Summary
Drosophila er kjent for sin kraftige genetisk manipulasjon, men ikke for sin egnethet av detaljert biokjemisk analyse. Her presenterer vi en TAP-basert prosedyre for å identifisere samspill partnere av noe protein av interesse fra fly hjernen. Denne fremgangsmåten kan potensielt føre til nye muligheter for forskning.
Abstract
Genetiske skjermer utført ved hjelp av Drosophila melanogaster (bananflue) har gjort mange milepæl funn i forkant av biologiske vitenskaper. Imidlertid ble bruken av biokjemiske skjermer som tar sikte på å utvide kunnskapen fra genetisk analyse undersøkt først nylig. Her beskriver vi en metode for å rense protein kompleks som forbinder med noe protein av interesse fra voksne fluehoder. Denne metoden tar fordel av Drosophila GAL4/UAS system for å uttrykke et agn protein smeltet sammen med en Tandem Affinitetsrensing (TAP) tag i flue nevroner in vivo, og deretter gjennomfører to runder med rensing ved hjelp av en TAP prosedyre lik den opprinnelig etablert i gjær 1 for å rense samspill proteinkompleks. Ved slutten av denne prosedyren, er en blanding av flere protein-komplekser erholdt som molekylære identiteter kan bestemmes ved massespektrometri. Validering av kandidatproteiner vil dra nytte av resource og enkelhet i tap-av-funksjon studier i fluer. Lignende tilnærminger kan brukes på andre fly vev. Vi tror at kombinasjonen av genetiske manipulasjoner og dette proteomikk tilnærming i fly modellsystemet har enorm potensial for å håndtere grunnleggende problemer innen nevrobiologi og utover.
Introduction
Definere molekylære stier eller nettverk som formidler en bestemt biologisk prosess er en av de endelige målene for biomedisinsk forskning. Fly genetikere har vært avhengig tungt på termin genetikk, spesielt MODIFIER genetiske skjermer (både Enhancer og suppressor skjermer), for å identifisere faktorer som virker sammen, parallelt med, eller oppstrøms eller nedstrøms av et gen av interesse. Men termin genetikk skjermer ofte ikke klarer å identifisere viktige gener som, når mutert, føre til dødelighet på tidlige utviklingsstadier, eller gener med funksjonell redundans og erstatning som tap av funksjon bare føre til subtile feil som er vanskelig å score. En måte å løse dette problemet er å skjerme for direkte protein-protein interaksjoner. For mer enn et tiår, en voksende liste av biokjemiske metoder, inkludert gjær to-hybrid, fag-skjerm, kjemisk kryssbinding, Co-IP, Tandem Affinitetsrensing (TAP), osv.. er blitt brukt for å undersøke proteiner-protein interaksjoner. Hver av disse metodene har sitt eget sett av styrker og svakheter i forhold til sensitivitet og spesifisitet. Blant dem, tillater TAP metode for deteksjon av fysisk interaksjon i henhold til nær-fysiologiske betingelser, opprettholder spesifisitet og konsistens 2 og innbefatter evnen til å strekke seg i high-throughput-analyser 3,4.
TAP-metoden ble opprinnelig utviklet i gjær ved Rigautand kolleger en. I denne metoden, er et protein av interesse uttrykt med et TAP tag. TAP tag havner to uavhengige affinitet-bindende domener: Et protein et domene som binder seg til IgG og en calmodulin-bindende domene. De to domener er atskilt med en TEV (Tobacco Etch Virus) cleavage nettstedet. En slik kombinasjon gir mulighet for to uavhengige runder med affinitet renselser til tilstrekkelig redusere uspesifikke bindinger og berike bestemte bindinger en. For dette tilfellet, er det TAP metoden en meget kraftig method å identifisere in vivo interaksjoner av et gitt protein, selv om overekspresjon den eksogene protein kan gjøre det mer utsatt for å assosiere med proteiner som normalt ikke gjør det komplisert med sin endogen motstykke. Siden utviklingen har TAP metoden blitt brukt i mange andre systemer, inkludert celle-kultur-baserte systemer 5,6 og andre in vivo modellsystemer 6-9. Her beskriver vi tilpasningen av TAP-metoden i Drosophila. Vi genererer du først pUAST-NTAP og pUAST-CTAP vektorer å lette kloning og fusjon av TAP tag til enten N-eller C-terminal av genet av interesse. Den UAS-TAP-merket transgenet er da uttrykt i nervesystemet under kontroll av en nevronale Gal4 driver 10. Deretter vil et stort antall voksne fluehoder samles, som har høyt innhold av nerveceller og er lett å skille fra andre deler av kroppen etter frysing basert på størrelsesforskjeller. De voksne hoder er homogenisert og ryddet by sekvensiell sentrifugering, og supernatanten er gitt med TAP fremgangsmåte som er beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Generere UAS-TAP-merket Transgene Flies
- Generere pUAST-TAP-merket DNA-konstruksjoner.
