Summary
Drosophila ama derinlemesine biyokimyasal analiz uygunluğu için, güçlü genetik manipülasyon ünlüdür. Burada sinek beyin ilgi herhangi bir proteinin etkileşim ortakları belirlemek için TAP-tabanlı bir prosedür mevcut. Bu prosedür, potansiyel araştırma yeni yollar yol açabilir.
Abstract
Drosophila melanogaster (meyve sineği) kullanılarak yapılan genetik ekranlar biyolojik bilimler önceden sayısız kilometre taşı keşifler yaptık. Ancak genetik analiz edinilen bilgiye genişletmeyi amaçlayan biyokimyasal ekranlarının kullanımı sadece son zamanlarda araştırılmıştır. Burada protein kompleksi arındırmak için bir yöntem tarif erişkin sinek başkanlarının ilgi herhangi bir protein ile ilişkilendirir. Bu yöntem, in vivo nöron uçucu bir Tandem Affinity saflaştırma (TAP) etiketi ile ikame edilmiş bir yem proteini ifade etmek için Drosophila GAL4/UAS sistemi yararlanır ve daha sonra ilk kurulan benzer bir prosedür kullanılarak TAP arıtma iki tur uygular etkileşimli protein kompleksinin saflaştırılması için maya 1. Bu işlemin sonunda, çok sayıda protein kompleksleri oluşan bir karışım olan bir moleküler kimlikleri kütle spektrometresi ile belirlenebilir elde edilir. Aday proteinlerin Doğrulama r yararlanacakesource ve sinekler kaybı fonksiyon-çalışmaları gerçekleştirme kolaylığı. Benzer yaklaşımlar, diğer uçucu dokulara uygulanabilir. Biz sinek model sistemde genetik manipülasyonlar ve bu proteomik yaklaşımın birleşimi nörobiyoloji alanında ve ötesinde temel sorunlarla mücadele için muazzam bir potansiyele sahip olduğuna inanıyoruz.
Introduction
Belirli bir biyolojik süreç aracılık moleküler yollar veya ağları tanımlama biyomedikal araştırmanın nihai hedeflerinden biridir. Fly genetikçiler, özellikle paralel olarak, birlikte çalışmak, ya yukarı ya da ilgi bir genin aşağı faktörleri tespit etmek, genetik ekranlar (arttırıcı ve baskılayıcı ekranlar) niteleyici, ileri genetik temeline bağlıydı var. Ancak, ileriye genetik ekranlar çoğu kez mutasyona uğradığı zaman, kimin fonksiyon kaybı sadece puan zor ince kusurlarına neden fonksiyonel fazlalık ve tazminat ile erken gelişim aşamalarında öldürücülüğü, ya da genlerin neden olan, gerekli genleri tanımlamak için başarısız. Bu zorluğun üstesinden gelmek için bir yolu direkt protein-protein etkileşimleri için taranmasıdır. Daha fazla on yıl için, vb maya iki-hibrid, faj gösterimi, kimyasal olarak çapraz bağlanma, Co-IP, Tandem Affinity saflaştırılması (TAP), dahil olmak üzere, biyokimyasal yöntemler, giderek artan bir listesi. proteini incelemek için kullanılmıştır-Protein etkileşimleri. Bu yaklaşımların her biri güçlü ve duyarlılık ve özgüllük açısından zayıflıkları kendi belirledi. Bunlar arasında, TAP yöntem olup, yakın fizyolojik koşullar altında fiziksel etkileşimi tespiti sağlar özgüllük ve tutarlılık 2 koruyan ve 3,4 analiz, yüksek verim için genişletmek için de içerir.
TAP yöntem aslında Rigautand arkadaşları 1 tarafından maya geliştirilmiştir. Bu yöntemde, ilgi konusu bir protein, TAP etiketi ile ifade edilir. Bir Protein IgG bağlanan bir etki ve Kalmadulin bağlanma alanı: TAP etiketi iki bağımsız afinite bağlanma alanlarını barındırır. Bu iki etki, bir TEV (Tütün Etch Virüsü) yarılma sitesi ile ayrılır. Afinite arındırmalardan bağımsız iki mermi yeterince spesifik olmayan bağlamaları azaltmak ve belirli bağlamaları 1 zenginleştirmek için böyle bir kombinasyon sağlar. Bu örnek için, TAP yöntem çok güçlü bir metoksidışsal proteini aşırı ifade, normal olarak endojen muadili ile kompleks yapma proteinler ile ilişkilendirmek için daha eğilimli hale getirebilir, ancak, belirli bir proteinin in vivo etkileşim içinde tespit d. Gelişimi bu yana, TAP yöntem, hücre-kültür temelli sistemler 5,6 ve in vivo model sistemlerinde 6-9 de dahil olmak üzere pek çok diğer sistemler de uygulanmıştır. Burada Drosophila TAP yöntemin adaptasyonu açıklar. İlk olarak, ilgi konusu genin N-veya C-terminali ya da üzere TAP etiketinin klonlama ve birleşmeyi kolaylaştırmak için pUAST-NTAP ve pUAST-CTAP vektörleri üretir. UAS-TAP-etiketli transgen daha sonra bir nöronal GAL4 sürücü 10 kontrolünde sinir sisteminde ifade edilir. Daha sonra, yetişkin sinek kafaları çok sayıda nöral hücre içeriği yüksek olan ve büyüklüğü farklılıklara göre dondurucu sonra diğer vücut parçaları ayırmak kolay olan, toplanacaktır. Yetişkin kafaları homojenize ve temizlenir b vardıry ardışık santrüfüj ve süpernatan, aşağıda tarif edilen bir prosedüre TAP tabidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. UAS-TAP-etiketli Transgenik Sinekler üret
- PUAST-TAP-etiketli DNA yapıları oluşturur.
