Summary
여기에서 우리는 마이크로 및 밀리 역학 및 신경원 칼슘 센서 하류 조절 요소 길항제 변조기 칼슘 연관과 관련된 구조적 변경의 지학을 모니터링 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen과 조합 광열 빔 편향 기술의 응용을보고 .
Abstract
함께 사진 음향 열량 및 열 격자와 광열 빔 편향은 기존의 정지를 사용하여 액세스 할 수없는 시간 규모를 밀리 초 단위로 마이크로에 단백질의 구조적 변화를 유도 빛의 시간 프로파일 볼륨과 엔탈피 변화를 모니터링 광열 방법의 가족에 속한다 흐름 악기. 양 및 / 또는 전체적인 엔탈피 변화가 프로빙 때문에 또한, 이들 기술은 형광 물질과 또는 발색단 라벨 부족한 단백질 및 다른 생체 고분자에 적용 할 수있다. 칼슘과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문을 모니터링하려면 + 칼슘 트랜스 듀서, 이러한 신경 세포의 칼슘 센서, 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen, 사진 트리거에게 무료로 칼슘의 빠른 (τ <20 마이크로 초) 증가 채용에 바인딩 농도와 연관된 부피 및 엔탈피 변화는 광열 편향 빔 기술을 이용하여 조사됩니다.
Introduction
이러한 광 음향 열량, 광열 빔 편향 (PDB) 및 나노초 레이저 여기와 결합 과도 격자로 광열 방법은 일시적인 중간체 1,2의 시간 분해 연구를위한 광학 분광기를 과도 할 수있는 강력한 대안을 나타냅니다. 이러한 과도 흡수 및 IR 분광법 등의 광학 기법과 대조적으로, 그 주위의 발색단의 흡수 변화의 시간 프로파일을 모니터링; 광열 기술은 광학적으로의 시간 프로파일을 조사 할 가치있는 도구를 히트 / 부피 변화의 시간 의존성을 감지하고, 따라서 아르 "침묵"처리합니다. 지금까지, 광 음향 열량 과도 격자가 성공적으로 글로빈 3,4, 산소 센서 단백질과 리간드의 상호 작용에 이원자 리간드의 마이그레이션을 포함하여 사진에 의한 프로세스의 구조적 역학을 연구하기 위해 적용되었습니다 FixL 5, 6 산화 효소 전자와 헴 - 구리의 양자 전송차 광계 II뿐만 아니라 로돕신 7 크립토 8 구조적 역학의 광 이성화.
내부 발색단 및 / 또는 형광 물질이 결여되어 생물학적 시스템에 광열 기술의 애플리케이션을 확장, PBD 기법 따라 광 트리거 갇힌 화합물의 용도 몇 마이크로 초 내에 리간드 / 기질 농도의 증가와 함께 또는 빠른 결합시켰다 갇힌 화합물에. 이 방법은 수있는 리간드 / 기판 내부 형광 또는 발색단 부족한 단백질 및 상업 정지 흐름 악기로 액세스 할 수없는 시간 규모에 바인딩과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문의 모니터링. 여기 케이지 화합물, 칼슘의 열역학 2 + DM-nitrophen, 사진 - 분열뿐만 아니라 신경 세포의 칼슘 센서의 C-말단 도메인에 칼슘 2 + 협회에 대한 반응 속도 아래로 모니터링 할 PBD의 응용 프로그램스트림 규제 요소 길항제 변조기 (DREAM)가 제공됩니다. CA는 2 +는 10 마이크로 초 이내에 사진 출시 된 CA로부터 2 + DM-nitrophen하고 ~ 300 마이크로 초의 시간 상수 unphotolysed 케이지에 다시 바인딩합니다. 한편, apoDREAM의 존재 밀리 초의 시간 단위로 발생하는 추가적인 운동은 관찰하고 단백질에 결합하는 리간드를 반영한다. 생물학적 시스템의 구조적 전환을 조사하는 PBD의 응용 프로그램은 어떻게 든 수단의 어려움으로 인해 제한되었습니다; 강력하고 재현 PBD 신호를 달성하기 위해 프로브와 펌프 빔의 예를 들어 힘든 정렬. 그러나, 계측 셋업의 세심한 디자인, 온도의 정확한 제어, 및 프로브 및 펌프 광의 조심 배향 광범위에 시분 볼륨 및 엔탈피 변화의 모니터링을 허용 일관되고 견고한 PBD 신호를 제공 10 마이크로 초 약 200 밀리 초까지 시간 규모. 또한, modific에서등 동일한 온도, 버퍼 구성, 광 셀 방향, 레이저 파워, 아래 샘플과 참조 흔적의 검출을 보장하기 위해 실험 절차의 관리 포인트는 크게 측정 반응 볼륨과 열량의 실험 오차를 줄일 수 있습니다.