- Avgjør hvilken side (N-eller C-terminus) av agnet protein TAP-koden må bli smeltet til, på grunnlag av proteinets struktur / funksjons. Se diskusjonen for flere detaljer.
- Subklon cDNA-kodende område av genet av interesse inn i det multiple kloningssteder (MCS) av pUAST-NTAP eller pUAST-CTAP vektorer for å generere N-eller C-terminal-merkede UAS-TAP-transgener hhv. Se figur 1 for detaljerte kart og brukrestriksjonsseter og leserammer.
- Generere UAS-TAP-merket transgene fluer.
- Generere transgene fluer følgende standard protokoller som bruker P-element-mediert innsetting 11. Et antall injeksjons tjenester er kommersielt tilgjengelige.
- Kryss neuronal Gal4 driver (dvs. BG380-Gal4) til hver enkelt transgene linjen og bestemme protein uttrykk nivåerav hver linje ved western blot (med peroksidase anti-peroksidase-antistoff) og / eller farging (med anti-TAP-antistoff). Generelt, blir et transgen linje med et protein expression nivå som er nær den endogene protein anbefales for TAP-prosedyrer. Se diskusjonen for flere detaljer.
- PerformGAL4/UAS-based rednings eksperimenter for å bekrefte funksjonaliteten til TAP-merket transgener dersom tap-av-funksjon mutanter av gener av interesse er tilgjengelig. Velg et transgen som kan vesentlig redde den muterte fenotyper for følgende TAP eksperimenter.
2. Forbered Prøver for TAP Prosedyre
- Generere en flue aksje som både bærer et nevronale Gal4 driver (f.eks BG380-Gal4) og den valgte TAP-merket transgenet for å lette utvidelse av flueprøver. Samle F1 progenies av Gal4 driver og UAS-transgen kryss i sjeldne tilfeller når de ovennevnte kombinasjonen fører til overlevelse og vekst ulempe. </ Li>
- Samle små skjellprøver og optimalisere lyse betingelse for oppløseliggjøre TAP-merket protein.
- Foreta en rekke lysis buffer ved bruk av en kombinasjon av de ikke-ioniske vaskemidler NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) og Triton X-100 (0,05 til 0,5%). Se tabell 1 og diskusjon for mer informasjon.
- På toppen av en CO2-pad, bruk # 5 pinsett til å dissekere 20 voksne hoder fra TAP transgenet uttrykke fluer og samle dem i en 1,5 ml tube å teste hver lysis buffer tilstand.
- Tilsett 100 ul testlyseringsbuffer til røret og homogen hodene ved å stryke opp og ned med en plast pistill, deretter til en annen på 100 ul testbuffer.
- Spin hodet lysatet ved 21 500 xg i 10 minutter (4 ° C), og separere supernatanten og pelleten etter sentrifugering. Tilsett 25 ul 2x SDS loading buffer til pelleten, og 10 pl 4 x SDS loading buffer til 30 ul av supernatanten hhv.
- Kok de to prøvene i 5 min, og analysere dem side ved-Side ved hjelp av SDS-PAGE og påfølgende Western Blot med PAP antistoff. Bestem oppløselighet ved forholdet av TAP-protein-nivåer i supernatanten mot pelleten.
