Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler

doi: 10.3791/50969 Published: February 18, 2014

Summary

Burada mikrosaniye ve milisaniyelik dinamikleri ve nöronal kalsiyum sensör, aşağı akış düzenleyici öğe Antagonist modülatörüne kalsiyum bağlanma kapasitesi ile bağlandığı yapısal değişikliklerin enerjileri izlemek için bir kafesli kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen ile kombinasyon halinde fototermal ışın saptırma tekniğin bir uygulama rapor .

Abstract

Birlikte fotoğraf-akustik kalorimetrisinden ve termal mazgal Fototermal ışın saptırma geleneksel Dur kullanarak erişilebilir değil zaman ölçekler milisaniye mikrosaniye proteinlerin yapısal değişimlere neden ışığın zaman profil hacim ve entalpi değişimleri izlemek fototermal yöntemleri ailesine ait -akış aletleri. Hacim ve / veya genel entalpi değişiklikleri sondalandı Ek olarak, bu teknikler, bir florofor ve bir kromofor veya etiket protein eksikliği ve diğer biomacromolecules uygulanabilir. Ca 2 ile ilişkili yapısal değişikliklerin dinamikleri ve enerjikliğin izlemek için + kalsiyum dönüştürücüler gibi nöronal kalsiyum sensörler, kafesli bir kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen, fotoğraf-tetik serbest kalsiyum hızlı bir (τ <20 mikro-saniye) artışı istihdam edilmektedir bağlanma konsantrasyon ve bununla bağlantılı ve entalpi değişiklikleri fototermal ışın saptırma tekniği kullanılarak sondalandı.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Böyle foto akustik kalorimetrisine, fototermal ışın saptırma (PDB) ve nanosaniye lazer uyarma ile birlikte geçici mazgal gibi foto-termal yöntemler kısa ömürlü ara 1,2 zaman çözüme çalışmaları için optik spectroscopiesle geçici güçlü bir alternatif temsil eder. Bu tür geçici emme ve IR spektroskopisi gibi optik teknikler, aksine, bu çevreleyen kromofor soğurma değişimlerin zaman profilini izlemek, fototermal teknikleri optik zaman profilleri araştırılması için değerli araçlar ısı / hacim değişikliklerini gösteren bir zaman-bağımlılığı tespit etmek ve bu nedenle "sessiz" süreçleri. Şimdiye kadar, foto akustik kalorimetri ve geçici ızgara başarılı globinlerine 3,4, oksijen sensörü protein ile ligand etkileşimlerine atomlu ligand göçü de dahil olmak üzere foto-neden olduğu işlemlerin yapısal dinamiklerini incelemek için uygulanmış FixL 5, 6 oksidazlar elektron ve hem-bakır proton nakliye Birnd fotosistem II olarak rodopsin 7 ve 8 kriptokrom konformasyonel dinamiğinde verilmedi-izomerizasyon.

Bir iç kromofor ve / veya flüorofor eksik biyolojik sistemlere fototermal tekniklerinin kullanılmasını genişletmek için, PBD teknik olarak, foto-tetikleyiciye kafesli bileşiğinin kullanılması birkaç mikrosaniye olan ligand / alt-tabaka konsantrasyonunda bir artış ile ya da daha hızlı birleştirildi kafesli bileşik üzerinde. Bu yaklaşım sağlar ligand / substrat bir iç flüoroforu veya kromofora eksik olan proteinler ve ticari stop akış araçlar tarafından erişilebilir olmayan zaman-ölçeğinde bağlama ile ilişkili yapısal değişikliklerin dinamikleri ve enerjilerin izlenmesi. Burada kafes bileşiğin, Ca 2 + termodinamik DM-nitrophen, foto-yarılma hem de nöronal kalsiyum sensörünün C-terminal alanına Ca2 + Birliği için kinetik aşağı izlemek için PBD bir uygulamadere Düzenleyici Eleman rakip Modülatör (DÜŞ) sunulmuştur. Ca 2 + 10 mikro-saniye içinde foto-serbest Ca 2 + DM-nitrophen ve ~ 300 mikro saniye bir zaman sabiti ile bir unphotolysed kafesine rebinds. Diğer taraftan, apoDREAM mevcudiyetinde milisaniye ölçekte oluşan ek bir kinetik gözlenen ve proteine ​​bağlanma ligandı yansıtmaktadır. Biyolojik sistemlerde konformasyonel geçişler araştırmak üzere PBD uygulama bir şekilde etkili zorluklar nedeniyle sınırlıdır; güçlü ve yeniden üretilebilir bir PBD sinyal elde etmek için prob ve pompa ışınının, örneğin zorlu bir hizalama. Ancak, alet set-up titiz bir tasarım, sıcaklığın bir hassas kontrolü, ve prob ve pompa ışın dikkatli bir hizalama geniş bir zaman içinde çözünen hacmi ve entalpi değişiklikleri izlenmesine olanak sağlar tutarlı ve sağlam PBD sinyalini sağlamak 10 mikro saniye olduğu yaklaşık 200 msn den zaman ölçeği. Buna ek olarak, modific Invb aynı sıcaklık, tampon bileşimi, optik hücre yönelim, lazer gücü altında örnek ve referans izleri tespit sağlamak için deneysel işlemin ations anlamlı ölçülen reaksiyon hacimleri ve entalpilerinin yılında deneysel hatayı azaltır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Örnek Hazırlık

