imidazol (100 pi 1 M stamopløsning) | ||
| 2 mM CaCl2 (200 pi 1 M stamopløsning) | ||
| 0,1% NP40 (1 ml 10% lager) | ||
| H 2 O til 100 ml endelig | ||
| Calmodulin elueringspuffer | 10 mM β-mercaptoethanol (69.7 pi lager) | |
| 10 mM Tris-CI pH 8,0 (0,5 ml 2 M stamopløsning) | ||
| 150 mM NaCI (3 ml af 5 M stamopløsning) | ||
| 1 mM Mg-acetat (100 ul 1 M stamopløsning) | ||
| 1 mM imidazol (100 pi 1 M stamopløsning) | ||
| 10 mM EGTA (2 ml 0,5 M materiel) | 0,1% NP40 (1 ml 10% lager) | |
| H 2 O til 100 ml endelig |
Tabel 1. Sammensætning af buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tandem affinitetsrensning (TAP)-metoden giver en dobbelt rensning protokol, der tillader isolation og berigelse af protein komplekser gennem to uafhængige affinitetsoprensnings trin. Udformningen af TAP-tag er ikke begrænset til, hvad der er præsenteret i denne protokol, andre proteinstoffer bindende domæner og motiver er også gældende, hvis buffer betingelser er tilpasset. Et godt eksempel på andre TAP tags er GS-TAP tag, en kombination af et G-protein og et streptavidin-bindende motiv, designet af Giulio Superti-Furga gruppe rettet mod oprensning af protein-kompleks i dyrkede mammale cellelinier 18. GS-TAP blev senere tilpasset til at studere protein-protein interaktion i Drosophila S2-celler og embryoner 19. En nylig JOVE publikation af Bailey et al. Demonstrerede, hvordan GS-TAP procedure blev udført med cellekultur lysat 20. Her præsenterede vi brug af TAP-tag i Drosophila nervevæv (adUlt hoveder) for storstilet proteomisk screening. Denne protokol kan potentielt tilpasses til andre væv, der tillader stor skala prøveindsamling, såsom embryoner. De voksne organer indsamles på den øverste sigte (trin 2.3.2.3) kan også anvendes til TAP, som kan være en meget udfordrende opgave. Lysisbuffer skal ændres og konditioneres til at inhibere de massive proteaser er til stede i fordøjelseskanalen på det mest, og den første oprensningsprocedure betydeligt afkortede for at reducere eksponeringstiden af proteinerne til proteaser. Selvom forskellige TAP-tags kræver forskellige håndteringer og buffer betingelser for affinitet udrensninger, de generelle principper for TAP er de samme. Nedenfor vi drøfte spørgsmål, der vil påvirke kvaliteten af TAP resultater.
Succesen af TAP tilgang afhænger generere den rigtige transgen. For det første skal TAP tag selv ikke ændrer den overordnede konformation af agn protein, som er kritisk for at bevare sin evne tilat interagere med dets fysiologiske bindingspartnere. Således er det afgørende at beslutte, hvor at smelte TAP tag til genet af interesse. Beslutningen kan træffes på grundlag af tidligere undersøgelser af proteinet, især oplysninger om dets struktur eller funktionelle epitode-mærket transgener. I tilfælde sådanne oplysninger ikke er tilgængelig, tagging agn protein ved N-eller C-terminal parallelt anbefales. Derefter funktionelle redning eksperimenter kan udføres for at bestemme, hvilken transgen bør anvendes. For det andet bør ekspressionsniveauerne af det transgene protein være tæt på, at det endogene protein. Dette er særligt vigtigt, da Gal4/UAS systemet normalt drive ekspression af transgenet på forskellige tidsplaner og på et langt højere niveau i forhold til de endogene proteiner, som enten kan øge falske positiver eller forårsage uventede konsekvenser, der ændrer profilen af interaktionen protein netværk i cellerne. For eksempel kan der overudtrykker stilladser proteiner CAUSe dominerende negative effekter og overeksprimerer proteiner, der besidder enzymatiske aktiviteter, såsom kinaser, ofte gange forårsager gain-of-funktion effekter, som begge igen kan påvirke evnen til deres endogene bindende partnere til at interagere med dem. Således bør GAL4/UAS systemet undgås, når timingen og niveauet af ekspressionen af genet af interesse er afgørende for bevarelsen af de endogene interaktioner, der kun er til stede under normale forhold. I stedet bør ekspression af TAP-mærkede transgen styres under sin egen promotor. Dette kan opnås enten ved at erstatte UAS-sekvensen med det endogene promoter sekvens eller ved at fusionere TAP sekvens i ramme med exonal sekvens i et genomisk DNA-fragment, der indeholder hele loci af genet af interesse 21. I nogle tilfælde kan TAP eksperimentet udføres i et tab af funktion mutant baggrund af genet af interesse for at reducere konkurrence fra det endogene protein for incorporating i multiprotein komplekser. Til dette eksempel, et protein null baggrund, hvis de er tilgængelige, giver den ideelle tilstand til helt at fjerne den endogene protein. Ved hjælp af genetiske mutant baggrunden vil altid øge chancen for at frembringe resultater med højere kvalitet.