- Forbered utvalget i stor skala
- Utvid og samle voksne fluer.
- Utvid neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene lager i flasker og snu flaskene hver 3 dager til akkumulerende 250 flasker brukes for samlingen.
- Samle 1-3 dager gammel voksen flyr inn 50 ml koniske rør, sette røret i flytende nitrogen umiddelbart å fryser fluene. Oppbevar fluer i en -80 ° C fryser. Legg merke til at volumet av fluene ikke må overskride 2/3 av 50 ml tube.
- Samle fluehoder (utføre dette trinnet på toppen av pulverisert tørris).
- Ta ut de prechilled sikter og morter fra -80 ° C fryser og sette dem på tørris, ideelt sett inne i en stor ice bøtte. Stable to USA standard testsikter med en nr. 25 på the topp og nr. 40 i bunnen.
- Ta de frosne fluer ut og slippe dem i flytende nitrogen og holde fluene der i ca 10 min. Vortex eller riste rørene kraftig for å bryte hoder, bein og vinger fra likene.
- Hell blandingen til den øverste sil, og deretter riste såldene kraftig ved å holde begge sikter sammen. Etter sikting, vil legemene være på den øverste sil, fly hoder vil bli beholdt på den nederste sikt og ben, vinger og annet avfall vil falle til tørris. Skill de to siktene og nøye overføre flue hodene til den kalde mørtel.
- Homogenisere fluehoder
- På toppen av tørris, male hodene med morter og støter for å pulverpartikler, deretter overføre pulveret til en 15 ml glass Douce-Tissue Grinder som ble prechilled på is.
- Mål vektene til kvernen før og etter hode prøven ble helt over i den, og deretter beregne hvor mye hodet sample veier. Totalt 6-15 gram fluehodene vil være tilstrekkelig for hver TAP eksperiment justering i henhold til uttrykket nivåer av proteinet. Tilsett 15 ml iskald homogenisering buffer (lysebuffer optimalisert i trinn 2.2) til pulveret, og deretter slag med stor klaring pistill inntil det er lett for de støter for å gå opp og ned. Hold glasset jeksel på is til alle tider.
- Forbered supernatanten for TAP
- Overfør homogenatet til en høyhastighets-sentrifuge-rør, og spinn i 20 minutter ved ~ 50 000 xg (4 ° C). Overfør supernatanten til et nytt høyhastighetssentrifugerøret og gjenta sentrifugering en gang til.
- Overfør supernatanten til et ultrasentrifugerør og utføre en 40 min ~ 250.000 xg spin å fjerne supernatanten videre. Supernatanten er klar for tandem affinitetsrensing prosedyrer etter ultrasentrifugering.
- Utvid og samle voksne fluer.
Tre. TAP Rensing Følgende avsnitt ble avledet fra Séraphin lab TAP protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )
- Utfør IgG perle affinitetsrensing
- Forbered IgG sepharose vulsten, mens prøvene blir sentrifugert. Vask 400 pl IgG-bead 3x i et 15 ml Falcon rør med 10 ml kald IgG vaskebuffer. For hver vask, rocke rør forsiktig i 2 minutter, og deretter spinne ned perlene på 1000 xg for en annen 2 min. Ved slutten av den tredje vask, fjerne buffer og la bare perlene i røret.
- Overføre forsiktig fjernet supernatanten (~ 15 ml) i 15 ml rør inneholdende IgG-perler. Inkubering av kulene og hjerne-lysat blanding ved 4 ° C på en nutator i 2 timer.
- Sett opp en ren og tom mikro kolonne med ca 15 ml totalt volum i kjølerommet. Laste IgG perleblandingen ved stadig å helle blandingen inn i kolonnen, prøv ikke å felle noenluftbobler inne i kolonnen. Tillate kulene å slå seg ned i søylen og buffer sakte renne strømmen.
- Vask kolonnen grundig med 10 ml kaldt IgG vaskebuffer etter hele hjernen lysat har strømmet gjennom avgjort IgG-kolonnen. Gjenta vaske 2x. Merk: aldri la perle tørt i luften.
