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Chemistry

光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化

doi: 10.3791/50969 Published: February 18, 2014

Summary

ここでは、下流の調節エレメント拮抗モジュレータ、マイクロ秒およびミリ秒ダイナミクスおよびニューロンカルシウムセンサーへのカルシウムアソシエーションに関連付けられている構造変化のエネルギー論をモニターするために、DM-nitrophen、ケージドカルシウム化合物と組み合わせて光熱ビーム偏向技術の適用を報告。

Abstract

一緒に光音響熱量測定および熱格子と光熱ビーム偏向は、伝統的なストップを使用してアクセスできない時間スケールをミリ秒、マイクロ秒でのタンパク質の立体構造変化を誘起光の時間プロファイルボリュームとエンタルピー変化を監視する光熱方法のファミリーに属するフローの楽器。さらに、体積および/またはエンタルピーの全体的な変化がプローブされているので、これらの技術は、タンパク質およびフルオロフォアおよび発色団又はラベルを欠く他の生体高分子に適用することができる。カルシウムトランスデューサ、このような神経細胞のカルシウムセンサー、ケージカルシウム化合物、DM-nitrophenへの結合のCa 2 +に関連した構造変化のダイナミクスとエネルギー論を監視するには、フォトトリガーに遊離カルシウムの急速な(τ<20秒)増加して採用されている濃度及び関連するボリュームとエンタルピー変化は、光熱ビーム偏向技術を用いてプローブする。

Introduction

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このような光音響熱量測定、光熱ビーム偏向(PDB)、およびナノ秒レーザー励起で結合された過渡回折格子などの光熱方法は、短寿命中間体1,2の時間分解研究のための過渡光分光法への強力な代替物である。そのような過渡吸収及びIR分光法などの光学技術とは対照的に、それは周囲の発色団の吸収変化の時間プロファイルを監視、光熱技術は、熱/体積変化の時間依存性を検出し、したがって、光学の時間プロファイルを調べるための貴重なツールである「サイレント」のプロセス。これまでのところ、光音響熱量測定および過渡回折格子が正常グロビン3,4、酸素センサータンパク質とリガンドの相互作用における二原子リガンドの移行を含む光誘起プロセスのコンホメーションのダイナミクスを研究するために適用されているFixL 5、6オキシダーゼ電子とヘム-銅におけるプロトン輸送AND光化学系IIだけでなく、ロドプシン7とクリプトクロム8の立体構造力学の光異性化。

内部発色団および/またはフルオロフォアを欠いている生物学的システムへの光熱技術の適用を拡大するため、PBD技術は依存して、光トリガにケージド化合物を用い、数マイクロ秒以内に、リガンド/基質濃度の増加またはより速いと組み合わせたケージド化合物に関する。このアプローチは、ダイナミクスと内部フルオロフォアまたは発色団を欠いていると商業ストップフロー機器からはアクセスできませんタイムスケール上にあるタンパク質に結合するリガンド/基質に関連する構造変化のエネルギー論のモニタリングを可能にする。ここではダウンニューロンのカルシウムセンサーのC末端ドメインにケージ化合物の熱力学を監視するためのPBDのアプリケーション、Ca 2 +のDM-nitrophen、光切断だけでなく、Ca 2 +の関連についての動態ストリーム調節エレメント拮抗モジュレータ(DREAM)が提示されている。 Ca 2 +を、光にリリース〜300秒の時定数でunphotolysedケージにCa 2 +を 10秒と再バインド内のDM-nitrophenからのものである。一方、apoDREAMの存在下で、ミリ秒の時間スケールで発生する追加の運動を観察し、タンパク質へのリガンド結合を反映している。生物系の高次構造遷移をプローブするPBDの適用は、何らかの形で楽器の難しさのために制限されている、強力かつ再現性のPBD信号を達成するためのプローブとポンプ光の例えば骨の折れる整列。しかし、計測機器のセットアップの綿密な設計、温度の正確な制御、およびプローブとポンプ光の慎重な位置合わせは、広範な上、時間分解体積とエンタルピー変化のモニタリングを可能にする一貫性と堅牢PBD信号を提供10秒で約200ミリ秒の時間スケール。また、modificなど 、同一温度、緩衝液組成、光学セルの向き、レーザパワー、下のサンプルとリファレンストレースの検出を確実にする実験手順の管理ポイントを大幅に測定された反応容量およびエンタルピーでの実験誤差を低減します。