- (N-veya C-ucu) yem proteinin TAP etiket protein yapı / fonksiyon esas alınarak, kaynaşık hangi tarafı karar. Daha fazla ayrıntı için tartışma bakın.
- Sırasıyla N-ya da C-terminal-etiketli UAS-TAP transgenlerin oluşturmak için pUAST-NTAP veya pUAST-CTAP vektörlerin birden fazla klonlama bölgesi (MCS) içine ilgi konusu genin cDNA kodlama bölgesini alt-klonlanmıştır. Ayrıntılı haritalar ve kullanışlı kısıtlama siteleri ve okuma çerçeveleri için Şekil 1'e bakınız.
- UAS-TAP-etiketli transgenik sinekler oluşturun.
- P-eleman-aracılı ekleme 11 kullanılarak standart protokollere aşağıdaki transgenik sinekler oluşturun. Enjeksiyon hizmetleri bir ticari olarak mevcuttur.
- Her bir transjenik çizgi için nöronal GAL4 sürücü (örneğin BG380-GAL4) çapraz ve protein ekspresyon seviyelerini belirlemekBatı (Peroksidaz anti-peroksidaz antikoru) ile lekeleme ve / ya da (anti-TAP antikoruyla) immunosteyn etme ile her bir satırın. Genel olarak, endojen protein yakın olan bir protein ekspresyon seviyesine sahip bir transgen doğru, TAP işlemleri için tavsiye edilir. Daha fazla ayrıntı için tartışma bakın.
- Ilgi konusu genlerin kaybı fonksiyon-mutantları kullanılabilir olup olmadığını TAP-etiketli transgenlerin işlevselliğini teyit etmek için kurtarma deneyler PerformGAL4/UAS-based. Esas olarak şu TAP deneyler için, mutant fenotipleri kurtarma bir transgen seçin.
2. TAP Prosedür Örnekleri hazırlayın
- Bir nöronal GAL4 sürücüsü (örneğin BG380-Gal4) ve sinek örneklerinin genişlemesini kolaylaştırmak için seçilen TAP-etiketli transgenini hem taşıyan bir sinek stok oluşturmak. GAL4 sürücü ve yukarıdaki kombinasyonu hayatta kalma ve büyüme dezavantajına neden nadir durumlarda UAS-transgen haç F1 yavrularıyla toplayın. </ Li>
- Küçük ölçekli örnekleri toplamak ve TAP-etiketli protein eritebilmek için parçalama durumunu optimize eder.
- Noniyonik deterjanlar NP-40 (% 0.1-1), NaDOC (% 0.1-1) ve Triton X-100 (% 0.05-0.5) oluşan bir kombinasyon kullanılarak parçalama tampon bir dizi yapın. Daha fazla bilgi için Tablo 1 ve açıklamalara bakın.
- CO2 yastığı üstüne, sinekler ifade TAP transgenden 20 yetişkin kafaları incelemek ve her lizis tamponu koşulu sınamak için 1.5 ml tüp onları toplamak için # 5 forseps kullanın.
- Tüp 100 ul test lizis tamponu ekleyin ve başka bir 100 ul test tamponu ekleyin, sonra yukarı okşayarak tarafından ve plastik bir havan tokmağı ile aşağı kafaları homojenize.
- 10 dakika (4 ° C) 21,500 x g de baş lizat Spin ve santrifüjlemeden sonra süpernatan ve topak ayırın. Sırasıyla, 30 ul süpernatan için pelet ve 10 ul 4x SDS yükleme tamponu 25 ul 2 x SDS yükleme tamponu ekleyin.
- 5 dakika için iki numune kaynatılır ve yan analizTarafı PAP antikoru ile yapılan SDS-PAGE ve Western Blot daha sonra kullanılmıştır. Pelet vs süpernatan içinde TAP-protein seviyelerinin oranı ile çözünürlüğünü belirlemek.