  1. Numune hazırlama ve istenmeyen uncaging önlemek için karanlık bir odada bütün numune manipülasyonlar yürütmek.
  2. 50 mM HEPES içinde N, N, N ', N'-tetrakis [(oksi-karbonil) metil] -1,2-etandiamin) - (2-nitro-4 ,5-dimetoksi-fenil) - DM-nitrophen ((1 çözünürleştirilir tampon, 100 mM KCI, 400 uM'lik nihai konsantrasyona kadar pH 7.0 (350m ε = 4330 M-1cm-1 9).
  3. [DM-nitrophen]: [Ca2 +] arzu edilen bir oran elde etmek için 0.1 M stok çözeltiden CaCl 2 ekleyin. 10 uM 'den büyük Ca 2 + ilişkisi için Kd ile proteinleri için, [Ca2 +] oranı: 1:1 [DM-nitrophen] Uncaged DM-nitrophen fotoğraf-serbest Ca2 + bağlanmasını önlemek için tercih edilir, . Gerçekten de, bir kalsiyum bağlayıcı proteinin% 90 ~ 10 nM ve 400 mM olmak DM-nitrophen ve Ca2 + toplam konsantrasyonu olduğu DM-nitrophen için Kd değeri dikkate alınarakK d = 10 uM apoform olacaktır. Öte yandan, Kd <10 uM olan proteinlere bağlanarak Ca 2 + çalışması için, bu, [Ca2 +] azaltmak için tercih edilir: Ca2 + kompleksleşmesini önlemek için 0.95 [DM-nitrophen] oranını apo- protein kafes fotoğraf ayrışma önce.
  4. Referans bileşiği, K 3 çözünürleştirilir [Fe (III) (CN) 6], ya da numune ile aynı tampon maddesi içinde Na 2 CrO 4,.