- Utfør TEV cleavage
- Etter den tredje vask, vaskes kolonnen på nytt med 10 ml TEV spalting buffer. Dette trinnet forbereder IgG perle som sequestrates agnet kompleks for TEV cleavage.
- Rett før den siste dråpe TEV buffer er i ferd med å dryppe ut, sette en hette i bunnen av kolonnen for å blokkere strømningen, tilsett 1,3 ml TEV buffer inneholdende 130 enheter av enzymet TEV til kolonnen, og deretter sikkert lokket øverst kolonnen. Kontroller at kolonnen er forseglet godt i begge ender.
- Drei-kolonnen ved 18 ° C i 2 timer for å tillate at TEV enzym for å spalte peptidet ved TEV side og slipper proteinkompleks while etterlot protein A domain peptide bundet til IgG-Sepharose-perler.
- Utfør Calmodulin perle affinitetsrensing
- Klargjør Calmodulin perler, mens IgG-perlene inkuberes med TEV enzymet. Vask 200 mL calmodulin-perler i et 15 ml Falcon rør 3x, hver gang med 10 ml kald Calmodulin bindingsbuffer. For hver vask, rist røret i 2 min på en nutator, og så spinne ned perlene ved 1000 x g i 2 min. Ved slutten av den tredje vask, ta ut hele bufferen og la bare perlene i røret.
- På slutten av TEV inkubasjon (trinn 3.2.3), returnere IgG kolonnen tilbake til det kalde rommet og sette den rett opp. La perlene sedimentere i 10 min.
- Fjern topplokket og deretter bunnlokket, og deretter samle inn 1,3 ml TEV cleavage produktet i et 15 ml Falcon rør. La bufferen tømmes helt. Til en ytterligere 200 ul TEV buffer til kolonnen for å presse ut de døde volumet av kolonnen, samle flav ut i samme rør.
- Til 4,5 ml av Calmodulin bindende buffer og 4,5 pl 1 M CaCl 2 til 1,5 ml TEV spaltningsprodukt oppsamlet ovenfor. Den CaCl 2 tjener til å titrere EDTA i TEV buffer. Overfør 6 ml blandingen til røret inneholdende de calmodulin-perler og rotere røret ved 4 ° C på en nutator i 1 time.
- Sett opp en annen ren og tom mikro kolonne med ca 10 ml totalt volum i kjølerommet. Laste Calmodulin perleblandingen til kolonnen og la det renne.
- Når all oppløsningen har strømmet gjennom avgjort Calmodulin kolonnen, vaskes kolonnen to ganger, hver med 10 ml kald Calmodulin bindingsbuffer. Merk: Unngå å forstyrre calmodulin perler og prøve å holde overflaten av perlene så flat som mulig under vask.
- Elueres agnet kompleks fra Calmodulin kolonne.
Rett etter vask, elueres Calmodulin kolonne med fem fraksjoner av 200 mL kald Calmodulin elueringsbuffer. For hver fraksjon, tilsett 200 pl elueringsbuffer til kolonnen og samler eluatet med en merket 1,5 ml Eppendorf-rør. Gjenta dette 4x. - Analyser protein-komplekset ved hjelp av SDS-PAGE
- Ta en liten alikvot fra hver av de fem fraksjonene (ca. 30 mL) og tilsett SDS loading buffer. Kok prøvene i 5 min og laste prøvene side-ved-side med proteinmolekylmarkører i en gradient (4-15%) SDS-PAGE-gel.