- Büyük ölçekli bir örnek hazırlayın
- Genişletin ve yetişkin sinekler toplamak.
- Şişelerde neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene stok genişletmek ve birikimli 250 şişe kadar her 3 gün toplama için kullanılan şişe çevirin.
- Toplayın 1-3 gün yetişkin 50 ml konik tüpler içine uçar, hemen derin dondurucuda sinekler sıvı azot içinde tüp koymak. -80 ° C derin dondurucuda saklayın sinekler. Sineklerin hacmi 50 ml tüp yaklaşık 2/3 'ünü geçmemelidir unutmayın.
- (Toz kuru buz üstüne bu adımı gerçekleştirmek) sinek kafaları toplayın.
- Önceden soğutulmuş elekler ve -80 ° C dondurucu havan dışarı atın ve ideal büyük bir buz kovası içinde, kuru buz koydu. Th üzerinde No: 25 sayılı iki ABD standart test elekleri Stacke üst ve alt No: 40.
- Donmuş sinekler dışarı atın ve sıvı azot içinde bırakın ve yaklaşık 10 dakika boyunca orada sinekler tutmak. Vortex veya organları başkanları, bacaklarını ve kanatlarını kırmak için şiddetle tüpler sallayın.
- En iyi eleğe dökün ve her ikisi de bir arada tutarken elekler daha sonra kuvvetli bir şekilde elekler sallayın. Eleme sonra, organları, üst elek üstünde kalmak kafaları alt elek üzerinde muhafaza edilecektir sinek ve bacaklar, kanatlar, ve diğer enkaz kuru buz düşecek olacaktır. İki elekler ayırın ve dikkatlice soğuk harç sinek başlarını aktarmak.
- Sinek kafaları homojenleştiriniz
- Kuru buz üzerine, buz üzerinde önceden soğutulmuş bir 15 ml bir cam Dounce doku öğütücü için tozu aktarmak sonra, toz parçacıkları için harç ve havan tokmağı ile kafaları öğütülür.
- Kafa numune içine döküldü önce ve sonra değirmeni ağırlıklarını ölçmek, ve sonra ne kadar kafa Samp hesaplamakle ağırlığındadır. Uçucu kafaların 6-15 gram toplam proteinin ekspresyon seviyelerine göre ayarlanması her TAP deneme için yeterli olacaktır. Pestle aşağı yukarı gidip için kolay kadar toz buz-soğuk homojenizasyon tampon 15 ml (adım 2.2 optimize lizis tamponu) ekleyin ve ardından büyük boşluk tokmak ile inme. Her zaman buz üzerinde cam değirmeni tutun.
- TAP için süpernatant hazırlayın
- ~ 50,000 x g'de (4 ° C) 'de 20 dakika boyunca yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne ve spin Homojenat aktarın. Yeni bir yüksek hızlı santrifüj tüpüne süpernatant aktarın ve santrifüj bir kez daha tekrarlayın.
- Bir ultrasantrifüjdeki tüp süpernatant aktarın ve daha süpernatant temizlemek için bir 40 dk ~ 250,000 xg sıkma gerçekleştirin. Süpernatan ultrasantrifüj sonra tandem afinite saflaştırma işlemleri için hazırdır.
- Genişletin ve yetişkin sinekler toplamak.
3. TAP Arıtma Aşağıdaki bölümlerde Séraphin laboratuvar TAP türetilmiştir protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )
- IgG boncuk afinite saflaştırma gerçekleştirmek
- Numuneler santrifüj edilmektedir sırasında IgG sepharose boncuk hazırlayın. 10 ml soğuk IgG yıkama tamponu ile bir 15 ml Falcon tüpü içerisinde 400 ul boncuk IgG 3x yıkayın. Her yıkama için, 2 dakika boyunca hafifçe tüp kaya, ve daha sonra başka bir 2 dakika boyunca 1.000 xg'de boncuk aşağı spin. Üçüncü yıkama sonunda, tamponunu çıkarın ve tüp içinde sadece boncuk bırakın.
- Dikkatlice IgG boncuklar içeren 15 ml tüp içine temizlenmiş süpernatan (~ 15 mi) aktarın. 2 saat boyunca bir nutator 4 º C'de boncuk ve beyin lizat karışımı inkübe edin.
- Soğuk odada yaklaşık 15 ml toplam hacim ile temiz ve boş mikro sütun kurmak. Sürekli sütuna karışımı dökerek IgG boncuk karışımı yükleyin; herhangi bir tuzak değil deneyinhava sütun içinde kabarcıklar. Boncuklar yavaş yavaş yerçekimi akışı ile tahliye sütun ve tampon yerleşmek için izin verin.