2. Deney ayarlama

  1. Temel deneysel konfigürasyon Şekil 2'de gösterilmiştir.
  2. 1 mm prob kirişin çapı (He-Ne lazerinin 632 nm çıkışı, ~ 5 mW lazer gücü) ayarlamak ve bir sıcaklığa yerleştirilmiş bir hücrenin merkezi aracılığıyla prob demeti yaymak için bir pim deliği (P 2) kullanarak Bir M 1 ayna kullanarak hücre tutucu kontrollü.
  3. Sonda kiriş ortalamak için örnek arkasına bir ayna (2 M) kullanarakpozisyon duyarlı dedektör merkezi üzerinde.
  4. En iyi iki diyotlar ve alt iki diyot gibi, dedektörün sağ ve sol tarafında, iki diyot arasındaki voltaj farkı arasındaki gerilim farkıdır ki bu şekilde detektör ortasına sonda kiriş Odak sıfır.
  5. YAG lazer FWHM 5 nsn) ile nano iki 355 nm lazer ayna arasına yerleştirilmiş bir 3 mm iğne deliği (P 1) kullanılarak: Daha sonra, pompa demetinin çapı, Q-anahtarlı Nd bir 355 nm çıkış şekli.
  6. Şekil 2'de gösterildiği gibi küvet merkezinden pompa ışını Copropagate. Her iki lazer ışınları, ölçülebilir bir sapma açısı ve PBD sinyalin böylece yüksek amplitüdü elde etmek için, yaklaşık eş doğrusal bir şekilde optik hücrenin merkezine doğru yayılır önemlidir. Deneysel koşullar altında, prob ve pompa kiriş kesişme açısı en az 15 ° 'dir.
  7. Prob ve pompayı hizalamak için bir referans bileşik kullanınuzun zaman ölçeklerinde (~ 100 msn) üzerinde iyi bir S / N oranı ve istikrarlı PBD genlik, yani tatmin edici bir PBD sinyal elde etmek için ışın.
  8. 355 nm lazer aynası artımlı ayarlanması ile prob huzmesine nisbetle pompa kirişin konumunu ayarlayın.
  9. Pozisyon hassas detektörü, iki üst ve alt fotodiyotlar arasında bir fark olarak PBD referans sinyalinin genliğini ölçün. PBD sinyali hızlı bir zaman ölçekli (<10 mikro-saniye) üzerinde genlik hızlı bir artış gösterir ve Şekil 3 'de gösterildiği gibi, 100 milisaniye ölçeğinde stabil kalmalıdır. PDB genlik vurdu değişkenliği atış sinyal genliğinin% 5 içinde ve sinyal uyarlık esas titreşimlerden etkilenir.
  10. Emilen uyarım lazer gücü ve Einsteins sayısına PBD sinyalinin doğrusal bağımlılığı, E a ölçerek çıkan ısı enerjisi ile ilgili olarak PBD sinyal amplitüdünün doğrusallığını kontrol= A uyarım dalga boyunda, referans absorbans karşılık gelen (1-10-A).
  11. Lazer gücü altında, yaklaşık 1000 μJ ve multiphoton emme ve sırasıyla pompa ışını güç azalmayı önlemek için uyarım dalga boyu en az 0.5 'de örnek / referans bileşiği absorbans tutun ve PBD sinyalinin doğrusallığını sağlar.

3. PBD Ölçümler

  1. Referans için PBD izlerin ölçümü ile başlayın. Bir 1.0 cm x 1.0 cm ve 1.0 cm x 0.5 cm kuvars hücrede referans bileşiği çözeltisi yerleştirin ve ısı kontrollü tutucu hücreyi yerleştirin. Her iki yol uzunlukları karşılaştırılabilir PBD genlik sağlar.
  2. 3 ° C sıcaklık artışı ile 16-35 ° C sıcaklık aralığı içinde, sıcaklığın bir fonksiyonu olarak referans PBD sinyalini algılar
  3. Her sıcaklık değişimi üzerine, pozisyon duyarlı dedektör prob ışınının pozisyonunu kontrol edin ve yenidenGerekirse, dedektörün merkezine konumunu ayarlamak.
  4. Denklem 2'ye göre bir fonksiyonu olarak [(dn / dt) / C p ρ] terimi PBD sinyalinin doğrusallığını kontrol edin.
  5. Referans ölçümü için optik hücrenin aynı yönde tutmak referans bileşiği için olan ile aynı optik hücre içindeki örnek çözeltisi yerleştirin.
  6. Referans için aynı sıcaklık aralığında, örnek PBD izleri tespit eder ve [(dn / dt) / C p ρ] terimi ile ilgili olarak örnek PBD genlik doğrusallığını kontrol edin.

