Summary
Здесь мы сообщаем применение методики отклонения фототермическая луча в сочетании с в клетке соединения кальция, DM-nitrophen, для отслеживания микросекундные и миллисекундные динамику и энергетику структурных изменений, связанных с ассоциацией кальция в нейронной датчика кальция, Переработка регуляторный элемент антагонистов модулятор .
Abstract
Отклонение Фототермическая луч вместе с фото-акустической калориметрии и термического решетки принадлежит к семейству фототермических методов, которые контролируют Время-профиля громкости и энтальпии изменения света, индуцированные конформационные изменения в белках на микросекунды до миллисекунды временные рамки, которые не доступны в режиме обычного стоп -потока инструменты. Кроме того, поскольку общий изменения объема и / или энтальпии зондируются, эти методы могут быть применены к белков и других биомакромолекул, которые не имеют флуорофор и этикетку или хромофора. Для мониторинга динамики и энергетику структурных изменений, связанных с Са 2 + привязка к кальция преобразователей, таких нейронных датчиков кальция, в клетке соединения кальция, DM-nitrophen, используется для фото-триггера быстрой (τ <20 мкс) увеличение свободного кальция концентрации и связанное с ним объема и энтальпии зондируются используя технику отклонения фототермическая луча.
Introduction
Фототермические методы, такие как фотоакустического калориметрии, прогиб фототермическая пучка (PDB), и переходных решетки в сочетании с наносекундного лазерного возбуждения представляют собой мощную альтернативу переходных оптических спектроскопии для временным разрешением исследований короткоживущих промежуточных 1,2. В отличие от оптических методов, таких как нестационарного поглощения и ИК-спектроскопии, что наблюдение за временной профиль изменения поглощения в окружающем хромофора; фототермические методы обнаружить временную зависимость изменений тепло / объем и, следовательно, являются ценными инструментами для исследования временных профилей оптически "молчаливые" процессы. До сих пор, фотоакустическая калориметрии и переходные решетки успешно применяется для изучения конформационных динамику фотоиндуцированных процессов, включая двухатомной миграции лиганда в глобинов 3,4, лиганд взаимодействия с белком кислородного датчика FixL 5, электрон и протон транспорт в гема-медь оксидазы 6й фотосистемы II, а также фото-изомеризации в родопсина 7 и конформационной динамики криптохрома 8.
Чтобы расширить применение методов фототермических в биологических системах, которых не хватает внутреннего хромофора и / или флуорофор, техника PBD сочеталась с использованием клетке соединения к фото-триггера увеличение концентрации лиганд / подложки в течение нескольких микросекунд или быстрее, в зависимости на клетке соединения. Такой подход позволяет мониторинг динамики и энергетики структурных изменений, связанных с лиганд / связывание субстрата с белками, которых не хватает внутреннего флуорофор или хромофора и на временной шкале, которые не доступны инструментов коммерческих стоп-потока. Здесь применение PBD контролировать термодинамику клетке соединения, Ca 2 + DM-nitrophen, фото-расщепление, а также кинетика для Ca 2 + ассоциации с С-концевого домена нейронной датчика кальция внизпоток регуляторный элемент антагониста модулятор (DREAM) представлена. Са 2 + является фото-освобожден от Ca 2 + DM-nitrophen в пределах 10 мкс и повторную привязку к unphotolysed клетку с постоянной времени ~ 300 мкс. С другой стороны, в присутствии apoDREAM дополнительной кинетической происходит на временной шкале миллисекунд наблюдается и отражает связывание лиганда с белком. Применение PBD, чтобы исследовать конформационные переходы в биологических системах была как-то ограничена из-за инструментальных трудностей; например трудным выравнивание зондом и пучка накачки для достижения сильного и воспроизводимый сигнал PBD. Однако тщательная разработка контрольно-измерительного настройке, точный контроль температуры и осторожны выравнивание пробного луча и насоса обеспечивают последовательный и надежный сигнал PBD, который позволяет мониторинг временным разрешением объема и изменения энтальпии на широкий временная шкала от 10 мкс до примерно 200 мс. Кроме того, Modificобъема экспериментальной процедуры, чтобы гарантировать обнаружение проб и эталонных трасс под одинаковой температурой, буферной состава, ориентации оптических клеток, мощности лазера и т.д. значительно снижает экспериментальную ошибку в измеренных реакционных объемов и энтальпий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Примеры Подготовка
- Провести подготовку образца и все образцы манипуляций в темной комнате, чтобы предотвратить нежелательную uncaging.