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Protocol
1. 샘플 준비
- 샘플 준비하고 원하지 않는 uncaging을 방지하기 위해 어두운 방에있는 모든 샘플 조작을 수행하십시오.
- 50 mM의 HEPES에 N, N, N ', N'- 테트라 키스 [(옥시 카르 보닐) 메틸] -1,2 - 에탄 디아민) - (2 - 니트로 -4,5 - 디메 톡시 페닐) - DM-nitrophen ((1 가용화 버퍼, 100 ㎜의 KCl, 400 μM의 최종 농도로 pH를 7.0 (= 350 ㎚ ε 4,330 M -1 cm -1 9).
- [DM-nitrophen] : [칼슘 2 +]의 바람직한 비율을 달성하기 위해 0.1 M 주식 솔루션에서 염화칼슘을 추가합니다. 10 μM보다 큰 칼슘 2 + 협회 K d의 단백질, [칼슘 2 +]의 비율 : 1:1 [DM-nitrophen는] uncaged DM-nitrophen에 사진 출시 칼슘 2 +의 바인딩을 방지하는 것이 바람직하다 . 사실, 칼슘의 90 %는 결합 단백질 ~ 10 ㎚ 및 400 ㎜로 DM-nitrophen 및 CA 2 +의 총 농도로 DM-nitrophen의 K의 D 값을 고려K d (으)로 = 10 μM은 apoform에있을 것입니다. 한편, K의 D <10 μM과 단백질에 결합하는 칼슘 2 +의 연구를 위해, 그것은 [칼슘 2 +] 감소하는 것이 바람직의 :과 칼슘 2 + 착물을 방지하기 위해 0.95 [DM-nitrophen] 비를 APO- 단백질 케이지 사진 해리 사전.
- 기준 화합물 K 3 가용화 [철 (III) (CN)를 6] 또는 샘플과 동일한 버퍼 나 2 CRO 4.
2. 실험 설정하기
- 기본적인 실험 구성은도 2에 도시된다.
- 1mm로 프로브 빔의 직경 (HE-Ne 레이저의 632 nm의 출력, ~ 5 mW의 레이저 파워)를 조정하고 온도에 배치 셀의 중심을 통해 프로브 빔을 전파하는 핀홀 (P 2)를 사용 M 1 거울을 사용하여 셀 홀더를 통제했다.
- 프로브 빔의 중심을 샘플 뒤에 거울 (M 2)를 사용하여위치에 민감한 검출기의 중심에.
- 베스트 개의 다이오드와 바닥이 다이오드뿐만 아니라 감지기의 좌측 및 우측에서 두 개의 다이오드 사이의 전압 차 사이의 전압의 차이가 있음을 이러한 방식으로, 검출기의 중심에서 프로브 빔을 초점 제로.
- YAG 레이저, FWHM 5 NSEC)이 355 nm의 레이저 거울 사이에 3mm의 핀홀 (P 1)를 사용 :이어서, 펌프 빔의 직경, Q-스위치의 Nd 355 nm의 출력을 형성.
- 도 2에서와 같이 큐벳의 중심을 통해 펌프 빔 Copropagate. 그것은 두 개의 레이저 빔이 측정 가능한 편향 각 및 PBD 신호 따라서 높은 진폭을 구하는 것이 거의 동일 직선 방식으로 광학 셀의 중심을 통해 전파되는 것이 중요하다. 실험 조건 하에서, 프로브 및 펌프 빔의 교차 각도가 15 ° 미만이다.
- 프로브 및 펌프를 정렬 기준 화합물을 사용하여더 긴 시간 척도 (~ 100 밀리 초)에서 양호한 S / N 비와 안정 PBD 진폭, 즉 만족 PBD 신호를 달성하기 위해 빔.