4. Veri Analizi

Sapmanın büyüklüğü nedeniyle Denklem 1'e göre numune ısıtma (ΔV inci) ve ısısal olmayan hacim değişikliği (ΔV nonth) için hacim değişikliği ile doğrudan orantılıdır:
Denklem 1
Numunenin (A S genliği) Ve referans (A r) PBD sinyal sırasıyla Denklemler 2 ve 3 kullanılarak tarif edilebilir.
Denklem 2

Denklem 3

PBD sinyali gösterge yanıt parametre (K) ile doğrudan orantılıdır ve Einsteins sayısının emilen (E a). Denklem 2'de ilk terim, (dn / dt) (1/ρC p) Q, bağlı çözücü bırakılan ısı, sinyal değişiklik karşılık gelir. Dn / dt vadeli kırılma endeksinin sıcaklığa bağlı değişimi temsil, ρ çözücü yoğunluğu, C p ısı kapasitesi. Tüm parametreler, damıtılmış su ile tanınırlar ve damıtılmış su içinde ve uygun bir tamponda, referans bileşik için bir PBD sinyalinin karşılaştırılması ile bir tampon çözeltisi için belirlenebilir. Q ısı returne miktarıdırçözücüye d. Ρ (dn / d ρ) terimi, 10-40 ° C'de 10 arasındaki sıcaklık aralığında, sıcaklık-bağımsız olan bir birim daha sabittir. Δn abs terimi nedeniyle çözeltide emici türlerin varlığı kırılma indeksi değişimine karşılık gelen ve sonda ışınının dalga boyu çözelti içinde herhangi bir türün absorpsiyon spektrumları göre kaydırılır eğer bulunuyor ihmal edilebilir. Referans bileşik (A r) kaynaklanan sinyal E h ν, uyarma dalga boyunda foton enerjisi Denklem 3 ile ifade edilir E h ν = 80.5 kcal / mol 355 nm uyarma için.

  1. Şekil 3'te gösterildiği gibi Ön tetikleme ve sonrası PBD tetikleme sinyali arasındaki fark olarak referans PBD sinyalinin genliğini al. Benzer bir şekilde, hızlı (A s hızlı) genliğini belirlemek ve yavaş faz (A s yavaş) Numune PBD sinyalinin.
  2. , Alet tepki parametresi K ortadan referans için PBD sinyalinin genliği ile numune PBD sinyalinin genliğini ölçeklemek için. Referans sinyalin numune sinyalinin oranı Denklem 4 verir ve benzeri gibi yazılabilir:
    Denklem 4
  3. Bu denklemi kullanılarak, çözeltinin (Q) ve termal olmayan bir hacim değişikliği [bir arsa sırasıyla eğim ve kesişim noktası, bir foto-başlatılan reaksiyon ile bağlantılı (ΔV nonth) (A s / A r) E bırakılan ısıyı tespit h ν] sıcaklık bağımlı vadeli [(dn / dt) (1/ρCp)] karşı terim.
  4. , Reaksiyon hacmi ve hızlı ve yavaş bir süreç için entalpi değişimlerini belirlemek Denklem 5-7 göre uygun kuantum verimi gözlenen hacim ve entalpi değişimi büyütmek için.
    "Denklem
    Denklem 6

    Denklem 7

    Kinetik 10 mikro saniye olduğu ~ 200 milisaniye arasındaki bir zaman ölçeğinde meydana gelen bir çok aşamalı bir işlem için, hacmi ve reaksiyonun tek tek adımlarla bağlantılı entalpi değişiklikleri tespit edilebilir. Tek tek aşamalar için yayılmalar ve yaşam süreleri hacmi ve entalpi değişiklikleri zaman profilini açıklayan fonksiyon f (t) için veri uyması yolu ile analiz edilir.
    Denklem 8
    α 0 A s, hızlı karşılık gelir ve bir s yavaş her bir işlem için karşılık gelen ve α τ burada i bireysel reaksiyon adımlarının ömrü vardır. Fo oranı sabitinin sıcaklık bağımlılığındanr süreçleri tek tek aktivasyon entalpi ve entropi parametreler kolaylıkla Eyring araziler kullanılarak belirlenebilir (i i = 1 / τ k).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PBD temsili bir örneği, Ca 2 + DM-nitrophen Ca 2 + verilmedi-serbest bırakılması için izleri, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Yavaş faz Ca 2 + nonphotolysed kafese bağlanmasını gösterir ise, hızlı faz, Ca 2 + DM-nitrophen ve Ca 2 + kurtuluş foto-bölünmeye karşı gelmektedir. Sıcaklık bağlı faktör [C p ρ / (dn / dt)] bir fonksiyonu olarak referans bileşiğinin genliğine ölçekli hızlı ve yavaş bir faz için örnek PBD amplitüdünün arsa faktörü Denklem 4'e göre ve gözlemlenen miktarı ölçekleme - DM-nitrophen fotoğraf ayrışma için kuantum verimi solüsyonu ve ısısal olmayan hacim değişikliği salınan ısı (Φ = 0.18) 11 Denklem 5-7 göre (ΔV = hızlı hızlı fazı için reaksiyon entalpisi ve hacim değerlerini temin 12 ± 5 ml / mol ve hızlı AH = -50 ± 20 kcal / mol) veyavaş faz (ΔV yavaş = 9 ± 5 ml / mol ve AH yavaş = -23 ± 12 kcal / mol). Nöronal kalsiyum sensor Alt Düzenleyici Elemanlar Antagonist düzenleyici (RÜYANIN) 'nin C-terminal alanı için Ca 2 + federasyonu (amino asit kalıntıları 161-256) için PBD izi Şekil 4'de gösterilmiştir. Ca üzerine 2 + fotoğraf ayrışma, 20 ° C'de 1.3 ± 0.3 msn zaman sabiti ile DREAM C-terminal alanına fotoğraf yayımladı ligand İştirakler Sabit gözlenen oranı sıcaklık bağımlılığından, Ca aktivasyon bariyer 2 + RÜYANIN C-terminal alanına bağlanarak 9.2 ± 0.4 kcal / mol olduğu belirlendi.