- Etter at prøvene er fullstendig løst i gel, stoppe elektroforese og beis gel med noen G-250-baserte sensitive kolloidale Coomassie farvningsprosedyrer som "blå sølv 'flekker 13. Sølv farging er valgfritt, men ikke å foretrekke, fordi den ikke er fullt ut kompatibelt med den etterfølgende massespektrometri-analyse. Oppbevar resten av eluatet i en -80 ° C fryser for videre analyse slik som massespektrometri for å avdekke de molekylære identiteter av det rensede protein kompleks. See diskusjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi vår innsats i å identifisere Highwire-samspill proteiner i fly hjernen. Highwire (hiw) og dets virveldyr og virvelløse homologer er store ubiquitin ligaser som regulerer utviklingen og reparasjon av nervesystemet 14. De deler en rekke høyt konservert funksjonelle domener. Men deres molekylære handlinger er ikke helt klart. Arbeid utført i ormen, fly og mus førte til den aktuelle arbeidsmodell som HIW fungerer som en E3 ligase og som et stillas protein for å lette dannelse av en multi-subenhet ubiquitinering kompleks, som regulerer tids og celletypespesifikke nevronale funksjoner via Kombinasjonen av å samhandle med ulike kofaktorer og målretting ulike ubiquitin underlag. Å identifisere hiw-forbundet ubiquitinering kompleks, vi først genererte en N-terminal merket UAS-TAP-hiw transgenet som er fullt funksjonell i å redde den hiw mutant fenotype 15. Om 10 g voksen fly hoder som uttrykker TAP bare eller TAP-hiw transgene proteiner ble samlet og utsatt for TAP prosedyrer ved siden av hverandre som beskrevet ovenfor. Endelige eluater fra begge rensinger ble analysert ved SDS-PAGE og deretter sølvfarging. Massespektrometri identifisert en liste med proteiner i TAP-hiw prøven bare, inkludert Drosophila FSN (DFsn, en F-boks protein) og Rae1 (figur 2). Påfølgende genetiske og biokjemiske analyser viste at hiw og DFsn jobbe sammen som SCF-lignende E3 ubiquitin ligase komplisert å regulere synaptic struktur og funksjon 16, og Rae1 forbinder med hiw in vivo og begrenser synaptic gjengroing 17. Denne funksjon av Rae1 er i det minste delvis oppnås ved dens evne til å fremme HIW proteinstabilitet via beskytte HIW fra autophagic degradering, noe som avslører en ny mekanisme som selektivt styrer HIW protein overflod under synaptiske utvikling 17..
Figur 1. Vektorer for å generere TAP-merket transgene fluer. (A) Kartet over den pUAST-NTAP konstruere. (B) Den kart over pUAST-CTAP konstruere. De mange kloning sider (MCS) i begge konstruerer er merket med en brakett, hvor single-cut restriksjonsseter presenteres med rød farge. (C) Primær sekvens som viser flere kloning områder av springen vektorer med leserammen av TAP tag. For å lette subkloning, er to flere NTAP konstruerer generert fra den opprinnelige pUAST-NTAP: pUAST-NTAP en og pUAST-NTAP +2. Sammen de tre NTAP konstruerer dekker alle tre mulige leserammer for å imøtekomme ved bruk av MCS. Alle vektorer er konstruert ved hjelp av NTAP eller CTAP fragmenter opprinnelig ble generert påSeraphin Lab en. Klikk her for å se større bilde.
. Figur 2 Rensing av Highwire-samspill proteiner fra fly hjernen ved TAP rensing Voksen hoder fra fluer uttrykker TAP. (BG380-Gal4; UAS-TAP) eller TAP-hiw (BG380-Gal4; UAS-TAP-hiw) i nervesystemet er samlet, homogenisert og utsatt for TAP rensing, respektivt. De endelige eluater ble analysert ved en-dimensjonal SDS-PAGE-gel, etterfulgt av sølvfarging. Pilen hodet indikerer agn protein hiw og stjernen angir en avkortet TAP protein på grunn av TEV cleavage. I TAP-hiw prøven, er en liste over proteiner identifisert av massespektrometri, inklusive HSC-70, β-tubulin, Rae1 og DFsn (angitt med pilene). Dette tallet er endret fra Figur 1a av Tian et al. 17 Klikk her for å se større bilde.