- Растворения DM-nitrophen ((1 - (2-нитро-4 ,5-диметоксифенил) - N, N, N ', N'-тетракис [(окси-карбонил)-метил] -1,2-этандиамин) в 50 мМ HEPES буфер, 100 мМ KCl, рН 7,0 до конечной концентрации 400 мкМ (ε 350 нм = 4330 М -1 см -1 9).
- Добавить CaCl 2 от маточного раствора 0,1 М для достижения желательного соотношения [Ca 2 +]: [DM-nitrophen]. Для белков с Уб для Ca 2 + ассоциации более 10 мкм, отношение [Ca 2 +]: [DM-nitrophen] 1:1 предпочтительнее предотвращения связывания фото-выпущен Ca 2 + в Uncaged DM-nitrophen . Действительно, с учетом стоимости С У для DM-nitrophen быть 10 нМ и общая концентрация DM-nitrophen и Ca 2 + быть 400 мм, ~ 90% кальция связывающего белкас K D = 10 мкм будет в apoform. С другой стороны, для изучения Са 2 + связывания с белками с K D <10 мкм, это предпочтительнее, чтобы уменьшить [Са 2 +]: [DM-nitrophen] отношение к 0,95 предотвратить Ca 2 + комплексообразованию с апо- белок до клетке фотодиссоциации.
- Солюбилизации Ссылочное соединение, K 3 [Fe (III) (CN) 6] или Na 2 CrO 4, в том же буфере, как для образца.
2. Настройка эксперимента
- Основная экспериментальная конфигурация показана на рисунке 2.
- Используйте отверстие под штифт (P 2), чтобы регулировать диаметр пробного луча (632 нм выходе He-Ne лазера, ~ 5 мВт мощность лазера) до 1 мм и распространять пробного луча через центр ячейки, помещенной в температуре контролируется держатель клеток с использованием М 1 зеркало.
- Используйте зеркало (м 2) за образцом для центрирования луча датчикана центре чувствительной положение детектора.
- Фокус зондирующего луча на центр детектора таким образом, что разница в напряжении между двумя верхними диодов и нижних двух диодов, а также разница в напряжении между двух диодов на левой и правой стороне детектора нулю.
- Впоследствии, форма диаметром луча накачки, в 355 нм выход добротности Nd: YAG лазера, ПШПВ 5 нс) с помощью 3 мм крошечное отверстие (P 1), расположенный между двумя 355 нм лазерных зеркал.
- Copropagate пучка накачки через центр кюветы, как показано на рисунке 2. Важно, что оба лазерные лучи распространяются через центр оптического клетки в почти коллинеарными образом, чтобы получить измеримый угла рассеяния и, следовательно, высокую амплитуду сигнала PBD. В экспериментальных условиях, угол пересечения зонда и пучков накачки меньше 15 °.
- Использование эталонного соединения для выравнивания зонд и насослуча для достижения удовлетворительного сигнал PBD, т.е. хорошим соотношением сигнал / шум и стабильной амплитуды PBD на длинных временных масштабах (~ 100 мс).
- Отрегулируйте положение луча накачки по отношению к пробного луча с помощью дополнительных регулировки 355 нм лазерных зеркал.
- Измерение амплитуды опорного сигнала PBD в виде разности между двумя верхними и нижними фотодиодов на позиционно-чувствительный детектор. Сигнал PBD должен наблюдаться быстрый рост амплитуды на быстром масштабе времени (<10 мкс) и остаются стабильными на 100 мс сроки, как показано на рисунке 3. Выстрела к выстрелу изменчивости амплитуды PDB находится в пределах 5% от амплитуды сигнала и сигнал воспроизводимость в основном пострадали от вибрации.
- Проверьте линейность амплитуды PBD сигнала по отношению к выпущенному тепловой энергии путем измерения линейную зависимость сигнала PBD на возбуждающего лазерного власти и о количестве Einsteins поглощается, E A= (1-10-A), где А соответствует исходной оптической плотности при длине волны возбуждения.
- Держите мощность лазера ниже примерно 1000 мкдж и оптическую плотность образца / эталонного соединения на длине волны менее 0,5 возбуждения, чтобы предотвратить поглощение многофотонную и уменьшение мощности луча накачки, соответственно, и обеспечить линейность сигнала PBD.
3. PBD Измерения
- Начните с измерения следов PBD для справки. Поместите раствор эталонного соединения в 1,0 см х 1,0 см или 1,0 см х 0,5 см кварцевой кювете и поместите ячейку в контролируемой температурой держателя. Обе длины путей обеспечить сравнимую амплитуду PBD.