Şekil 1
Şekil 1. Ca 2 + DM-nit için Reaksiyon ŞemasıCa 2 + dönüştürücüler Ca 2 + tetiklediği yapısal geçişin bir fotoğraf-inisiyasyon Rohen + 2 uncaging ve Ca Ca 2 + sensöre bağlanması. şematik sunumu. Ca Fotoğraf-bölünme 2 + DM-nitrophen serbest Ca 2 + konsantrasyonunda bir artışa (Protokol 1) yol açar, Ca 2 + dönüştürücü ve eşlik eden yapısal geçiş (Protokol 2) Ca 2 + dernek. büyük görmek için buraya tıklayın görüntü .

Şekil 2,
Şekil 2. Fototermal ışın saptırma set-up. Deneysel doğrudaş yapılandırmasında foto-termal ışın saptırma ölçümleri için set-up. M 1 ve M 355, yüksek enerji temsil Nd: YAG lazer aynalar, L 1, bir detektör, P 1 ve P 2 önüne yerleştirilmiş bir konveks mercek temsil eder Pompayı şekil ve sırasıyla, ışın çapı prob pinholes temsil ve DM bir dikroik ayna. F 1 500 nm uzun geçiş filtresi temsil eder. Ankastre: fototermal etkisiyle Işın saptırma. Nedeniyle bir ortamda bir sıcaklık gradyanı için oluşturulan bir kırılma indeksi gradyan üzerinden geçecek sonda ışın açısı θ tarafından saptırılır ve sapma açısı pozisyona duyarlı dedektör kullanılarak ölçülür. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3, Şekil 3,. Temsilci PBD Ca 2 + DM-nitrophen uncaging için izler. (Kırmızı ile gösterilen) Ca 2 + DM-nitrophen gelen Ca 2 + fotoğraf serbest bırakılması ve (mavi ile gösterilmiştir) referans bileşiği için PBD iz. Koşulları: 20 mM HEPES tampon maddesi içinde 1 mM DM-nitrophen, 100 mM KCI, pH 7.0 ve 0.8 mM Ca2 +. K 3: [Fe (CN) 6], bir referans bileşiği olarak kullanılmıştır. Bu absorbe Einsteins sayısının bir fonksiyonu olarak PBD sinyalin doğrusallığı aralığında olduğu, referans bileşiği (A 355nm = 0.4) bu eşleştirilmiş 355 nm de, numunenin absorpsiyonu. 0.4 optik yoğunluk seçilmektedir . PBD izleri 20 izlerinin ortalamasını temsil. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 4, içerik-width fo = "5in:" src = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4.jpg" width = "600px" />
Şekil 4. Örnek PBD (RÜYANIN C-terminal alanının RÜYA proteininin C-terminal alanı varlığında, Ca 2 + DM-nitrophen Ca 2 +-serbest bırakılması için verilmedi. PBD iz varlığında, Ca 2 + DM-nitrophen uncaging için izleri ve siyah gösterilen referans bileşiği () için kırmızı) gösterilmiştir. Ankastre: Farklı sıcaklıklarda örnek PBD iz bir üslü kurtarıldı kinetikleri Eyring arsa. Koşullar 400 uM DM-nitrophen, 390 uM CaCl2, 20 mM HEPES tampon maddesi, pH 7.4, 100 mM KCI, 500 mM TCEP ile aynı koşullar altında referans için iz 100 uM C-terminal hayal. Referans için PBD iz 20 izlerin bir ortalamasını temsil etmektedir ve örnek için üç izlerin bir ortalamasıdır.hres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fototermal yöntemleri geride fiziksel prensibi bir fotoğraf heyecanlı molekülü çevreleyen çözücü 1,12 termal ısıtma sonuçlanan, zemin durumuna titreşim rahatlama yoluyla fazla enerjiyi dağıtacağını olmasıdır. Örneğin su gibi çözücü maddeler, bu hızlı bir hacim genişlemesi (ΔV th) üretir. Uyarılmış hal moleküller de bağlı bağı kırma / formasyonu ve / veya molekül (ler) i (van der yani değişiklikler moleküler boyutları değiştirebilir molekül yapısında değişikliklere termal olmayan bir hacim değişikliklerini (ΔV nonth) neden fotokimyasal süreçleri meydana gelebilir Waals hacim), hem de electrostriction etkiler ile sonuçlanan bir molekül (ler) in yük dağılımını değiştirebilir. Bu optik çeşitli yöntemler ile problanabilir refraktif indeks değişikliği oluşturur ışıklı hacim hızlı bir genişleme ile sonuçlanır. PBD bir kırılma indeksi gradyanı numune d kurulmuş olduğu gerçeğinden yararlanırue Gauss şeklindeki lazer ışını için, Şekil 2'de gösterildiği gibi, numune boyunca yayılan bir prob kirişin sapmasına neden olur.