Opløselighed af agn protein er en anden afgørende faktor for succes. Ikke-ioniske detergenter anvendes normalt i lysisbuffer at opløse plasmamembranen og fastholde protein-kompleks, opløselige og intakt, i en tilstand, der er tæt på det fysiologiske miljø. Sammensætningen og koncentrationen af ikke-ioniske detergenter kan imidlertid afhængig af, hvorvidt de proteiner af interesse er membran-integreret eller-associerede proteiner være af afgørende betydning for at opløseliggøre bait-proteinet. 0,1-0,3% NP40 er ofte tilstrækkelig til at solubilisere cytosoliske proteiner. For membranproteiner, der er en kombination af NP40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%), og Triton-X 100 (0,05-0,5%) undertiden kræves til solubiLize og berige nok proteiner til TAP eksperiment. Da en streng lyseringsbuffer tendens til at forstyrre svagere protein-protein interaktioner, behov for en balance imidlertid nås, hvor tilstrækkelig opløselige bait proteiner er til stede i prøven, mens på samme tid et flertal af protein-protein interaktioner er bevaret. Et generelt princip er, at altid forsøge at bruge færrest typer af vaskemidler med den laveste koncentration.
For at lette fejlfinding, er det stærkt anbefales at gemme en lille portion af prøve fra hvert trin af de to oprensninger. Efterfølgende SDS-PAGE og proteinfarvning / Western-analyse af de portioner tillade niveauer af agn proteiner og den sekventielle tilsætning af visse protein-arter, der skal overvåges. For eksempel hvis der ikke blev påvist en pludselig reduktion af agn protein i alikvot af strømningen ud efter TEV spaltning (trin 3.3.3), er det sandsynligt, at agn protein, blev tabt under IgG perle vask (trin 3.1.4) . En EventueltIBLE årsag kunne være utilstrækkelig detergentsammensætning af IgG vaskepuffer. Der er en kraftig nedgang på sammensætningen og koncentrationen af de vaskemidler IgG vaskepuffer (0,1% kun NP-40) sammenlignet med lysisbuffer. Lokkemaden protein kan være følsomme over for disse ændringer og adskille fra IgG-delen på perlerne. Justering af IgG vask mod lysisbuffer kan hjælpe med at løse problemet. Alternativt, dog mindre sandsynligt, TEV spaltning (trin 3.2) måske ikke har arbejdet tilstrækkeligt til at frigive agn-holdigt kompleks fra IgG-perler. Trinene værd en anden inspektion er ligevægt af IgG perler med TEV buffer (trin 3.2.1) og enzymaktiviteten kan fejlhåndtering deaden enzymet.
Husk, at selv med to-trins rensning, vil der stadig være falske positiver og proteiner, der er trukket ned uspecifikt til stede i den endelige TAP-renset kompleks. En måde at identificere de uspecifikke interaktioner, pådet mindste delvist, er at inkludere en kontrol TAP hjælp af TAP-only transgen parallelt med TAP-mærkede transgen i hanen rensning eksperimenter. Proteiner identificeret i TAP-only procedure bør fjernes fra listen identificeret i TAP-transgen rensning.
En vellykket TAP vil rense en blanding af proteiner, der er potentielt associeret med proteinet af interesse in vivo. Det næste trin er den molekylære identifikation af disse proteiner, og massespektrometri er almindeligt anvendt til dette formål. Afhængigt af resultaterne fra SDS-PAGE og forsøget behov, kan de molekylære identiteter i det oprensede protein kompleks bestemmes i de følgende to måder: 1) hvert enkelt protein bånd kan skæres ud fra gelen og udsat for en lav- kompleksitet LC-MS/MS, eller 2) elueres fraktionen, der indeholder det højeste indhold af protein (normalt anden eluering) direkte kan udsættes for moderat kompleksitet LC-MS/MS. Et sådant shot-gun proteomic tilgang vil potentielt identificere alle de proteiner i komplekset, afhængigt af det dynamiske område for MS udstyr 22.
Sammenfattende præsenterer vi en metode til at identificere protein-protein interaktioner i neurale væv af en genetisk model organisme - bananfluen. Der er en række fordele ved at anvende TAP metode til at flyve: 1) bananfluer har en kort livscyklus, så det er relativt nemt og hurtigt at generere transgene fluer og for at opnå væv i stor mængde, som begge er afgørende for TAP tilgang, 2) flyve genomet er fuldt kommenteret og indeholder 70% af humane sygdomsfremkaldende gener og 3) vigtigst, er det let at funktionelt validere og karakterisere kandidaten interagerende proteiner i fluer. Der er omfattende ressourcer til rådighed i gylp forskningsverdenen til karakterisering af et givet gen, såsom transgene baseret RNAi samling nyttigt at studere vævsspecifik tab af funktion af et flertal af genets, mutant og mangel alleler for det meste af gen loci, såvel som cDNA-kloner og transgener anvendelige til gain-of-funktion undersøgelser. Vi mener, at fluen TAP-metoden vil være en værdifuld tilføjelse til værktøjskasse bruges i flyve laboratorier. I fremtidsperspektiv, kan denne metode kombineres med flyve adfærdsmæssige paradigmer og menneske-sygdomsmodeller til at screene ændringen i protein-protein interaktion netværk som svar på specifikke forhold og stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker EUROSARF til at sende os gær TAP ekspressionsplasmider. Vi er også taknemmelige for redaktionel hjælp fra Ryan Labadens. Dette arbejde blev understøttet af en NIH / NINDS tilskud (R01NS070962) til CW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