- 355 nm의 레이저 미러의 증분 조정하여 프로브 빔에 대하여 펌프 빔의 위치를 조정한다.
- 위치 검출기에 민감한이 상하 포토 다이오드 사이의 차이로서 PBD 기준 신호의 진폭을 측정한다. PBD 신호는 빠른 시간 규모 (<10 마이크로 초)에 진폭의 급격한 증가를 나타내고 그림 3에서와 같이 100 밀리 초 척도에서 안정적으로 유지해야합니다. PDB 진폭의 총 변동성에 슛은 신호 진폭의 5 % 내에서하고 신호 재현성는 주로 진동에 의해 영향을받습니다.
- 흡수 된 여기 레이저 파워 온 아인슈타인의 개수에 PBD 신호의 선형 의존성, E의 측정에 의해 방출 열 에너지에 대하여 PBD 신호 진폭의 선형성을 확인= A는 여기 파장에서의 흡광도 기준에 대응한다 (1-10-A).
- 레이저 아래 전력 약 1,000 μJ 및 다 광자 흡수와 각각 펌프 빔 전력의 감소를 방지하기 위해 여기 파장 0.5 미만에서 샘플 / 기준 화합물의 흡광도를 유지하고, PBD 신호의 선형성을 보장한다.
3. PBD 측정
- 참조를 위해 PBD 추적의 측정으로 시작합니다. × 1.0 cm 1.0 cm 또는 1.0 cm × 0.5 cm 석영 셀에 참조 화합물의 솔루션을 배치하고 온도 조절 홀더에 셀을 배치합니다. 두 경로의 길이는 비교 PBD의 진폭을 제공한다.
- 3 ° C.의 온도 증가와 함께 16-35 ° C의 온도 범위에서 온도의 함수로서 상기 기준 PBD 신호를 검출
- 각 온도 변화에 따라, 위치에 민감한 검출기에 프로브 빔의 위치를 확인하고 다시필요한 경우, 검출기의 중심 위치를 조정한다.
- 식 2에 따른 함수로 [(DN / DT) / C의 P의 ρ] 용어를 PBD 신호의 선형성을 확인합니다.
- 참고 측량 등의 광학 셀의 동일한 방향을 유지하는 기준 화합물과 동일한 광학 셀에 시료 용액을 배치.
- 참고 용으로 동일한 온도 범위 내에서 샘플 PBD 트레이스를 감지하고 [(DN / DT) / C의 P의 ρ] 용어에 대하여 샘플 PBD 진폭의 선형성을 확인.
4. 데이터 분석
편향의 크기 때문에 수학 식 1에 따라 샘플 가열 (ΔV 번째) 및 비열 적 부피 변화 (ΔV의 nonth)에 체적 변화에 정비례한다 : 
샘플 (S의 진폭) 및 기준 (r)로 PBD 신호는 각각 수학 식 2 및 3을 사용하여 설명 될 수있다. 
PBD 신호 장비 응답 매개 변수 (K)에 비례하고 아인슈타인의 수는 흡수 된 (E). 식 2의 첫 번째 항은, (DN / DT) (1/ρC의 P) Q 인해 용매에 공개 열에 신호 변화에 해당한다. DN / DT 용어 굴절률의 온도 의존성의 변화를 나타내고, ρ는 용매의 밀도이며, C는 P의 열용량이다. 모든 파라미터 증류수 알려져있다 증류수 및 적절한 버퍼 기준 화합물에 대한 PBD 신호를 비교하여 완충액에 대해 결정될 수있다. Q 열 returne의 양용매 D. ρ (DN / D ρ) 기간은 10 ~ 40 °의 C (10)로부터의 온도 범위에서 온도에 독립적 인 단위가없는 상수이다. Δn ABS 용어 인해 용액의 흡수 종의 존재에 굴절율의 변화에 대응하고, 프로브 광의 파장이 용액 중의 어떤 종의 흡수 스펙트럼에 상대적으로 시프트 된 경우에는 무시할 수이다. 기준 화합물 (R)에서 발생하는 신호는 E H는 ν는 여기 파장에서 광자 에너지 식 3으로 표현된다 E H는 ν = 80.5 만 kcal / 몰 355 nm의 여기를위한.