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Protocol

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1。試料調製

  1. サンプル調製、不要なアンケージングを防ぐために、暗室内のすべてのサンプル操作を行ってください。
  2. 50 mMのHEPESでN、N、N '、N' -テトラキス[(オキシカルボニル)メチル] -1,2 -エタンジアミン) - (2 -ニトロ-4,5 -ジメトキシフェニル) - DM-nitrophen((1を可溶化バッファー、100mMのKCl、400μMの最終濃度pHは7.0(ε350nmで = 4330 M -1 cm -19)。
  3. [DM-nitrophen]:の[Ca 2 +]の望ましい比率を達成するために、0.1M原液からのCaCl 2を追加します。 10μMを超えるCa 2 +の関連についてのK dでタンパク質については、の[Ca 2 +]の比1:1の[DM-nitrophen]はアンケージドDM-nitrophenに写真リリースのCa 2 +の結合を防ぐことが望ましい。実際に、カルシウムの90%がタンパク質に結合〜10 nMおよび400 mMのようにするDM-nitrophenおよびCa 2 +の合計濃度であることがDM-nitrophenためのK d値を考慮したK dで=10μMのはapoformになります。一方、K dは 、<10μMのタンパク質への結合のCa 2 +の研究のためには、の[Ca 2 +]低下することが好ましいのとおりでのCa 2 +の錯体形成を防止するために0.95 [DM-nitrophen]比はアポタンパク質ケージ光解離前。
  4. 参照化合物、K 3 [鉄(III)(CN)6]試料と同じ緩衝液中のNa又は2のCrO 4を可溶化する。

2。実験のセットアップ

  1. 基本的な実験構成を図2に示す。
  2. 1mmのプローブビームの直径(He-Neレーザーの632nmの出力を、〜5mWのレーザパワー)を調整し、温度が配置セルの中心を通ってプローブ光を伝播させるピンホール(P 2)を使用M 1ミラーを使用して制御セルホルダー。
  3. プローブビームを中央にサンプルの後ろにミラー(M 2)を使用します位置敏感型検出器の中心に。
  4. 検出器の左右側の上部の2つのダイオードと底部つのダイオード間の電圧差ならびに2つのダイオード間の電圧の差があるように検出器の中心にプローブビームを集束ゼロ。
  5. 2 355nmのレーザミラーの間に配置され、3mmのピンホール(P 1)を用いてYAGレーザ、FWHM 5ナノ秒):続いて、ポンプ光、Q-スイッチNdの355nmの出力の直径を形作る。
  6. 図2に示されているように、キュベットの中心を通ってポンプビームをCopropagate。これは、両方のレーザビームが測定可能な偏向角を得るために、ほぼ同一直線上に同様に光学セルの中心を通って伝播しPBD信号の振幅、高されていることが重要である。実験条件下で、プローブとポンプビームの交差角が15°未満である。
  7. プローブおよびポンプを整列させる参照化合物を使用するより長い時間スケール(〜100ミリ秒)で良好なS / N比や安定したPBD振幅、すなわち 、良好なPBD信号を達成するためにビーム。
  8. 355nmのレーザミラーの増分調整することによって、プローブビームに対してポンプビームの位置を調整する。
  9. 位置検出器上の2つの頂部と底部のフォトダイオードの間の差としてPBD基準信号の振幅を測定する。 PBD信号は速い時間スケール(<10秒)での振幅の急激な増加を示し、 図3で示したように100ミリ秒の時間スケールで安定して維持する必要があります。 PDB振幅の変動に撮影されたシュートは、信号振幅の5%以内であり、信号の再現性は、主に振動によって影響される。
  10. 吸収された励起レーザパワーオン·アインシュタインの数のPBD信号の線形依存性を、E a 測定することにより放出される熱エネルギーに対してPBD信号振幅の線形性を確認するAは、励起波長での吸光度を基準に相当=(1-10-A)。
  11. レーザパワー下記約1,000μJと多光子吸収とそれぞれポンプ光パワーの低下を防止する励起波長が0.5未満での試料/基準化合物の吸光度を維持し、PBD信号の線形性を確保する。

3。 PBD測定

  1. 参考のためにPBDトレースの測定を開始します。 1.0センチメートル×1.0センチ1.0センチメートル×0.5センチメートルの石英セルに参照化合物の溶液を配置し、温度制御されたホルダーにセルを配置する。両方の経路長は、同等のPBD振幅を提供する。
  2. 3℃の温度増分で16〜35°Cの温度範囲における温度の関数として基準PBD信号を検出
  3. 各々の温度変化の際に、位置検出器上のプローブビームの位置を確認し、再必要に応じて、検出器の中心に位置を調整します。
  4. 数2に従って、[(DN / DT)/ C Pは ρ用語の関数としてPBD信号の線形性を確認してください。
  5. 基準測定のための光学セルの同じ向きを維持参照化合物と同様の光学セル内の試料溶液を置く。
  6. PBDは、基準と同じ温度範囲でトレースし、[(のdn / dt)は/ C pが ρ用語に対して試料PBD振幅の線形性を確認する試料を検出する。