- Обнаружение опорный сигнал PBD в виде функции температуры в диапазоне температур от 16-35 ° С с температурой приращения 3 ° С.
- При каждом изменении температуры, проверить положение зонда пучка на позиционно-чувствительный детектор и повторноотрегулировать положение в центре детектора если это необходимо.
- Проверьте линейность сигнала PBD в виде функции [(DN / ТД) / C] ρ р термин в соответствии с уравнением 2.
- Поместите раствора образца в том же оптическую кювету, как и для эталонного соединения сохраняя тот же ориентацию оптической кювете как для опорного измерения.
- Обнаружение образцы PBD следы в том же диапазоне температур, как и для ведения и проверить линейность амплитуды образец PBD по отношению к [(DN / ТД) / С р ρ] срок.
4. Анализ данных
Величина отклонения прямо пропорционально изменению объема из-за нагрева образца (ΔV й) и нетепловой изменения объема (ΔV nonth) в соответствии с уравнением 1: 
Амплитуда образца (S) И ссылка (г) PBD сигнал можно описать с помощью уравнений 2 и 3, соответственно. 
Сигнал PBD прямо пропорциональна параметра отклика прибора (K) и количество Einsteins поглощается (Е). Первое слагаемое в уравнении 2, (дп / ТД) (1/ρC р) Q, соответствует изменению сигнала из-за тепла, выделяемого в растворителе. Дп / дт термин представляет собой изменение в зависимости от температуры показателя преломления, ρ-плотность растворителя, С р-теплоемкость. Все параметры известны в дистиллированной воде и могут быть определены для буферном растворе путем сравнения сигнала PBD для сравнительного соединения в дистиллированной воде и в соответствующем буфере. Вопрос является количество тепловой Returneд в растворителе. Ρ (дп / д ρ) термин является единицей-менее постоянным, что не зависит от температуры в диапазоне температур от 10-40 ° C 10. Ап термин абс соответствует изменению показателя преломления в связи с наличием поглощающих видов в растворе, и это незначительным, если длина волны зондирующего луча смещена относительно спектров поглощения любых видов в растворе. Сигнал, возникающий от эталонного соединения (г) выражается уравнением 3, где Е ч ν является энергия фотона на длине волны возбуждения, Е ч ν = 80,5 ккал / моль для возбуждения 355 нм.
- Возьмем амплитуду сигнала опорной PBD в виде разницы между претриггер и после запуска PBD сигнала, как показано на рисунке 3. Аналогичным образом, определить амплитуду быстро (с быстро) и медленная фаза (с медленным) Сигнала образец PBD.
- Чтобы исключить параметр отклика прибора, K, масштабировать амплитуду сигнала образец PBD амплитудой сигнала PBD для справки. Отношение сигнал выборки для опорного сигнала дает уравнение 4 и может быть записана как:
- Используя это уравнение, определить тепло, выделяющееся в раствор (Q) и нетепловой изменения объема (ΔV nonth) связан с фотоинициированной реакции со склона и перехвата, соответственно, земельного [(с / т) Е ч ν] Термин в зависимости от температуры зависит перспективе [(дп / ТД) (1/ρCp)].
- Для определения объема реакции и изменение энтальпии для быстрого и медленного процесса, масштабировать наблюдаемое объем и изменение энтальпии в соответствующее квантовым выходом в соответствии с уравнениями 5-7.
Для многоступенчатого процесса с кинетика происходит на временной шкале от 10 мкс ~ 200 мс, объем и энтальпия изменения, связанные с отдельных стадий реакции может быть определена. Амплитуды и времена жизни для отдельных стадий анализируют с помощью аппроксимации данных функцией F (T), который описывает временной профиль объема и энтальпии изменений.
где α 0 соответствует с быстрым и α я соответствует с медленным для каждого отдельного процесса и τ я являются время жизни отдельных стадий реакции. Из температурной зависимости константы скорости FOг отдельные процессы (К = 1 / τ я) Энергия активации и энтропии параметры могут быть легко определены с помощью Эйринг участков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичный пример PBD следы для Ca 2 + фото-релизе от Ca 2 + DM-nitrophen показано на рисунке 3. Быстрый фаза соответствует фото-расщепления Ca 2 + DM-nitrophen и Ca 2 + освобождения, тогда как медленная фаза отражает Са 2 + привязка к nonphotolysed клетке. Участок из PBD амплитуды выборки для быстрой и медленной фазы масштабированного амплитуде эталонного соединения в виде функции температуры зависело фактора [C р ρ / (DN / ТД)] коэффициент согласно уравнению 4 и масштабирование наблюдаемое количество тепла, выделяемое в раствор и нетепловой изменения объема к квантовым выходом для DM-nitrophen фотодиссоциации (Φ = 0,18) 11 в соответствии с уравнениями 5-7 при условии, что значения энтальпии реакции и объема для быстрой фазы (ΔV быстро = - 12 ± 5 мл / моль и ΔH быстро = -50 ± 20 ккал / моль) идля медленной фазы (ΔV медленно = 9 ± 5 мл / моль и ΔH медленно = -23 ± 12 ккал / моль). PBD след за + ассоциации Са 2 к С-концевого домена нейронной датчика кальция Downstream регуляторный элемент антагониста Regulator (DREAM) (аминокислотные остатки 161-256) показаны на рисунке 4. По Ca 2 + фото-диссоциации, фото-выпущен лиганд сопоставляет С-концевого домена DREAM с постоянной времени 1,3 ± 0,3 мс при 20 ° C. Из температурной зависимости наблюдаемой константы скорости, активационный барьер для Ca 2 + привязки к C-концевого домена DREAM была определена в 9,2 ± 0,4 ккал / моль.
Рисунок 1. Реакционная схема для Са 2 + DM-нитrohen uncaging и Са 2 + привязка к датчику Са 2 +. Схематическое представление фото-инициации конформационного перехода Са 2 + запускается в Ca 2 + преобразователей. Фото-расщепление Ca 2 + DM-nitrophen приводит к увеличению свободной концентрации Са 2 + (протокол 1), Са 2 + ассоциация с + преобразователя Ca 2 и сопутствующей структурного перехода (протокол 2). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Фототермическая отклонение луча настройки. Экспериментальная установка для фото-термической измерений отклонения луча в конфигурации коллинеарном. М 1 и М
Рисунок 3. Представитель PBD следы для Ca 2 + DM-nitrophen uncaging. PBD след за + фото-релиза выпуска Са 2 от Ca 2 + DM-nitrophen (показано красным) и эталонного соединения (показан синим цветом). Условия: 1 мм DM-nitrophen в 20 мМ HEPES буфера, 100 мМ KCl рН 7,0 и 0,8 мМ Са 2 +. K 3 [Fe (CN) 6] был использован в качестве эталонного соединени. Поглощение образца при 355 нм соответствует что эталонного соединения (355 нм = 0,4). Оптическая плотность 0,4 выбран поскольку он находится в диапазоне от линейности сигнала PBD в зависимости от количества поглощенной Einsteins . Следы PBD представляют в среднем 20 следов. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Содержание-шир = "5 дюймов" FO: Пребывание "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4highres.jpg" Первоначально "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4.jpg" ширина = "600px" />
Рисунок 4. Представитель PBD следы для Ca 2 + DM-nitrophen uncaging в присутствии С-концевого домена DREAM. PBD трассировки для Ca 2 + фото-релизе от Ca 2 + DM-nitrophen в присутствии С-концевого домена DREAM белка ( показано красным) и для контрольного соединения (показано черным цветом). Вставка: Эйринг участок кинетики с использованием восстановленных из экспоненциального затухания для образца PBD следа при различных температурах. Условия 400 мкМ DM-nitrophen, 390 мкМ CaCl 2, 100 мкМ С-концевой DREAM в 20 мМ HEPES буфере, рН 7,4, 100 мМ KCl и 500 мкМ TCEP и проследить за ссылку на тех же условиях. PBD след для ссылки представляют в среднем 20 следов и что для образца составляет в среднем три следов.hres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Физический принцип фототермических методов является то, что фото-возбужденная молекула рассеивает избыточную энергию через колебательной релаксации в основное состояние, в результате чего теплового нагрева окружающего 1,12 растворителя. Для растворителей, таких как вода, это производит быстрое расширение объема (ΔV-е место). Возбужденного состояния молекулы могут также вступает в фотохимические процессы, которые приводят к нетепловыми изменения объема (ΔV nonth) из-за разрыва связи / формирования и / или изменения в молекулярной структуре, которые могут изменить молекулярные размеры молекулы (ы) (то есть изменения в ван-дер- Объем Ваальса), а также изменить распределение заряда молекулы (ами), в результате чего электрострикционных эффектов. Это приводит к быстрому расширению освещенной объема, который генерирует изменение показателя преломления, которые могут быть проверены различными оптическими методами. PBD имеет преимущество в том, что градиент показателя преломления, установленного в образец DUE в форме гауссова лазерного импульса, вызывает отклонение зонда пучка, прошедшего через образец, как показано на рисунке 2.
Фото-тепловой метод отклонения луча позволяет определять с временным разрешением объема и изменения энтальпии для широкого круга фотоинициированной процессов, включая реакционной механизма фото-расщепления лиганд-гема комплексов 13 и выпуском биоактивными молекулами, из клетки соединение комплекс 14, а также зондирование срок службы государственной флуорофором триплет. Этот подход имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами, обычно используемых для мониторинга структурных изменений в биомакромолекул, такие как спектроскопии нестационарного поглощения и флуоресценции. Нет внутренней хромофора / флуорофором или дополнительная маркировка белок не требуется, так как структурные переходы зондируются мониторинга изменений в объеме и / или в энтальпии, хотя наличие хромофора в образце такLution необходимо сформировать сигнал PBD. Кроме того, кинетические параметры (константы скорости, энтальпии активации и энтропии) для процессов, происходящих на субмикросекундном сроки, которые не могут быть разрешены в экспериментах стоп-потока, легко доступны в измерениях PBD. В последнее время другие метки, свободное системы обнаружения, проверяющие изменения в показателе преломления или сдвига длины волны, таких как поверхностного плазмонного резонанса и бислоя интерферометрии, соответственно, были разработаны и применяются для изучения лиганд / белка и белка / белковых взаимодействий. Однако, в отличие PBD, эти подходы связаны иммобилизации биологических молекул-мишеней на поверхность и необходимые, таким образом, дополнительные модификации био-макромолекулы, которые могут вмешиваться в наблюдаемый процесс.
Мы приняли несколько модификаций Наши приборы настройки, которые привели к улучшению воспроизводимости данных и мелких ошибок в восстановленных термодинамических параметров. В частности, применениеЧетырехместный фотодиод в качестве детектора PBD позволило точное выравнивание пробного луча на детекторе положения и, таким образом, лучший сигнал воспроизводимости в то время как дополнительный колебательная изоляция как пробного луча и детектора PBD с использованием затухающие монтажные сообщения снизился шум сигнала PBD и расширили временные рамки, доступные в измерениях PBD. Мы хотели бы подчеркнуть, что чувствительность эксперимента зависит от шкалы времени проведения мероприятия (ы) и мониторинга медленных процессов (τ> 10 мс) очень чувствительна к установке приборов и экспериментальных условиях. Кроме того, размещение дихроичное зеркало перед кюветы упрощает выравнивание коллинеарным пробного луча и насоса, увеличивая соотношение сигнал / шум сигнала PBD.
Критические шаги протокола включать регулярную проверку линейности сигнала PBD как функция I) зависит от температуры фактор, [(DN / ТД) / C р ρ], II) лазер РоWER, и III) образца / ссылка поглощения на длине волны возбуждения. Кроме того, точный контроль температуры и идентичных условиях эксперимента для измерения проб и эталонных имеет решающее значение для надежной измерений PBD и успешного сбора данных.
Основным ограничением PBD техники напоминает требование, чтобы учился био-макромолекулы несет в себе фото-Label Group. Этот недостаток можно преодолеть путем применения различных клетке соединений. Действительно, недавнее развитие новых стратегий арретирования включая клетке пептидов, в клетке белка и в клетке ДНК позволяет широкого применения PBD контролировать сложных биологических систем и процессов, включая белка - пептида и белка - белковые взаимодействия, а также быструю кинетику, связанные с ДНК складной на физиологически соответствующие временные рамки. Стратегия, представленные здесь ясно показывает, что в сочетании с соответствующей системой клетка соединения, способы PBD может быть легко использован дляхарактеризуют мкс до миллисекунды структурные переходы, связанные с Са 2 + привязка к датчикам кальция, а также для мониторинга небольших лигандов взаимодействия с белковыми преобразователей или связывание молекул субстрата для ферментов и т.д.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (MCB 1021831, JM) и Дж. & программы биомедицинских исследований Е. (Флорида Департамента здравоохранения, JM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide (III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurements |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurements |
| He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurements |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurements |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmund Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlabs | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
- Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
- Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).
- Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).
- Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).
- Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).
- Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).
- Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
- Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).
- Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).
- Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
- Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
- Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).
- Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