- 도 3에서와 같이 사전 트리거 및 포스트 트리거 PBD 신호 간의 차이로서 PBD 기준 신호의 진폭을 가지고 간다. 유사한 방식으로, 고속 (A 발 빠르게)의 진폭을 결정하고 느린 단계 (A 발 느린) 샘플 PBD 신호.
- 악기 응답 매개 변수, K를 제거 기준에 대한 PBD 신호의 진폭에 의해 샘플 PBD 신호의 진폭을 확장하십시오. 기준 신호에 대한 샘플 신호의 비율은 수학 식 4를 부여하고 같이 쓸 수있다 :
- 이 방정식을 사용하여 솔루션 (Q)과 비열 부피 변화 [의 플롯의 각각 기울기와 절편,에서 사진 개시 반응과 관련된 (ΔV의 nonth) (S / R) E에 출시 된 열을 결정 H의 ν] 온도에 따라 기간 [(DN / DT) (1/ρCp)] 대 용어.
- 반응 볼륨과 빠르고 느린 과정에 대한 엔탈피의 변화를 결정하는 식 5-7에 따라 적절한 양자 수율에 관찰 된 볼륨과 엔탈피 변화를 확장하려면.
동력학은 10 마이크로 초 ~ 200 밀리 초 사이의 시간 스케일로 발생으로 다단계 공정의 경우, 양 및 반응의 각 단계와 관련된 엔탈피 변화가 결정될 수있다. 각 단계에 대한 진폭 및 수명은 볼륨 및 엔탈피 변화의 시간 프로파일을 설명하는 함수 F (t)에 데이터를 피팅에 의해 분석된다.
α 0의 빠른에 해당하고 난의 느린 각각의 프로세스에 해당하는 α와 τ는 어디에서 각 반응 단계의 수명입니다. FO 속도 상수의 온도 의존성 가입일R 개별 프로세스가 활성화 엔탈피 및 엔트로피 매개 변수를 쉽게 아 이어링 플롯을 사용하여 측정 할 수있다 (내가 = 1 / τ K).
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Representative Results
PBD의 대표적인 예는 칼슘 2 +의 DM-nitrophen에서 칼슘 2 + 사진 방출에 대한 추적은 그림 3에서 볼 수 있습니다. 느린 단계는 칼슘 2 + nonphotolysed 케이지에 바인딩을 반영하는 반면, 빠른 단계는 칼슘 2 +의 DM-nitrophen 및 CA 2 + 해방의 사진 - 분열에 해당합니다. 온도 의존 인자 [C의 P의 ρ / (DN / DT)]의 함수로서 기준 화합물의 진폭을 확장 빠르고 느린 위상 샘플 PBD 진폭의 플롯 계수 수학 식 4에 따라 그리고 관찰 된 양을 스케일링 - DM-nitrophen 사진 해리의 양자 수율에 대한 해결책과 비열 부피 변화로 방출 열을 (Φ = 0.18) (11)는 식 5-7에 따라 (ΔV 빨리 = 빠른 단계에 반응 엔탈피와 양의 값을 제공 12 ± 5 ㎖ / 몰과 ΔH 빠른 = -50 ± 20 만 kcal / 몰) 및느린 단계 (ΔV 느린 = 9 ± 5 ㎖ / 몰과 ΔH 느린 = -23 ± 12 만 kcal / 몰)에 대한. 신경원 칼슘 센서 하향 조절 요소 길항제 레귤레이터 (DREAM)의 C-말단 도메인에 칼슘 2 + 협회 (아미노산 잔기 161-256)을위한 PBD 자취는도 4에 나타낸다. 캘리포니아에 2 + 사진 - 해리, 20 ℃에서 1.3 ± 0.3 밀리의 시정과 함께 꿈의 C-말단 도메인에 사진 출시 리간드 동료 지속적인 관찰 된 속도의 온도 의존성에서, 캘리포니아의 활성화 장벽은 2 + 꿈의 C-말단 도메인에 대한 바인딩은 9.2 ± 0.4 킬로 칼로리 / 몰로 결정했다.
그림 1. 칼슘 2 +의 DM-NIT에 대한 반응 방식칼슘 2 + 트랜스 듀서에서 칼슘 2 + 트리거 구조적 전환의 사진 - 개시 rohen + 2 uncaging과 칼슘 칼슘 2 + 센서에 바인딩. 도식 프레 젠 테이션. 캘리포니아의 사진 - 분열 2 + DM-nitrophen은 무료 칼슘 2 + 농도의 증가 (프로토콜 1)로 연결, 칼슘 2 + 변환기와 수반하는 구조 전환 (프로토콜 2)에 칼슘 2 + 협회. 더 보려면 여기를 클릭하십시오 이미지 .
그림 2. 광열 빔 편향 설정입니다. 실험은 선상 구성의 광열 빔 편향 측정 업을 설정합니다. M 1 및 M
그림 3. 대표 PBD는 칼슘 2 + DM-nitrophen의 uncaging에 대한 추적합니다. (빨간색으로 표시) 칼슘 2 + DM-nitrophen에서 칼슘 2 + 사진 방출 방출하고 (파란색으로 표시) 기준 화합물에 대한 PBD 추적을. 조건 : 20 mM의 HEPES 버퍼에 1 ㎜의 DM-nitrophen, 100 밀리미터의 KCl의 pH 7.0, 0.8 mM의 칼슘 2 +. K 3 [철 (CN) 6]를 참조 화합물로서 사용 하였다. 그것은 흡수 아인슈타인의 개수의 함수로서 PBD 신호의 선형성의 범위에 있기 때문에 기준 화합물 (A 355 = 0.4)의 매치 NM 355에서 샘플의 흡광도. 0.4의 광학 밀도가 선택된다 . PBD의 흔적 (20) 트레이스의 평균을 나타내는 것은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 4. 대표 PBD는 (DREAM의 C-말단 도메인 DREAM 단백질의 C-말단 도메인의 존재 칼슘 2 + DM-nitrophen에서 칼슘 2 + 사진 - 릴리스. PBD 추적의 존재 칼슘 2 + DM-nitrophen의 uncaging에 대한 추적 그리고 검은 색으로 표시된 참조 화합물 ()에 대한 빨간색으로) 표시됩니다. 삽입 : 다른 온도에서 샘플 PBD 추적에 지수 붕괴에서 회복 역학을 사용하여 아 이어링 플롯. 조건 400 μM의 DM-nitrophen, 390 μM 염화칼슘, 20 mM의 HEPES 버퍼의 pH 7.4, 100 mM의 KCl을 500 μM의 TCEP와 동일한 조건에서 참조에 대한 추적에서 100 μM의 C-말단 DREAM. 참고를위한 PBD 추적 20 트레이스의 평균을 나타내는 샘플에 대한이 세 가지 흔적의 평균입니다.hres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
광열 방법 뒤에 물리적 원리는 광 여기 분자 주위 용매 1,12 열적 가열의 결과, 바닥 상태로 이완 진동을 통해 과량의 에너지를 소산이다. 물과 같은 용매, 이것은 급격한 체적 팽창 (ΔV 번째)를 생성한다. 여기 상태의 분자 인해 결합 벽개 / 형성 및 / 또는 분자 (들) (반 데르 소재 즉 변화의 분자 크기를 변경할 수있는 분자 구조의 변화에 비열 부피 변화 (ΔV의 nonth) 발생 광화학 프로세스를 거칠 수있다 발스 양)뿐만 아니라, 전왜 효과의 결과로 분자 (들)의 전하 분포를 바꾼다. 이는 광학 다양한 방법에 의해 탐색 할 수있는 굴절율 변화가 발생하는 조명 된 부피의 급속한 확장 초래한다. PBD는 굴절률 구배는 샘플 D에 설립한다는 사실을 활용UE 가우스 모양의 레이저 펄스를, 그림 2에서와 같이 샘플을 통해 전파 프로브 빔의 편향이 발생합니다.