- Beyin lizat bütün yerleşik IgG sütun aktıktan sonra soğuk IgG yıkama tamponu, 10 ml ile iyice sütunu yıkayın. Yıkama 2x tekrarlayın. Not: Havada boncuk kuru izin vermeyiz.
- TEV bölünme gerçekleştirin
- Üçüncü yıkamadan sonra, 10 ml TEV yarılma tamponu ile tekrar sütun yıkayın. Bu adım TEV bölünme için yem kompleksi sequestrates IgG boncuk hazırlar.
- TEV tamponun son damla damla dışarı akışını engellemek için sütunun alt kısmında bir kapak koymak, kolona TEV enzimin 130 birimlerini ihtiva eden 1.3 ml tampon TEV ekleyin ve güvenli bir üst kapak üzere hemen önce sütun. Sütun her iki uçta da kapalı olduğundan emin olun.
- TEV enzim TEV yerinde peptidi ve protein kompleksi, WHI serbest bırakmak için izin vermek için 2 saat boyunca 18 ° C'de sütun döndürmele, proteinin arkasında IgG sefaroz boncuklara bağlanan bir etki peptidi bırakır.
- Kalmoduline boncuk afinite saflaştırma gerçekleştirmek
- IgG boncuklar TEV enzim ile inkübe edilir ise Kalmoduline boncuk hazırlayın. Soğuk kalmodulin bağlama tamponu içinde 10 ml bir 15 ml Falcon tüpü 3x, her zaman 200 | il boncuk Kalmoduline yıkayın. Her bir yıkama için, yumuşak bir nutator 2 dakika boyunca tüp kaya, ve daha sonra 2 dakika boyunca 1000 x g'de boncuk aşağı doğru döndürün. Üçüncü yıkama sonunda, bütün tamponu çıkarmak ve tüp içinde, sadece boncuk bırakın.
- TEV inkübasyon (adım 3.2.3) sonunda, geri soğuk odaya IgG sütun dönmek ve yukarı doğru ayarlayın. Boncuklar 10 dakika dinlendiriniz.
- En iyi kap ve daha sonra alt kapak kaldırma ve daha sonra bir 15 ml Falcon tüpüne 1.3 ml TEV yarılma ürünü toplamak. Tampon tamamen tahliye edelim. Sütunun bir ölü hacmi dışarı itmek için kolona ilave bir 200 ul TEV tampon ekleme, f toplamakaynı tüpte düşük-out.
- Yukarıda toplanan 1.5 ml TEV yarılma ürünü tampon ve 4.5 ul 1 M CaCl 2 bağlayıcı kalmodülin 4.5 ml ilave edilir. CaCl2 TEV EDTA tampon maddesi içinde titre hizmet etmektedir. Kalmodulin boncuklar içeren tüpe 6 mi karışımı aktarın ve 1 saat boyunca bir nutator 4 ° C'de tüp döndürün.
- Soğuk odada yaklaşık 10 ml toplam hacim ile başka temiz ve boş mikro sütun kurmak. Kolona Kalmoduline boncuk karışımı Yük ve yer çekimi ile akmasını sağlar.
- Bütün çözelti, yerleşmiş Kalmoduline kolondan akmıştır zaman, soğuk bağlama tamponu kalmodülin, 10 ml ile kolondan iki kez, her biri yıkayın. Not: Kalmoduline boncuk rahatsız etmemek ve yıkama sırasında mümkün olduğunca düz boncukların yüzeyini tutmaya çalışın.
- Kalmoduline kolonundan yem kompleksi Zehir.
Sağ yıkandıktan sonra, 200 ul soğuk Calmodu beş fraksiyonları ile Kalmoduline Kolonu akıtmaklin elüsyon tampon çözeltisiyle ayrılmıştır. Her bir kısmı için, hafifçe kolona elüsyon tampon 200 ul ekleyin ve belirgin bir 1.5 ml Eppendorf tüpü ile eluatın toplar. Bu 4x tekrarlayın. - SDS-PAGE ile protein kompleksi analiz
- Beş fraksiyon (yaklaşık 30 ul) her birinden küçük bir kısım alın ve SDS yükleme tamponu ilave edin. 5 dakika için kaynatılır ve örnekleri gradyanı (% 4-15) SDS-PAGE jel içinde protein moleküler işaretleri ile numuneleri yan yana yükleyin.