Foto-ışın saptırma termal teknik ligand kompleksleri heme-13 ve kafesten bir biyoaktif molekülün serbest foto-parçalanmasının reaksiyon mekanizması dahil olmak üzere, foto-başlatılan işlemler geniş bir yelpazesi için zaman çözümlü bir hacmi ve entalpi değişiklikleri tespitine olanak sağlar bileşik kompleks 14 de flüoroforun üçlü devlet ömrünü sondalama gibi. Bu yaklaşım genellikle bu tür geçici absorpsiyon spektroskopisi ve floresan gibi biomacromolecules yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan geleneksel tekniklere göre birçok avantaj sunuyor. Yapısal geçişler hacminde ve / veya izleme entalpi değişiklikleri ile sondalandı için herhangi içsel kromoforu / florofor veya ek protein etiketleme, gerekli olmasına rağmen, denenecek numunede bir kromofor varlığı çokdevrim sisi PBD sinyali üretmek için gereklidir. Buna ek olarak, stop-akış deneyleri olarak çözülmüyor submicrosecond zaman ölçeğinde, meydana gelen işlemler için kinetik parametreleri (hız sabitleri, aktivasyon entalpi ve entropi), PBD ölçümleri kolayca ulaşılabilir. Son zamanlarda, kırılma indeksi veya yüzey plazmon rezonansı ve biolayer interferometri gibi bir dalga uzunluğu kayması bir değişiklik diğer etiket sonda serbest algılama sistemleri, sırasıyla, gelişmiş ve ligand / protein ve protein / protein etkileşimleri incelemek için uygulanmıştır. Bununla birlikte, PBD farklı olarak, bu yaklaşımlar yüzeyi üzerine biyolojik hedef moleküllerin immobilizasyon içeren ve bu nedenle gerekli olan ilave biyo-makromolekül modifikasyonlar görülmektedir işlemi engelleyebilir.