4。データ解析

偏向の大きさは、 式1に従って試料加熱(ΔVth)を非熱的及び体積変化(ΔVのnonth)による体積変化に正比例する。
式(1)
サンプルの振幅(S)および参照(r)の PBD信号は、それぞれ式2及び図3を用いて説明することができる。
式2

式3

PBD信号は、計器応答パラメータ(K)に正比例し、アインシュタインの数は、(E a)に吸収される。 式(2)の最初の項は、(DN / DT)(1/ρCp)は 、Qによる溶剤中に放出された熱への信号変化に対応する。のdn / dtの項は、屈折率の温度依存性の変化を表し、ρは溶媒の密度であり、C pは熱容量である。すべてのパラメータは、蒸留水で知られており、蒸留水および適切な緩衝液中の参照化合物についてPBD信号を比較することにより、緩衝液について決定することができる。 Qは熱の量であるreturne溶媒D。 ρ(DN / Dρ)項は、10〜40℃の10の温度範囲で温度に依存しない単位、ほぼ一定である。 Δnは腹筋用語は、溶液中の吸収種の存在のために屈折率の変化に対応し、プローブビームの波長は、溶液中の任意の種の吸収スペクトルに対してずれている場合、それは無視できる程度だ。参照化合物(r)とから生じる信号は、E さhνは光子励起波長におけるエネルギー、E hν= 355 nmの励起のための80.5キロカロリー/モルである式(3)で表される。

  1. 図3に示されているようにプリトリガ及びポストトリガーPBD信号との間の差としてPBD基準信号の振幅を取る。同様に、高速(A sの 速い )の振幅を決定し、遅い相(A sの スロー)サンプルPBD信号の。
  2. 計器応答パラメータを排除するために、Kは、参考のためPBD信号の振幅によって試料PBD信号の振幅をスケーリングする。基準信号サンプル信号の比が式(4)を与え、のように書くことができる。
    式4
  3. この式を使用して、溶液(Q)に放出された熱および[(S / R)Eのプロットのそれぞれ傾きと切片からの光開始反応に伴う非熱体積変化(ΔVのnonth)を決定温度依存的な[(DN / DT)(1/ρCp)]に対するHのν用語。
  4. 高速と低速のプロセスのための反応体積とエンタルピー変化を決定するために、 式5-7に応じて適切な量子収率が観察され、ボリュームおよびエンタルピー変化をスケール。
    "式5"
    式6

    式7

    200ミリ秒〜10秒の間の時間スケールで発生する反応速度を有する多段階プロセスについては、反応の個々のステップに関連するボリュームとエンタルピー変化を決定することができる。個々のステップのための振幅および寿命が体積とエンタルピー変化の時間プロファイルを記述する関数F(t)にデータを当てはめることによって分析される。
    式8
    α0は、A、S、 高速に対応しており、 私は、A、S、 低速 、個々のプロセスのために対応してα、τ はどこで個々の反応工程の寿命である。 foの速度定数の温度依存性からrは、個々のプロセスは、活性化エンタルピー及びエントロピーパラメータは容易にアイリングプロットを用いて決定することができる(i = 1 から/τiの k個)。

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Representative Results

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PBDの代表的な例は、Ca 2 + DM-nitrophenからのCa 2 +放出光は、図3に示されているトレース。遅い位相がCA 2 + nonphotolysedケージとの結合を反映しているのに対し、FASTフェーズは、Ca 2 +のDM 、nitrophenおよびCa 2 +の解放の光切断に対応しています。温度依存係数[C のpρ/(のdn / dt)が〕の関数として基準化合物の大きさにスケーリング高速および低速相用試料PBD振幅のプロット因子数4に従って、観察された量をスケーリングする- DM-nitrophenの光解離のための量子収量を解決し、非熱体積変化の放熱(Φ= 0.18)11は、 式5-7に従って(ΔV 速い = FASTフェーズのための反応エンタルピーとボリュームの値を提供12±5ミリリットル/モルΔH 速い = -50±20キロカロリー/モル)および遅い段階(ΔV 遅い = 9±5ミリリットル/モルΔH 遅い = -23±12キロカロリー/モル)であった。ニューロンカルシウムセンサーダウンストリーム調節エレメント拮抗レギュレータ(DREAM)(アミノ酸残基161から256)のC末端ドメインへのCa 2 +の関連付けのためのPBDトレースを図4に示す。のCa 2 20℃における1.3±0.3ミリ秒の時定数を有するDREAMのC末端ドメインに+光解離、光放出リガンド会合の際に観察された速度定数の温度依存性から、Caのための活性化障壁は、2 +は DREAMのC末端ドメインへの結合は、9.2±0.4キロカロリー/モルであると決定された。

図1
図1。 Ca 2 +のDM 、NITのための反応スキームCa 2 +の振動子におけるCa 2 +トリガー構造遷移の光開始のrohen +2アンケージングおよびCaのCa 2 +センサーに結合する。概略図。 Ca 2 +の光開裂+ DM-nitrophenは、Ca 2 +変換器との併用構造転移(プロトコル2)の遊離Ca 2 +濃度(プロトコル1)が増加し、Ca 2 +の関連性につながります。 拡大表示するには、ここをクリックしてください画像

図2
図2。光熱ビーム偏向セットアップ。コリニア構成における光熱ビーム偏向の測定のための実験セットアップ。 M 1とM 355は、高エネルギーのNdを表す:YAGレーザーミラーは、L 1は、検出器、P 1及びP 2の前方に位置する凸レンズを表すポンプを形成し、それぞれ、ビーム径をプローブするためにピンホールを表し、DMは、ダイクロイックミラーである。 F 1は、500nmロングパスフィルタを表す。挿入図:光熱効果によるビーム偏向。原因媒質の温度勾配に作成された屈折率勾配を通過するプローブ光は、角度θだけ偏向され、偏向角は、位置敏感型検出器を用いて測定される。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

図3 図3。代表PBDは、Ca 2 + DM-nitrophenのアンケージングのためにトレースします。のCa 2 +(赤で表示)DM-nitrophenと(青で表示)基準化合物からのCa 2 +の光リリースリリースのPBDトレースを。条件:20 mMのHEPES緩衝液中の1mM DM-nitrophen、100のKClのpH 7.0および0.8のCa 2 +。 K 3 [Fe(CN)6]を参照化合物として使用した。それが吸収されたアインシュタインの数の関数としてPBD信号の線形性の範囲内であるので、参照化合物( 波長355nm = 0.4)のそれと一致した波長355でのサンプルの吸収が0.4の光学密度が選択される。 PBDトレースは20トレースの平均を表す。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

図4コンテンツ幅FO = "5インチ":SRC = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4.jpg"幅= "600PX" />
図4。代表PBDがドリームのC末端ドメイン DREAMタンパク質のC末端ドメインの存在下でのCa 2 + DM-nitrophenからのCa 2 +の光放出のために。PBDの存在下でのCa 2 + DM-nitrophenのアンケージングのためのトレース赤で示されている)と黒で示さ参考化合物()のために。挿入図:異なる温度でのサンプルPBDトレースに指数関数的減衰から回収された動力学を用いて、アイリングプロット。条件400μMの20のHEPES緩衝液pH7.4中のDM-nitrophen、390μMのCaCl 2、100μMのC末端DREAM、100 mMのKClおよび500μMのTCEPと同じ条件での参照のトレース。参考のためにPBDトレースは20トレースの平均を表し、サンプルのために3つのトレースの平均値であること。hres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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Discussion

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光熱方法の背後にある物理的な原理は、光励起分子は周囲の溶剤1,12の熱加熱で、その結果、基底状態に振動緩和を経由して余分なエネルギーを消費するということです。水などの溶媒の場合、これは急激な体積膨張(ΔVth)を生成する。励起状態の分子はまた、結合開裂/形成および/ ​​または分子の(ファンデ、すなわち変化の分子の大きさを変えることができる分子構造の変化に非熱体積変化(ΔVのnonth)につながる光化学プロセスを受けることができるス体積)、ならびに電歪効果をもたらす分子の電荷分布を変化させる。これは、光の様々な方法によって調べることができる屈折率変化を発生する照明体積の急速な拡大をもたらす。 PBDは、屈折率勾配は、サンプルdにおいて確立されたという事実を利用するガウス形状レーザパルスのUE 図2に示されているように、試料を通って伝播プローブビームの偏向を引き起こす。

光熱ビーム偏向技術は、リガンド-ヘム複合体13と保持器からの生物活性分子の放出光開裂の反応機構を含む光開始プロセスの広い範囲の時間分解体積およびエンタルピー変化の決定を可能に化合物複合体14だけでなく、蛍光体の三重項状態の寿命をプロービングする。このアプローチは、一般に、過渡吸収分光法と蛍光としての生体高分子の構造変化を監視するために使用される従来の技術と比較していくつかの利点を提供しています。そのサンプル中の発色団の存在が、構造的な遷​​移は、ボリューム内および/またはエンタルピーの変化を監視することによって、プローブされるため、イントリンシックな発色団/フルオロフォアまたは追加のタンパク質標識は必要ありませんlutionはPBD信号を生成する必要がある。また、ストップフロー実験で解決されていないマイクロ秒以下のタイムスケール上で発生するプロセスの速度論的パラメータ(速度定数、活性化エンタルピーとエントロピー)は、PBD測定で簡単にアクセスできます。最近、屈折率又は表面プラズモン共鳴および生物層干渉法として波長シフトの変化を調べる他のラベルフリー検出システムは、それぞれ、現像およびリガンド/タンパク質およびタンパク質/タンパク質相互作用を研究するために適用した。しかしながら、PBDとは異なり、これらのアプローチは、表面上に生物学的標的分子の固定化を伴い、それのため、必要な追加の生体高分子修飾が観察され、プロセスを妨害する可能性がある。

我々はいくつかの変更をより良いデータの再現性、回収した熱力学パラメータの小さい方の誤差が生じ、当社計装セットアップを採用しています。具体的には、アプリケーション四フォトダイオード減衰支柱を使用してプローブビームとPBDの検出器の両方の付加的な振動絶縁をPBD信号のノイズを減少したPBD検出器は、位置検出器上のプローブビームの正確な整列、したがってより良好な信号の再現を可能としてPBDの測定値でアクセス時間スケールを拡大した。私たちは、実験の感度は、イベント(複数可)のタイムスケールに依存し、より遅いプロセス(τ> 10ミリ秒)の監視は計測機器のセットアップおよび実験条件に非常に敏感であることを強調したいと思います。また、試料セルの前にダイクロイックミラーを配置するPBD信号のS / N比を高める、プローブとポンプビームの共線配置を単純化する。

プロトコルの重要なステップは、i)の関数としての温度依存性因子、[(DN / DT)/ C Pが ρ]、II)レーザーPOをPBD信号の線形性の定期的な検証を含んでWER、励起波長におけるiii)の試料/参照吸光度。さらに、サンプルおよび基準測定のための温度および同一の実験条件の正確な制御は、ロバストPBD測定およびデータ収集に成功するために重要である。

PBD技術の主な制限は、研究され、生体高分子が光標識基を担持する必要性を思い出させる。この欠点は、種々のケージド化合物の適用によって克服することができる。ペプチド、お​​よびタンパク質 - - タンパク質相互作用だけでなく、DNAは上の折りたたみに関連する速い反応速度実際、ケージドペプチド、ケージタンパク質やケージDNAを含む新しい監禁戦略の最近の開発は、タンパク質などの複雑な生物学的システムとプロセスを監視するためのPBDの幅広いアプリケーションを可能にし生理学的に関連する時間スケール。ここに提示戦略は、明らかに適切なケージ化合システムと組み合わせて、PBD技術は容易に使用することができることを実証Ca 2 +のカルシウムセンサーに結合するだけでなく、タンパク質の変換器の小さなリガンドの相互作用を監視するためにまたは酵素などを基質分子の結合に関連する構造遷移をミリ秒マイクロ秒を特徴付ける

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

この作品は、全米科学財団(MCB 1021831、JM)とJ.&E.生物医学研究プログラム(保健フロリダ部、JM)によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid Life Technologies D-6814 DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) Sigma Adrich 0909C HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III) Sigma Aldrich 702587 reference compound for PBD measurements
Sodium chromate Sigma Aldrich 307831 reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm Edmund Optics 54-179 use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,  LeCroy Wave Surfer 42Xs 400 MHz bandwith
Nd:YAG laser Continuum ML II pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror Edmund Optics 47-324 laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror Edmund Optics 43-532 visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm Edmund Optics 62-649 pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens Thorlabs LB1844 a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror Thorlabs DMLP505 a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter Andower 500FH90-25 a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder Quantum Northwest FLASH 300  

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References

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Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection. J. Vis. Exp. (84), e50969, doi:10.3791/50969 (2014).More

Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection. J. Vis. Exp. (84), e50969, doi:10.3791/50969 (2014).

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