| Buffer | Sammensetning | Kommentarer |
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl pH 7.5 | MERK: 1) Legg DTT og protease og proteasomhemmere like før bruk. |
| 125 mM NaCl | 2) Viser her er en lysis buffer med 0,5% NP40. Se diskusjon for modifikasjoner på ioniske vaskemidler. | |
| 5% Glyserol | ||
| 0,5% NP40 | ||
| 1,5 mM MgCl 2 | ||
| 25 mM NaF | ||
| 0,2 mM DTT | ||
| (Følgende er protease og proteasomhemmere) | ||
| 1 mM Na 3 VO 4 | ||
| 0,05 mM MG-115 | ||
| 1 mM PMSF | ||
| Proteasehemmer mix (Sigma P8340) | ||
| Proteasehemmer cocktail (Roche 04693159001) | ||
| IgG vaskebuffer | 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml av 2 M lager) | |
| 150 mM NaCl (3 ml 5 M lager) | ||
| 0,1% NP40 (1,0 ml av 10% stock) | <td>||
| H 2 0 til 100 ml finalen | ||
| TEV cleavage buffer | 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml av 2 M lager) | MERK: legg DTT like før bruk. |
| 150 mM NaCl (3 ml 5 M lager) | ||
| 0,1% NP40 (1,0 ml av 10% stock) | ||
| 0,5 mM EDTA (100 pl av 0,5 M lager) | ||
| 1 mM DTT (100 ul av 1 M lager) | ||
| H 2 O til 100 ml finalen | ||
| Calmodulin binding buffer | 10 mM β-mercaptoethanol (69,7 mL av lager) | |
| 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml av 2 M lager) | ||
| 150 mM NaCl (3 ml 5 M lager) | ||
| 1 mM Mg-acetat (100 mL av en M lager) | ||
| 1 mM imidazol (100 ul av 1 M lager) | ||
| 2 mM CaCl 2 (200 ul av 1 M lager) | ||
| 0,1% NP40 (1 ml av 10% stock) | ||
| H 2 O til 100 ml finalen | ||
| Calmodulin elueringsbuffer | 10 mM β-mercaptoethanol (69,7 mL av lager) | |
| 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml av 2 M lager) | ||
| 150 mM NaCl (3 ml 5 M lager) | ||
| 1 mM Mg-acetat (100 mL av en M lager) | ||
| 1 mM imidazol (100 ul av 1 M lager) | ||
| 10 mM EGTA (2 ml av 0,5 M lager) | 0,1% NP40 (1 ml av 10% stock) | |
| H 2 O til 100 ml finalen |
Tabell 1. Sammensetning av buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tandem affinitetsrensing (TAP) metoden gir en dobbel rensing protokoll som tillater isolering og anrikning av proteinkomplekser gjennom to uavhengige affinitet rensetrinn. Utformingen av TAP tag er ikke begrenset til det som er presentert i denne protokollen, andre proteinbindingsdomener og motiver er også aktuelt hvis bufferbetingelser er justert tilsvarende. Et godt eksempel på andre TAP koder er GS-TAP tag, en kombinasjon av en G protein og en streptavidin-bindende motiv, designet av Giulio Superti-Furga gruppe rettet mot rensing av protein kompleks i dyrkede pattedyrcellelinjer 18. GS-TAP ble senere tilpasset studere protein og protein i Drosophila S2 celler og embryoer 19. En fersk Jove publikasjon av Bailey et al. Demonstrert hvordan GS-TAP prosedyren ble utført med celle dyrkingslysatet 20. Her vi presenterte bruk av trykk-tag i Drosophila nervevev (adult hoder) for storskala proteomikk screening. Denne protokollen kan potensielt tilpasses andre vev som gjør det mulig i stor skala prøvesamling, som embryoer. De voksne organer som samles på toppen sil (trinn 2.3.2.3) kan også anvendes for TAP, som kan være en meget vanskelig oppgave. Den lyseringsbuffer må modifiseres, og kondisjonert til å inhibere de massive proteaser som er tilstede i tarmkanalen på det meste, og den første rensemetode bli betydelig forkortet, for å redusere eksponeringstiden av proteinene til de proteaser. Selv om ulike TAP koder krever ulike handlings og buffer forhold for affinitet renselser, de generelle prinsippene for TAP er den samme. Nedenfor diskuterer vi saker som vil påvirke kvaliteten på TAP resultater.
Suksessen av TAP tilnærming avhenger generere riktig transgenet. For det første må den TAP-koden i seg selv ikke endrer den totale konformasjon av agnet protein, noe som er viktig for å beholde sin evneå samhandle med sine fysiologiske bindende partnere. Dermed er det viktig å bestemme hvor du skal smelte TAP tag til genet av interesse. Avgjørelsen kan gjøres basert på tidligere studier av protein, spesielt informasjon om sin struktur eller funksjonelle epitode-merket transgener. Dersom slik informasjon ikke er tilgjengelig, tagging agnet protein ved N-eller C-terminale parallelt anbefales. Deretter funksjonelle rednings eksperimenter kan utføres for å avgjøre hvilken transgenet skal brukes. For det andre bør uttrykket nivåer i transgene protein er nær den av den endogene protein. Dette er særlig viktig som Gal4/UAS systemet normalt drive ekspresjonen av transgenet ved forskjellige tidspunkt og på et mye høyere nivå sammenlignet med de endogene proteiner, som enten kan øke falske positive eller forårsake uventede konsekvenser som endrer profil av protein interaksjon nettverk i cellene. For eksempel kan overekspresjon stillasproteiner bevirkee dominerende negative effekter og overekspresjon proteiner som besitter enzymatiske aktiviteter, som for eksempel kinaser, ofte føre til gevinst-av-funksjon effekter, som begge kan i sin tur påvirker evnen deres endogene bindende partnere til å samhandle med dem. Således bør GAL4/UAS systemet unngås når det tidspunkt og nivået av ekspresjon av genet av interesse er kritisk for bevaring av de endogene interaksjoner som bare til stede under normale forhold. I stedet bør ekspresjon av TAP-merket transgenet bli styrt under sin egen promoter. Dette kan oppnås enten ved å bytte ut UAS-sekvensen med den endogene promoter-sekvens, eller ved å smelte sammen i TAP-sekvensen i ramme med de exonal sekvens i et genomisk DNA-fragment som inneholder hele loci av genet av interesse 21.. I noen tilfeller kan den TAP forsøket utføres i et tap av funksjon mutant bakgrunn av genet av interesse å redusere konkurranse fra det endogene protein for incorporating inn multiprotein komplekser. For dette tilfellet, et protein null bakgrunn, hvis tilgjengelig, tilbyr en ideell tilstand å fullstendig eliminere den endogene protein. Ved hjelp av den genetiske mutant bakgrunn vil alltid øke sjansen for å produsere resultater med høyere kvalitet.
Løselighet av agn protein er en annen avgjørende faktor for suksess. Ikke-ioniske vaskemidler er vanligvis benyttet i lyseringsbuffer for å oppløse plasmamembranen og beholde proteinkomplekset, oppløselig og intakt, i en status som er i nærheten av den fysiologiske miljø. Imidlertid, avhengig av hvorvidt proteinene av interesse er membran-koblings-og-assosierte proteiner, kan sammensetningen og konsentrasjonen av ikke-ioniske vaskemidler være avgjørende for å oppløseliggjøre agnet protein. 0,1-0,3% NP40 ofte er tilstrekkelig for å oppløseliggjøre cytosoliske proteiner. For membranproteiner, er en kombinasjon av NP40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) og Triton-X 100 (0,05 til 0,5%) av og til kreves for å solubiLize og berike nok proteiner for TAP eksperiment. Ettersom et strengt lysis buffer har en tendens til å forstyrre svakere protein-protein interaksjoner, trenger en balanse som skal nås i hvilken tilstrekkelig oppløselige agn proteiner er til stede i prøven, mens på samme tid de fleste av protein-protein interaksjoner blir beholdt. Et generelt prinsipp er som alltid prøver å bruke færrest typer vaskemidler med lavest konsentrasjon.
For å lette feilsøking, er det sterkt anbefalt å spare en liten delmengde av prøven fra hvert trinn av de to renselser. Påfølgende SDS-PAGE-og proteinfarging / Western-analyse på alikvoter tillate nivåer av agnet protein og den sekvensielle anrikning av visse proteintype som skal overvåkes. For eksempel, hvis en plutselig reduksjon av agnet protein ble detektert i aliquot av strømningsavbrudd TEV spalting (trinn 3.3.3), er det sannsynlig at agnet protein ble tapt i løpet av IgG vulsten vasking (trinn 3.1.4) . En possible årsak kan være utilstrekkelig vaskemiddelblanding av IgG vaskebuffer. Det er et sterkt fall av sammensetningen og konsentrasjonen av vaskemidlene i IgG vaskebuffer (0,1% NP-40 bare) sammenlignet med lyseringsbuffer. Agnet protein kan være følsomme for disse endringene og fjerne fra IgG-delen på perlene. Justering av IgG vasking mot lysis buffer kan bidra til å løse problemet. Alternativt, men mindre sannsynlig, TEV spalting (trinn 3.2) ikke har virket i tilstrekkelig grad til å frigjøre agnet holdig kompleks fra IgG-perler. Trinnene verdt en andre inspeksjons er ekvilibreringen av IgG-perler med den TEV buffer (trinn 3.2.1), og enzymaktiviteten, kan mishandling deaden enzymet.
Husk at selv med to-trinns rensing, vil det fortsatt være falske positiver og proteiner som er trukket ned nonspecifically stede i den endelige TAP-renset kompleks. En måte for å identifisere de uspesifikke interaksjoner, iminste delvis, er å inkludere en kontroll TAP bruker TAP-bare transgen parallelt med TAP-merket-transgen i springen rensing eksperimenter. Proteiner identifisert i TAP-bare prosedyren bør fjernes fra listen identifisert i TAP-transgen rensing.
En vellykket TAP vil rense en blanding av proteiner som er potensielt knyttet til protein av interesse in vivo. Det neste trinnet er molekyl identifisering av disse proteiner, og massespektrometri er vanlig brukt for dette formål. Avhengig av resultatene fra SDS-PAGE og eksperimentet behov, kan de molekylære identiteter i det rensede protein kompleks bestemmes på de to følgende måter: 1) hver enkelt proteinbånd kan bli kuttet ut fra gelen og underkastet en lav kompleksitet LC-MS/MS, eller 2) den eluere fraksjonen som inneholder det meste protein-innhold (vanligvis den andre eluering) kan bli direkte utsatt for moderat kompleksitet LC-MS/MS. En slik shot-gun proteomic tilnærming vil potensielt identifisere alle proteinene i komplekset, avhengig av det dynamiske spekter av MS utstyr 22.
I sammendraget presenterer vi en metode for å identifisere protein-protein interaksjoner i nevrale vev av en genetisk modellorganisme - bananflue. Det er en rekke fordeler ved å anvende den TAP-metoden til fly: 1) fruktfluer har kort levetid, slik at det er forholdsvis enkelt og raskt å generere transgene fluer, og for å oppnå vev i store mengder, begge er avgjørende for TAP tilnærming, 2) sparket genom er fullt merket og inneholder 70% av menneskelige sykdomsfremkallende gener, og 3) viktigst, er det lett å funksjonelt validere og karakter kandidaten samspill proteiner i fluer. Det finnes omfattende ressurser som er tilgjengelige i fly fagmiljøet for karakterisering av et gitt gen, slik som transgene-baserte RNAi samling nyttig å studere vev-spesifikk tap-av-funksjon av et flertall av genets, mutante og mangel alleler for det meste av genet loci, så vel som cDNA-kloner og transgener som er nyttige for gain-of-funksjonsstudier. Vi tror at fly TAP metoden vil være et verdifullt tillegg til verktøyet boksen brukes i flue laboratorier. I fremtidsperspektiv, kan denne metoden kombineres med fly atferds paradigmer og human-sykdom modeller å skjerme endringen i protein-protein interaksjonsnettverk som svar på konkrete forhold og stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker EUROSARF for å sende oss gjær TAP ekspresjonsplasmider. Vi er også takknemlige for redaksjonell hjelp fra Ryan Labadens. Dette arbeidet ble støttet av en NIH / ninds stipend (R01NS070962) til CW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