Biz geri termodinamik parametrelerin daha iyi veri üretilebilmesi ve küçük hatalar sonuçlandı çeşitli değişiklikler bizim enstrümantasyon set-up benimsediler. Spesifik olarak, bir uygulamaPBD dedektörü olarak dört fotodiyot sönümlü montaj mesaj kullanan prob kiriş ve PBD detektörü ek bir titreşim izolasyon PBD sinyalinin gürültü azaldı pozisyon detektörü ve böylece daha iyi bir sinyal yeniden yapılabilmesi üzerinde prob ışınının hassas bir hizalama izin verildi ve PBD ölçümlerde erişilebilir zaman ölçekler genişletti. Biz deney duyarlılığı enstrümantasyon kurulum ve deneysel koşullara karşı son derece duyarlı olan olay (lar) ve daha yavaş süreçlerin izlenmesi (τ> 10 msn) zaman ölçeğinde bağlı olduğunu vurgulamak isterim. Aynı zamanda, numune hücresinin önünde bir dikroik ayna yerleştirmek PBD sinyalinin S / N oranını arttırarak, prob ve pompa çubuğun bir doğrudaş hizalama kolaylaştırır.

Protokolün kritik adım i) bir fonksiyonu olarak sıcaklık bağımlı faktör, [(dn / dt) / C p ρ], ii) lazer po PBD sinyalinin doğrusallık düzenli olarak doğrulanmasını içerirwer ve uyarma dalga boyunda iii) örnek / başvuru absorbans. Buna ek olarak, örnek ve referans sıcaklık ölçümleri için ve aynı deneysel koşullar hassas kontrolü sağlam PBD ölçümleri ve başarılı veri toplama için çok önemlidir.

PBD tekniğinin ana sınırlama, bir okudu biyo-makromolekül bir fotoğraf etiket grubunu taşıyan ihtiyacını hatırlatır. Bu dezavantaj, çeşitli kafesli bileşimlerinin uygulanması ile aşılabilir. Peptid ve protein - - Nitekim, kafesli peptidler, kafesli protein ve kafesli DNA dahil olmak üzere yeni caging stratejilerinin son gelişme protein içeren karmaşık biyolojik sistemleri ve süreçleri izlemek için PBD'nin genişlikte uygulanmasına olanak protein etkileşimleri gibi DNA üzerinde katlama ile ilişkili hızlı kinetik fizyolojik ilgili zaman ölçekleri. Burada sunulan strateji açıkça, uygun bir kafes sisteminde bir bileşik ile kombinasyon halinde, PBD teknikler kolayca kullanılabilir olduğunu göstermektedirCa 2 +, kalsiyum sensörleri bağlanma yanı sıra, protein dönüştürücüler küçük ligandlar etkileşimlerin görüntülenmesi ya da enzimler için substrat moleküllerin bağlanması ile ilişkili yapısal geçişleri milisaniyeye mikrosaniye karakterize

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (MCB 1021831, JM) ve J. & E. Biyomedikal Araştırma Programı (Sağlık Florida Bölümü, JM) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid Life Technologies D-6814 DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) Sigma Adrich 0909C HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III) Sigma Aldrich 702587 reference compound for PBD measurements
Sodium chromate Sigma Aldrich 307831 reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm Edmund Optics 54-179 use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,  LeCroy Wave Surfer 42Xs 400 MHz bandwith
Nd:YAG laser Continuum ML II pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror Edmund Optics 47-324 laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror Edmund Optics 43-532 visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm Edmund Optics 62-649 pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens Thorlabs LB1844 a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror Thorlabs DMLP505 a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter Andower 500FH90-25 a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder Quantum Northwest FLASH 300  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
  2. Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251, (9-10), 1101-1127 (2007).
  3. Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37, (1-3), 73-79 (1990).
  4. Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101, (7), 977-986 (2007).
  5. Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochemistry. 44, (30), 10028-10036 (2005).
  6. Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579, (14), 3014-3018 (2005).
  7. Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
  8. Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413, (1), 128-137 (2011).
  9. Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, (17), 6571-6575 (1988).
  10. Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43, (11), 3887-3892 (1965).
  11. Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
  12. Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
  13. Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44, (4), 1006-1014 (2005).
  14. Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection. J. Vis. Exp. (84), e50969, doi:10.3791/50969 (2014).More

Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection. J. Vis. Exp. (84), e50969, doi:10.3791/50969 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter