Summary
Aqui descrevemos uma aplicação da técnica de deflexão do feixe fototérmica em combinação com um composto de cálcio enjaulado, DM-nitrophen, para monitorar microssegundo e milissegundo dinâmica e energética de mudanças estruturais associadas com a associação de cálcio para um sensor de cálcio neuronal, Downstream Elemento Regulador Antagonista modulador .
Abstract
Deflexão do feixe Photothermal conjunto com foto-acústica calorimetria e ralar térmica pertence à família de métodos fototérmicos que monitorar o tempo de perfil de volume e entalpia mudanças de luz induzidas mudanças conformacionais em proteínas em microssegundos para milissegundo prazos que não são acessíveis através de parada tradicional -fluxo de instrumentos. Além disso, uma vez que as alterações globais de volume e / ou entalpia são sondados, estas técnicas podem ser aplicadas às proteínas e outras biomacromoléculas que carecem de um fluoróforo e um rótulo ou cromóforo. Para monitorar a dinâmica e energética de mudanças estruturais associadas ao Ca 2 + ligação a transdutores de cálcio, tais sensores de cálcio neuronais, um composto de cálcio enjaulado, DM-nitrophen, é empregado para foto-trigger um aumento rápido (τ <20 ms) em cálcio livre concentração eo volume associado e entalpia mudanças são detectados usando feixe fototérmica técnica deflexão.
Introduction
Métodos foto-térmico, como a calorimetria fotoacústica, deflexão do feixe fototérmica (APO), e ralar transitória juntamente com excitação laser de nanossegundos representam uma alternativa poderosa para transitória espectroscopia óptica para estudos resolvido em tempo de curta duração intermediários 1,2. Em contraste com as técnicas ópticas, tais como a absorção transiente e espectroscopia de infravermelho, que acompanhar o perfil do tempo de alterações de absorção do cromóforo circundante; técnicas fototérmicos detectar o tempo-dependência de alterações de calor / volume e, portanto, são ferramentas valiosas para investigar os perfis de tempo de opticamente processos de "Silêncio". Até agora, calorimetria fotoacústica e ralar transitória tem sido aplicado com sucesso para estudar a dinâmica dos processos de conformação induzida por fotografias, incluindo a migração ligante diatômico em globinas 3,4, ligante com a proteína sensor de oxigênio FixL 5, elétrons e transporte de prótons em heme-oxidases de cobre 6 umaª fotossistema II, bem como foto-isomerização em rodopsina 7 e dinâmica conformacional em cryptochrome 8.
Para expandir a aplicação de técnicas de fototérmicos aos sistemas biológicos que faltam um cromóforo e / ou fluoróforo interna, a técnica de PBD foi combinado com a utilização do composto de foto-enjaulado gatilho um aumento na concentração do ligando / substrato dentro de alguns microssegundos ou mais rápido, dependendo no composto enjaulado. Esta abordagem permite o monitoramento da dinâmica e energética de mudanças estruturais associadas com a ligação do ligante / substrato para as proteínas que estão faltando um fluoróforo interna ou cromóforo e em escala de tempo que não são acessíveis por instrumentos stop-flow comerciais. Aqui uma aplicação de PBD para monitorar a termodinâmica do composto gaiola, Ca 2 + DM-nitrophen, foto-clivagem, assim como a cinética de Ca 2 + associação para o domínio C-terminal do sensor de cálcio neuronais de Downfluxo Reguladora Elemento Antagonista modulador (sonho) é apresentado. O Ca 2 + é de Ca-lançado foto 2 + DM-nitrophen dentro de 10 ms e religa a uma gaiola unphotolysed com uma constante de tempo de ~ 300 ms. Por outro lado, na presença de um apoDREAM cinética adicional que ocorre na escala de tempo de milisegundos é observada e reflecte a ligação da proteína ligando. A aplicação do PBD para investigar transições conformacionais em sistemas biológicos tem sido de alguma forma limitada devido às dificuldades instrumentais, por exemplo árdua alinhamento da sonda e feixe de bomba para alcançar um sinal de PBD forte e reprodutível. No entanto, uma concepção meticulosa de uma instrumentação de configuração, um controle preciso da temperatura, e um alinhamento cuidadoso do feixe de sonda e uma bomba de proporcionar um sinal de PBD consistente e robusto que permite a monitorização do volume de resolução por tempo e mudanças de entalpia numa ampla escala de tempo de 10 ms para aproximadamente 200 ms. Além disso, modificções do procedimento experimental para assegurar a detecção de vestígios de amostra e de referência em temperatura idêntica, a composição do tampão, a orientação da célula óptica, a potência do laser, etc reduz significativamente o erro experimental em volumes de reacção medidos e as entalpias.
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Protocol
1. Preparações de amostras
- Realizar a preparação de amostras e todas as manipulações de amostra em um quarto escuro para evitar uma uncaging indesejada.
- Solubiliza-DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetoxifenil) - N, N, N ', N'-tetraquis [(oxi-carbonil) metil] -1,2-etanodiamina) em HEPES 50 mM tampão, KCl 100 mM, pH 7,0 para uma concentração final de 400 uM (ε 350nm = 4330 M -1 cm -1 9).
- Adicionar CaCl2 a partir da solução de estoque 0,1 M para atingir uma proporção desejável de [Ca 2 +]: [DM-nitrophen]. Para as proteínas com a K d para o Ca2 + associação maior do que 10 uM, a proporção de [Ca 2 +]: [DM-nitrophen] de 1:01 é preferível para evitar a ligação de Ca libertado foto-2 + para uncaged DM-nitrophen . Com efeito, considerando-se o valor de K d para o DM-nitrophen de 10 nM e a concentração total de DM-nitrophen e Ca 2 + para ser de 400 mM, a 90% de uma proteína de ligação de cálciocom a K d = 10 uM estará na apoform. Por outro lado, para o estudo de Ca 2 + de ligação para proteínas com a K d <10 uM, é preferível para diminuir a [Ca 2 +]: proporção [DM-nitrophen] de 0,95 para evitar a Ca 2 + a complexação com a apo- de proteína antes da gaiola foto-dissociação.
- Solubiliza-se o composto de referência, K 3 [Fe (III) (CN) 6] ou de Na 2 CrO 4, no mesmo tampão de amostra.
2. Configurando o Experimento
- A configuração experimental básico é mostrado na Figura 2.
- Usar um orifício para o pino (P 2) para ajustar o diâmetro do feixe de sonda (632 nm saída de laser He-Ne, ~ potência de laser 5 mW) a 1 mm e propagar o feixe sonda através do centro de uma célula colocada em uma temperatura suporte de célula controlada usando um M 1 espelho.
- Use um espelho (M 2) por trás da amostra para centralizar o feixe de provaem um centro de posição detector sensível.
- Focar o feixe de sonda no centro do detector, de tal modo que a diferença de tensão entre as duas melhores diodos e inferior dois diodos, bem como a diferença de tensão entre os dois diodos no lado esquerdo e direito do detector é zero.
- Posteriormente, a forma de um diâmetro do feixe de bomba, uma saída de 355 nm, de Q-switched Nd: YAG, FWHM 5 nseg) usando um orifício de 3 mm (P 1), colocado entre dois espelhos de laser 355 nm.
- Copropagate o feixe de bomba através do centro da tina, como demonstrado na Figura 2. É importante que os dois feixes de laser são propagadas através do centro da célula óptica em forma quase colinear para obter um ângulo de deflexão mensurável e, assim, maior a amplitude de sinal de PBD. Em condições experimentais, o ângulo do cruzamento da sonda e bomba de raios é inferior a 15 °.
- Utilizar um composto de referência para alinhar a sonda e bombafeixe de alcançar um sinal de PBD satisfatório, ou seja, uma relação S / N bom e amplitude PBD estável em longos prazos (~ 100 ms).
- Ajustar a posição da viga de bomba em relação ao feixe de prova por um ajuste incremental de 355 nm espelhos laser.
- Medir a amplitude do sinal de referência de PBD, como a diferença entre dois fotodiodos topo e de fundo sobre o detector sensível à posição. O sinal de PBD devem apresentar um rápido aumento na amplitude de uma escala de tempo rápido (<10 ms) e permanecem estáveis na escala de tempo de 100 mseg, como demonstrado na Figura 3. O tiro disparado à variabilidade da amplitude APO é dentro de 5% da amplitude do sinal e da reprodutibilidade do sinal é afetada principalmente por vibrações.
- Verifique a linearidade da amplitude do sinal de PBD em relação à energia térmica libertada medindo a dependência linear do sinal de PBD na potência do laser de excitação e sobre o número de Einsteins absorvido, e um= (1-10-A), em que A corresponde à absorvância no comprimento de onda de referência de excitação.
- Manter a potência do laser inferior a aproximadamente 1.000 μJ e absorvância da amostra de composto / referência no comprimento de onda de excitação inferior a 0,5 para evitar a absorção de multi e diminuição da potência do feixe de bomba, respectivamente, e garantir a linearidade do sinal de PBD.
3. Medidas PBD
- Comece com a medição dos vestígios de PBD de referência. Coloque a solução do composto de referência em um 1,0 centímetros por 1,0 cm ou 1,0 cm x 0,5 centímetros de células de quartzo e posicionar a célula no suporte de temperatura controlada. Ambos os comprimentos de trajeto fornecer amplitude comparável PBD.
- Detectar o sinal de referência de PBD, como uma função da temperatura no intervalo de temperatura de 16-35 ° C, com o aumento de temperatura de 3 ° C.
- A cada mudança de temperatura, verifique a posição do feixe de prova no detector sensível posição e reajustar a posição do centro do detector, se necessário.
- Verifique a linearidade do sinal de PBD, como uma função da [(dn / dt) / C p ρ] prazo de acordo com a equação 2.
- Coloque a solução de amostra na mesma célula óptica como para o composto de referência, mantendo a mesma orientação da célula óptica, para a medição de referência.
- Detectar os vestígios de PBD de amostra na mesma gama de temperaturas, como para a referência e verificar a linearidade da amplitude da amostra de PBD em relação ao [(dn / dt) / C p ρ] prazo.
4. Análise de Dados
A magnitude da deformação é directamente proporcional à variação de volume devido ao aquecimento da amostra (? V po) e alteração de volume não térmico (? V nonth) de acordo com a Equação 1: 
A amplitude da amostra (A S) E de referência (Ar) PBD sinal podem ser descritas usando as equações 2 e 3, respectivamente. 
PBD sinal é directamente proporcional ao parâmetro de resposta do aparelho (K) e o número de Einsteins absorvida (EA). O primeiro termo da equação 2, (dn / dt) (1/ρC p) Q, corresponde à mudança de sinal devido ao calor libertado para o solvente. A dn / dt termo representa a alteração em função da temperatura no índice de refracção, ρ é a densidade do solvente, C p é a capacidade de calor. Todos os parâmetros são conhecidos para a água destilada e podem ser determinadas por uma solução tampão por meio da comparação de um sinal de PBD para o composto de referência em água destilada e em um tampão apropriado. Q é a quantidade de calor Returned para o solvente. O ρ (dn / d ρ) é um termo constante sem unidades que é independente da temperatura no intervalo de temperatura de 10-40 ° C 10. Δn termo abs corresponde à variação do índice de refracção devido à presença de espécies de absorção na solução e é insignificante, se o comprimento de onda do feixe de sonda é deslocada em relação ao espectro de absorção de qualquer espécie em solução. O sinal resultante do composto de referência (Ar) é expresso pela Equação 3 em que E h ν é a energia de fotões de comprimento de onda de excitação, e h ν = 80,5 kcal / mol para 355 nm de excitação.
- Leve a amplitude do sinal de referência de PBD, como a diferença entre o sinal e pretrigger PBD pós de gatilho, conforme demonstrado na Figura 3. De um modo semelhante, determina a amplitude do jejum (A s rápido) e de fase lenta (A s lento) Do sinal da amostra de PBD.
- Para eliminar o parâmetro de resposta do instrumento, K, escalar a amplitude do sinal da amostra de PBD por a amplitude do sinal de PBD para a referência. A razão entre o sinal da amostra para o sinal de referência dá Equação 4 e pode ser escrita como:
- Usando esta equação, determine o calor libertado para a solução (Q) e não térmico mudança de volume (nonth? V) associado a uma reação iniciou-foto da inclinação e interceptação, respectivamente, de um lote de [(A s / A r) E h ν] prazo versus temperatura dependente termo [(dn / dt) (1/ρCp)].
- Para determinar o volume de reação e variação de entalpia para o rápido eo lento processo, dimensionar o volume observado e variação de entalpia para o rendimento quântico apropriado de acordo com as equações 5-7.
Para um processo de vários passos com uma cinética ocorre na escala de tempo entre 10 ms ~ 200 ms, o volume e as alterações de entalpia associada com os passos individuais de reacção pode ser determinada. As amplitudes e os tempos de vida para os passos individuais são analisadas por ajuste dos dados para a função f (t) que descreve o perfil de tempo o volume e as alterações de entalpia.
onde α 0 corresponde ao A s rápido e α i corresponde a um s lento para cada processo individual e τ i é o tempo de vida das etapas de reação individuais. A partir da dependência da temperatura da constante da taxa de for processos individuais (K i = 1 / τ i) os parâmetros de activação de entalpia e de entropia pode ser facilmente determinada através de curvas de Eyring.
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Representative Results
Um exemplo representativo de PBD traça de Ca 2 + a foto-libertação de Ca2 + DM-nitrophen é mostrado na Figura 3. A fase rápida corresponde à foto-clivagem de Ca 2 + DM-nitrophen e Ca 2 + de libertação, enquanto que a fase lenta reflecte Ca 2 + ligação para a gaiola nonphotolysed. O gráfico da amplitude de PBD amostra para a fase rápida e lenta escalado para a amplitude do composto de referência, em função do factor de dependia da temperatura [C p ρ / (dn / dt)] factor de acordo com a Equação 4 e dimensionamento do valor observado do calor libertado para a solução e de alteração de volume não térmico para o rendimento quântico para a DM-nitrophen foto-dissociação (Φ = 0,18) 11 de acordo com as Equações 5-7, desde que os valores de entalpia e no volume de reacção para a fase de jejum (? V rápido = - 12 ± 5 ml / mol e AH rápido = -50 ± 20 kcal / mol) epara a fase de lenta (slow? V = 9 ± 5 ml / mol e AH lenta = -23 ± 12 kcal / mol). O rastreio PBD para o Ca2 + associação para o domínio C-terminal do sensor de cálcio neuronal jusante Reguladora Elemento Regulador Antagonista (IDEAL) (resíduos de aminoácidos 161-256) são mostrados na Figura 4. Após a Ca 2 + foto-dissociação, associados ligando libertada-foto ao domínio C-terminal de IDEAL com a constante de tempo de 1,3 ± 0,3 ms a 20 ° C. A partir da dependência da temperatura da constante de velocidade observada, a barreira de activao para o Ca 2 + de ligação para o domínio C-terminal de IDEAL foi determinada ser de 9,2 ± 0,4 kcal / mol.
Figura 1. Esquema de reacção para o Ca 2 + DM-nitRohen uncaging e Ca 2 + ligação a um sensor de Ca 2 + apresentação. Esquema de um foto-iniciação do Ca 2 + desencadeada transição conformacional em Ca 2 + transdutores. Foto-clivagem de Ca 2 + DM-nitrophen leva a um aumento do Ca2 + livre concentração (protocolo 1), Ca 2 + para a associação de Ca 2 + e transdutor de transição estrutural concomitante (Protocolo 2). clique aqui para ampliar imagem .
Figura 2. Photothermal feixe deflexão set-up. Experimental set-up para as medições de deflexão do feixe foto-térmica na configuração colineares. M 1 e M
Figura 3. Representante PBD traça para Ca 2 + DM-nitrophen uncaging. PBD rastreamento para a liberação de Ca + 2 fotos de liberação de Ca 2 + DM-nitrophen (mostrado em vermelho) e do composto de referência (em azul). As condições de: 1 mM de DM-nitrophen em tampão 20 mM de HEPES, 100 mM de KCl, pH 7,0 e 0,8 mM Ca 2 +. 3 K [Fe (CN) 6] foi usado como composto de referência. A absorção da amostra a 355 nm correspondia ao do composto de referência (A 355nm = 0,4). A densidade óptica de 0,4 é seleccionado, uma vez que está na gama de linearidade do sinal de PBD, como uma função do número de Einsteins absorvida . Os traços PBD representam uma média de 20 traços. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Figura 4. Representante PBD traça para Ca 2 + uncaging DM-nitrophen na presença do domínio C-terminal de DREAM traço. PBD para Ca 2 + foto de liberação de Ca 2 + DM-nitrophen na presença do domínio C-terminal da proteína SONHO ( mostrado a vermelho) e para o composto de referência (mostrado em preto). Inserção: trama Eyring usando a cinética de recuperação a partir de um decaimento exponencial para o rastreio de PBD amostra a diferentes temperaturas. Condições de 400 uM DM-nitrophen, 390 uM de CaCl2, 100 mM de terminal C IDEAL em HEPES 20 mM pH 7,4, KCl 100 mM e 500 uM TCEP e rastreio para a referência, nas mesmas condições. O traço PBD para a referência representam uma média de 20 traços e que para a amostra é uma média de três traços.hres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
O princípio físico por trás de métodos fototérmicos é que uma molécula foto-animado dissipa o excesso de energia através de relaxamento vibracional para o estado fundamental, resultando em aquecimento térmico do 1,12 solvente circundante. Para solventes, tais como água, esta produz uma expansão rápida de volume (? V th). Moléculas em estado animado também podem passar por processos fotoquímicos que resultam em mudanças de volume nonthermal (? V nonth) devido à ligação clivagem / formação e / ou mudanças na estrutura molecular que podem alterar as dimensões moleculares da molécula (s) (ou seja, mudanças na van der volume de Waals), bem como alterar a distribuição de carga da molécula (s) resultando em efeitos electrostriction. Isso resulta em uma rápida expansão do volume iluminado que gera mudança de índice de refracção que podem ser sondadas através de uma variedade de métodos ópticos. PBD tira proveito do facto de que um gradiente de índice de refracção estabelecido na amostra due ao pulso de laser em forma de Gauss, faz com que a deflexão de um raio de sonda propagado através da amostra, como demonstrado na Figura 2.