- Numuneler tam olarak jel içinde çözüldü sonra elektroforez durdurmak ve bu 13 boyama 'mavi gümüş' olarak bir G-250 bazlı duyarlı koloidal Coomassie lekeleme işlemleri ile jel leke. Bu daha sonraki kütle spektrometresi analizleri ile tam uyumlu değil çünkü Gümüş boyama tercih isteğe değil ama. Bu tür saflaştırılmış protein kompleksinin moleküler kimliklerini açığa çıkarmak için kütle spektrometrisi gibi daha fazla analiz için bir -80 ° C dondurucu içinde, sıyırma sıvısının geri kalanını saklayın. See tartışma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sinek beyinde Highwire-etkileşim proteinleri tanımlamak bizim çaba göstermektedir. Highwire (HIW) ve omurgalı ve omurgasız homologlarını sinir sistemi 14 gelişimini düzenleyen ve onarım büyük ubiquitin ligaz bulunmaktadır. Bunlar, yüksek oranda muhafaza edilmiş işlevsel sahaların bir dizi paylaşır. Ancak, moleküler eylemler tamamen açık değildir. Solucan yapılan iş, sinek ve fare geçerli çalışma modeline neden olduğu bir E3 ligaz gibi ve geçiş süresi ve hücre tipine özgü nöronal işlevleri regüle eden bir çok alt-birimi ubikitinasyon kompleks oluşumunu kolaylaştırmak için bir iskele proteini olarak işlev HIW Farklı yardımcı faktörler ile etkileşim ve farklı ubiquitin hedef alt-tabakaların birleşimi. HIW ilişkili ubikuitinasyon kompleksi belirlemek için, ilk hiw mutant fenotip 15 kurtarırken tam olarak işlevsel bir N-terminal etiketli UAS-TAP-HIW transgen oluşturulur. Yetişkin çiçeklerden yaklaşık 10 gSadece TAP veya TAP-HIW transgenik proteinlerin ifade y başkanları toplandı ve yukarıda anlatıldığı gibi yan TAP prosedürler tarafına tabi tutuldu. Her iki saflandırma Final sıvı kısımlar SDS-PAGE ve gümüş boyama ile analiz edilmiştir. Kütle spektrometrisi Drosophila FSN (DFSN, bir F-box protein) ve RAE1 (Şekil 2) de dahil olmak üzere, sadece TAP-HIW örneğinde proteinlerin bir listesi tespit edilmiştir. Sonradan genetik ve biyokimyasal analizler HIW ve DFSN sinaptik yapısı ve fonksiyonu 16 düzenleyen SCF gibi E3 ubikuitin ligaz kompleksi olarak birlikte çalışmak olduğunu ortaya çıkarmıştır, ve in vivo HIW ile RAE1 ortakları ve sinaptik üremesine 17 alıkoyar. RAE1 bu işlevi en azından kısmen seçici sinaptik gelişim sırasında 17 HIW protein bolluk denetleyen yeni bir mekanizmayı ortaya otofajik parçalanmadan, HIW koruyup HIW protein istikrarı teşvik etmek kabiliyetini elde değildir.
Şekil 1. TAP-etiketli transgenik sinekler üretmek için vektörler. (A) pUAST-NTAP haritası oluşturmak. (B) pUAST-CTAP haritası oluşturmak. Her iki kuruluşta da çoklu klonlama bölgeleridir (MCS) tek kesim kısıtlama bölgeleri Kırmızı renk ile sunulmaktadır bir dirsek ile işaretlenir. (C) TAP etiketinin okuma çerçevesi ile TAP vektörlerin çoklu klonlama siteleri gösteren birincil dizisi. PUAST-NTAP +1 ve pUAST-NTAP +2: subklonlama kolaylaştırmak için, iki NTAP yapıları orijinal pUAST-NTAP üretilir. Birlikte üç NTAP MCS kullanımını karşılamak için üç olası okuma çerçeveleri kapsamaktadır oluşturur. Tüm vektörlerin, ilk olarak oluşturulan NTAP CTAP veya fragmanları kullanılarak inşa edilmektedirSeraphin Lab 1. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
. TAP arıtma tarafından sinek beyninden Highwire etkileşen proteinlerin Şekil 2 Arıtma TAP ifade sinekler Yetişkin kafaları. Sinir sisteminde (BG380-GAL4,, UAS-TAP) veya TAP-HIW (UAS-TAP-HIW BG380-GAL4) sırasıyla toplandı, homojenize, TAP ve saflaştırmaya tabi tutulur. Nihai sıvı kısımlar ardından gümüş boyama ile tek boyutlu SDS-PAGE jeli ile analiz edilmiştir. Ok başı yem protein HIW gösterir ve yıldız bölünme TEV nedeniyle kesilmiş TAP proteinini göstermektedir. TAP-HIW örnek olarak, proteinlerin bir listesi kütle ile tanımlanırHSC-70, β-tubulin, RAE1 DFSN ve (oklar ile belirtilen) de dahil olmak üzere spektrometrisi. Bu rakam Tian ve ark. 17. Şekil 1a değiştirilir büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