광열 빔 편향 기술은 리간드 - 헴 착체 (13)와 케이지에서 생체 활성 분자의 방출 광 분열의 반응 메커니즘을 포함한 광 개시 공정의 넓은 범위에 대한 시간 분해 볼륨 및 엔탈피의 판정을 가능하게 복합 단지 14뿐만 아니라 형광 삼중 상태의 수명을 프로빙. 이 방법은 일반적으로 이러한 과도 흡수 분광 및 형광 등의 생체 고분자의 구조적인 변화를 모니터링하는 데 사용되는 기존의 기술에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다. 구조 전환이 볼륨 및 / 또는 엔탈피의 변화를 모니터링에 의해 조사됩니다 이후 본질적인 발색단 / 형광 또는 추가 단백질 라벨은 필요하지 않습니다하지만 샘플의 발색단의 존재 때문에lution는 PBD 신호를 생성 할 필요가있다. 또한, 정지 흐름 실험에서 확인되지 않는 서브 마이크로의 척도에 발생하는 프로세스에 대한 운동 매개 변수 (속도 상수, 활성화 엔탈피 및 엔트로피), PBD 측정에 쉽게 접근 할 수있다. 최근, 굴절율이나 표면 플라즈몬 공명과 biolayer 간섭으로서 파장 시프트의 변화를 조사 다른 라벨없는 검출 시스템은 각각 개발 리간드 / 단백질 및 단백질 / 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 적용되었다. 그러나, PBD는 달리, 이러한 방법은 표면에 생물학적 표적 분자의 고정화를 포함하고 그 때문에 필요한 추가 생체 고분자의 변형이 관찰 과정을 방해 할 수 있습니다.
우리는 복구 열역학 변수에 더 나은 데이터의 재현성 작은 오류의 결과 몇 가지 수정 우리의 장비 셋업을 채택했다. 특히, 적용PBD 검출기로서 사중 포토 다이오드 감쇠 장착 포스트를 사용하여 프로브 빔과 PBD 검출기 모두 추가적인 진동 격리는 PBD 신호의 노이즈를 감소하는 반면 위치 검출기 따라서 더 나은 신호 재현성에 프로브 빔의 정확한 정렬을 허용 PBD 측정에서 액세스 시간 규모를 확대했다. 우리는 실험의 감도는 장비 설치 및 실험 조건에 매우 민감 이벤트 (들)과 느린 프로세스의 모니터링 (τ> 10 밀리 초)의 척도에 의존한다는 것을 강조하고 싶습니다. 또한, 시료 셀 앞에 다이크로 익 미러를 배치하면 PBD 신호의 S / N 비율을 증가 프로브와 펌프 빔의 선상 배향을 단순화한다.
프로토콜의 중요한 단계) I의 함수로서 온도에 종속 인자 [(DN / DT) / C의 P의 ρ], ⅱ) 레이저 PO를 PBD 신호의 선형성의 정규 검증을 포함WER, 및 여기 파장에서 III) 샘플 / 기준 흡광도. 또, 샘플 및 기준 측정 온도와 동일한 실험 조건의 정밀한 제어가 강력한 PBD 측정하고 성공적인 데이터 수집을위한 결정적이다.
PBD 기술의 주요 제한은 연구 생체 고분자는 광 라벨기를 보유 요건을 생각 나게한다. 이 단점은 다양한 갇힌 화합물의 응용 프로그램에 의해 극복 될 수있다. 펩티드, 단백질 - - 사실, 갇힌 펩티드, 갇힌 단백질과 갇힌 DNA를 포함하여 새로운 caging 전략의 최근 발전은 단백질 등의 복잡한 생물학적 시스템과 프로세스를 모니터링 할 수 PBD의 광범위한 응용 프로그램을 허용 단백질 상호 작용뿐만 아니라 DNA가 접히는와 관련된 빠른 반응 속도 생리학 관련 시간 규모. 여기에 제시된 전략 깨끗이 적절한 케이지 화합물 체제와 함께, PBD 기술에 쉽게 이용 될 수 있음을 보여칼슘 2 +이 칼슘 등의 센서에 결합뿐만 아니라 단백질의 트랜스 듀서와 작은 리간드 상호 작용을 모니터링 또는 효소에 기질 분자의 결합과 관련된 구조적 전이를 밀리 초로 마이크로 특성화
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 (MCB 1,021,831, JM)와 J. & E. 바이오 메디컬 연구 프로그램 (건강의 플로리다학과, JM)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide (III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurements |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurements |
| He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurements |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurements |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmund Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlabs | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
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