A técnica de deflexão do feixe de foto-térmico permite a determinação do volume de resolução por tempo e variação de entalpia para uma ampla gama de processos de foto-iniciada incluindo o mecanismo de reacção de foto-clivagem dos complexos ligando-heme 13 e libertação de uma molécula bioactiva da gaiola complexo composto 14, bem como investigar a vida de estado fluorophore trio. Esta abordagem oferece várias vantagens em comparação com as técnicas tradicionais comumente usados para monitorar as mudanças estruturais na biomacromoléculas, tais como espectroscopia de absorção transiente e de fluorescência. Nenhuma intrínseca cromóforo / fluoróforo ou de marcação de proteínas adicionais são necessários uma vez que as transições estruturais são sondados por acompanhamento da evolução do volume e / ou em entalpia, embora a presença de um cromóforo na amostra de modoção é necessária para gerar sinal PBD. Além disso, os parâmetros cinéticos (constantes de velocidade, entalpia e entropia de ativação) para processos que ocorrem na escala de tempo submicrosecond, que não são resolvidos em experimentos de parada de fluxo, são facilmente acessíveis em medições PBD. Recentemente, outros sistemas de detecção livre de etiquetas que sondam uma mudança no índice de refracção ou de uma mudança de comprimento de onda, tais como ressonância de plasma de superfície e biolayer interferometria, respectivamente, foram desenvolvidas e aplicadas ao estudo de ligando / proteína e interacções proteína / proteína. No entanto, ao contrário de PBD, estas abordagens envolvem a imobilização de moléculas alvo biológicas para a superfície e, portanto, necessárias modificações bio-macromolécula adicionais que podem interferir com o processo observado.
Adotamos várias modificações nossa instrumentação set-up que resultaram em melhor reprodutibilidade dos dados e erros menores em parâmetros termodinâmicos recuperados. Especificamente, o pedido de umquadruple foto-diodo como o detector PBD permitiu um alinhamento preciso do feixe de prova no detector de posição e, assim, melhor reprodutibilidade de sinal enquanto que um isolamento de vibração adicional ao feixe de sonda e detector PBD usando postes de montagem amortecidos diminuiu o barulho do sinal e PBD ampliou os prazos acessíveis nas medições PBD. Gostaríamos de sublinhar que a sensibilidade do experimento depende da escala de tempo do evento (s) e monitoramento de processos mais lentos (τ> 10 ms) é altamente sensível às condições experimentais instalação de instrumentação e. Além disso, a colocação de um espelho dicróico em frente da célula de amostra simplifica um alinhamento colinear do feixe de sonda e uma bomba, aumentando a razão S / N do sinal PBD.
Os passos críticos do protocolo inclui a verificação regular do linearidade do sinal de PBD, como uma função de i) o factor dependente da temperatura, [(dn / dt) / C p ρ], ii) de po de laserwer, e iii) a absorvância da amostra / referência no comprimento de onda de excitação. Além disso, o controle preciso da temperatura e condições experimentais idênticas para as medições de amostras de referência e é crucial para robustas medições de PBD e a aquisição de dados com sucesso.
A principal limitação da técnica PBD lembra a exigência de que a bio-macromolécula estudou carrega um grupo de foto-label. Este inconveniente pode ser ultrapassado por aplicação de vários compostos enjaulados. Na verdade, o desenvolvimento recente de novas estratégias de engaiolamento incluindo péptidos, proteínas enjaulados em gaiolas e DNA enjaulado permite a ampla aplicação da PBD para monitorar os sistemas e os processos biológicos, incluindo complexos de proteína - peptídeo e proteína - interacções proteína, assim como a cinética rápida associada com o ADN de dobrar em escalas temporais fisiologicamente relevantes. A estratégia aqui apresentados demonstram claramente que, em combinação com um sistema composto gaiola apropriada, as técnicas de PBD pode ser facilmente empregue paracaracterizar microssegundo a milisegundo transições estruturais associadas com o Ca 2 + ligação para sensores de cálcio, bem como para monitorizar pequenas ligantes interacções com transdutores de proteínas ou de ligação de moléculas de substrato para as enzimas, etc
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) e J. & E. Programa de Pesquisa Biomédica (Florida Department of Health, JM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide (III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurements |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurements |
| He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurements |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurements |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmund Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlabs | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
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