| Tampon | Bileşim | Yorumlar |
| Liziz tamponu | 50 mM Tris-HCl pH 7.5 | NOT: 1) DTT ve proteaz ve proteozom inhibitörleri kullanımdan hemen önce ekleyin. |
| 125 mM NaCl | 2) burada gösteriliyor% 0.5 NP40 ile bir parçalama tamponu olduğunu. Noniyonik deterjanlar değişiklikler için Tartışma bakın. | |
| % 5 Gliserol | ||
| % 0.5 NP-40 | ||
| 1.5 mM MgCI2 | ||
| 25 mM NaF | ||
| 0.2 mM DTT | ||
| (Aşağıdaki proteaz ve proteazom inhibitörleri) | ||
| 1 mM Na 3 VO 4 | ||
| 0.05 mM MG-115 | ||
| 1 mM PMSF | ||
| Proteaz inhibitörü karışımı (Sigma P8340) | ||
| Proteaz inhibitörü kokteyli (Roche 04693159001) | ||
| IgG yıkama tamponu | 10 mM Tris-Cl, pH 8.0 (0.5 mi M stok 2) | |
| 150 mM NaCl (5 M stok 3 mi) | ||
| % 0.1 NP-40 (% 10 stoklar 1.0 mi) | <td>||
| H 2 0-100 ml nihai | ||
| TEV bölünme tamponu | 10 mM Tris-Cl, pH 8.0 (0.5 mi M stok 2) | NOT: Kullanımdan hemen önce DTT ekleyin. |
| 150 mM NaCl (5 M stok 3 mi) | ||
| % 0.1 NP-40 (% 10 stoklar 1.0 mi) | ||
| 0.5 mM EDTA (0.5 M stok, 100 ul) | ||
| 1 mM DTT (1 M stok 100 ul) | ||
| H 2 O ila 100 ml 'lik son | ||
| Kalmodulin bağlama tamponu | 10 mM β-merkaptoetanol (stoklar 69.7 ul) | |
| 10 mM Tris-Cl, pH 8.0 (0.5 mi M stok 2) | ||
| 150 mM NaCl (5 M stok 3 mi) | ||
| 1 mM Mg-asetat (1 M stok 100 ul) | ||
| 1 mM imidazol (1 M stok 100 ul) | ||
| 2 mM CaCl2 (1 M stok 200 ul) | ||
| % 0.1 NP-40 (% 10, 1 mL stok) | ||
| H 2 O ila 100 ml 'lik son | ||
| Kalmodulin elüsyon tamponu | 10 mM β-merkaptoetanol (stoklar 69.7 ul) | |
| 10 mM Tris-Cl, pH 8.0 (0.5 mi M stok 2) | ||
| 150 mM NaCl (5 M stok 3 mi) | ||
| 1 mM Mg-asetat (1 M stok 100 ul) | ||
| 1 mM imidazol (1 M stok 100 ul) | ||
| 10 mM EGTA (0.5 M, 2 ml stok) | % 0.1 NP-40 (% 10, 1 mL stok) | |
| H 2 O ila 100 ml 'lik son |
Tablo 1. Tamponların bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemi, iki bağımsız afinite saflaştırma adımları üzerinden izole edilmesini ve protein kompleksleri zenginleştirme sağlayan bir çift saflaştırma protokolü bulunmaktadır. TAP etiketinin tasarımı bu protokolde yer ne sınırlı değildir tampon şartları buna göre ayarlanır ise, başka bir protein bağlayıcı etki ve motifleri de geçerlidir. Diğer TAP etiketlerin iyi bir örnek GS-TAP etiketi, bir G-proteinine ait bir arada ve kültürlenmiş memeli hücre çizgilerinde 18 temizleme protein kompleksi amaçlayan Giulio Superti-Furga grubu tarafından tasarlanan bir streptavidin bağlayıcı motif vardır. GS-TAP sonra Drosophila S2 hücreleri ve embriyolar 19 protein-protein etkileşimini incelemek için uyarlanmıştır. Bailey ve diğ. Tarafından yeni bir JoVE yayın GS-TAP prosedür hücre kültürü lizatı 20 ile gerçekleştirildi nasıl gösterdi. İşte biz (Drosophila nöral dokularda TAP-etiketinin kullanımına sunmuştur reklambüyük ölçekli proteomik taraması için Ult başları). Bu protokol, potansiyel olarak bu tür embriyo gibi büyük ölçekli bir örnek toplama sağlayan diğer dokulara, adapte edilebilir. Üst elek (adım 2.3.2.3) toplanan yetişkin organları da çok zor bir görev olabilir, TAP için kullanılabilir. Liziz tamponu yapılması ve en fazla sindirim sisteminde mevcut olan ve birinci saflaştırma prosedür belirgin olarak proteazlara proteinlerin maruz kalma süresini azaltmak amacıyla kısaltılabilir büyük proteazlarını inhibe etmek için koşullandırılmalıdır. Farklı TAP etiketleri farklı handlings ve afinite arıtma için tampon koşulları gerektirmesine rağmen, TAP için genel prensipler aynıdır. Biz TAP sonuçlarının kalitesini etkileyecek konuları görüşmek aşağıda.
TAP yaklaşımın başarısı sağ transgen üreten bağlıdır. İlk olarak, etiket kendini TAP yeteneğini korumak için kritik olan yem protein, genel yapısını değiştirmemelidirfizyolojik bağlanma partnerleri ile etkileşim için. Bu nedenle, burada ilgilenilen gen TAP etiket sigorta karar vermek için çok önemlidir. Karar proteinin önceki çalışmalarda, yapısı ya da fonksiyonel epitode-etiketli Transgenlerin konusunda özellikle bilgilere dayanarak yapılabilir. Durumda, bu tür bilgilerin paralel olarak N-veya C-terminalinde yem protein etiketleme, kullanılamaz tavsiye edilir. Daha sonra fonksiyonel kurtarma deneyler kullanılması gerektiğini belirlemek için transgen yapılabilir. İkinci olarak, transgenik protein ekspresyon seviyeleri, endojen protein edilene yakın olmalıdır. Gal4/UAS sistem normal olarak yanlış pozitif artırmak ya da neden olabilir ya da endojen proteinlere kıyasla farklı bir zamanlamada ve çok daha yüksek bir düzeyde transgen ekspresyonunu tahrik olarak, bu özellikle önemlidir, protein etkileşiminin profilini değiştirmek beklenmedik sonuçları hücrelerde ağları. Örneğin, aşın iskele proteinler Caus olabilire baskın negatif etkiler ve bu kinazlar olarak enzimatik aktivitelere sahip aşırı ifade eden proteinler, çoğu kez da onlarla etkileşim endojen bağlanma ortaklarının yeteneğini etkileyebilir, her ikisi de kazanç fonksiyon-etkilere neden olur. Bu durumda, sistem GAL4/UAS ilgi konusu genin ekspresyonunun zamanlaması ve seviyesi sadece normal şartlar altında mevcut endojen etkileşimlerin korunması için kritik olduğu kaçınılmalıdır. Bunun yerine, TAP-etiketli transgenin ifadesi kendi ilerleticisinin altında kontrol edilmelidir. Bu endojen promotör dizisi ile UAS sekansı değiştirerek veya ilgi 21'in geninin bütün lokus içeren bir genomik DNA fragmanı exonal dizisi ile aynı çerçevede TAP dizisi füzyon yoluyla elde edilebilir. Bazı durumlarda, TAP deney inc için endojen protein rekabet azaltmak için, ilgi konusu genin mutant fonksiyonu hakkında genel bir bilgi kaybı yapılabilirmultiprotein kompleksler halinde orporating. Bu örnek, bir protein sıfır arka plan, varsa, tamamen endojen protein ortadan kaldırmak için ideal bir durum sağlamaktadır. Genetik mutant altyapısını kullanarak her zaman daha kaliteli sonuçlar üretmek için şansı artacaktır.
Yem proteinin çözünürlüğü başarısı için bir başka önemli faktördür. Iyonik olmayan deterjanlar, normal olarak, plazma membranı çözülür ve fizyolojik çevreye yakın bir durum içerisinde çözünen ve sağlam protein kompleksi, korumak için lizis tamponu kullanılır. Bununla birlikte, ilgi konusu proteinleri membran-ilişkili entegre ya da proteinler olup olmadığına bağlı olarak, iyonik olmayan deterjanlar bileşimi ve konsantrasyonu, yem proteinin çözündürülmesi için çok önemli olabilir. 0.1-0.3% NP-40 sitozolik proteinlerin çözündürülmesi için genellikle yeterli olmaktadır. Membran proteinleri için, NP40 bir kombinasyonu (% 0.1-1), NaDOC (% 0.1-1) ve Triton-X-100 (% 0.05-0.5), bazen solubi için gereklidirlizedirler ve TAP deney için yeterli protein zenginleştirmek. Sıkı bir liziz tamponu zayıf bir protein-protein etkileşimlerini bozmaya eğilimli Bununla beraber, bir denge, aynı zamanda, protein-protein etkileşimleri çoğunluğu korunur, yeteri kadar çözünür yem proteinleri, numunede mevcut olan ulaşılabilir olması gerekmektedir. Bir genel ilke, her zaman düşük konsantrasyon ile deterjanların az türlerini kullanmayı deneyin olmasıdır.
Giderme kolaylaştırmak için, son derece iki saflaştırma aşamasından her numunenin küçük bir kısım kaydetmek için tavsiye edilir. Alikotları on sonraki SDS-PAGE ile protein lekeleme / Western analizi yem protein düzeyleri ve belirli bir protein türlerinin sıralı zenginleştirme izlenmesine olanak tanır. Yem protein ani azalma TEV yarılma sonra akış çıkışı (aşama 3.3.3) alikosu tespit edilmiştir, örneğin, bu yem protein IgG boncuk yıkama (aşama 3.1.4) sırasında kaybedildi olasıdır . Bir possible neden IgG yıkama tamponu yetersiz deterjan bileşimi olabilir. IgG Yıkama tamponu içindeki deterjan bileşimine ve konsantrasyonuna keskin bir düşüş (% 0.1 NP-40 için) liziz tamponu ile karşılaştırıldığında bulunmaktadır. Yem protein bu değişikliklere karşı duyarlı olmak ve boncuklar üzerinde IgG parçasından kesmek olabilir. Lizis tamponu karşı IgG yıkama ayarlanması sorunu çözmeye yardımcı olabilir. Olasılığı daha düşüktür, ancak alternatif olarak, TEV yarılma (adım 3.2) IgG boncuklardan yem içeren bir kompleks serbest bırakmak için yeteri kadar çalışmış olabilir. , Bir ikinci muayene değer adımlar TEV tamponu (aşama 3.2.1) ve enzim aktivitesi olan IgG boncuk dengeleme olan, yanlış ele enzim hafifletmek olabilir.
Hatta iki aşamalı arıtma ile, yine son TAP-saflaştırılmış kompleksi spesifik olmayan mevcut aşağı çekti yanlış pozitif ve proteinler orada olacağını aklınızda bulundurun. De, bu spesifik olmayan etkileşimleri belirlemek için tek yolduren azından kısmen, TAP arıtma deneylerde TAP-etiketli-transgen ile paralel olarak TAP sadece transgen kullanarak bir kontrol TAP eklemektir. TAP sadece prosedürde belirlenen Proteinler TAP-transgen arıtma belirlenen listeden çıkarılmalıdır.
Başarılı bir TAP, potansiyel olarak, in vivo olarak, ilgi konusu bir protein ile ilişkili bir protein karışımı arındıracak. Bir sonraki adım, bu proteinlerin moleküler tanımlanmasıdır ve Kütle Spektrometri bu amaçla yaygın olarak kullanılmaktadır. SDS-PAGE sonuçlarına ve denemenin ihtiyaçlarına bağlı olarak, saflaştırılmış protein kompleksi, moleküler kimlikleri şu iki yolla belirlenebilir: 1) her bir protein bandı jelden kesilmiş ve düşük tabi tutulabilir karmaşıklık LC-MS/MS ya da 2) tepe protein içeriği (normalde ikinci elüsyon) içeren elute fraksiyon direkt olarak orta karmaşıklığı LC-MS/MS tabi tutulabilir. Böyle bir shot-gun proteomic yaklaşım, potansiyel olarak MS ekipman 22 dinamik aralığına bağlı olarak, kompleks içindeki tüm proteinleri belirleyecektir.
Meyve sineği - Özetle, biz bir genetik model organizma nöral dokularda protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir yöntem mevcut. Fly TAP yöntemi uygulayarak avantajları vardır: 1) Meyve sinekleri kısa bir yaşam döngüsü var, bu yüzden nispeten hızlı ve transgenik sinek üretmek için ve büyük miktarda dokuları elde etmek kolaydır, hem de TAP için çok önemli yaklaşımı, 2) fly genom tam açıklamalı ve insan hastalığa neden olan genlerin% 70 içerir, ve 3) en önemlisi, işlevsel doğrulamak ve sinekler etkileşen proteinleri adayı karakterize etmek kolaydır. Böyle incelemek için yararlı transgenik bazlı RNAi koleksiyonu olarak verilen bir genin karakterizasyonu için sinek araştırma toplumda mevcut kapsamlı kaynaklar vardır, doku-spesifik kayıp fonksiyon-genin bir çoğunluğununs, gen lokuslarının çoğu, hem de cDNA klonlarından ve kazanç fonksiyon-çalışmalar için yararlı transgenleri için ve mutant alelleri eksikliği. Biz sinek TAP yöntemi sinek laboratuvarlarında kullanılan alet kutusuna değerli bir katkı olacağına inanıyorum. Gelecek bakış açısından, bu yöntem özel şartlar ve uyarıcıya tepki olarak protein-protein etkileşimi ağında değişimi taranması için uçucu davranış modelleri ve insan hastalık modelleri ile birleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz bize maya TAP plasmidlerini göndermek için EUROSARF teşekkür ederim. Biz de Ryan Labadens gelen editoryal yardım için minnettarız. Bu çalışma CW bir NIH / NINDS hibe (R01NS070962) tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
