Submillisecond Conformational Förändringar i Proteiner lösas genom fototermisk Beam Nedböjning

Summary

Här rapporterar vi en tillämpning av den fototermiska strålavböjningsenheten teknik i kombination med en bur kalciumförening, DM-nitrophen att övervaka mikrosekund och millisekund dynamik och energetik av strukturförändringar som är associerade med kalcium association till en neuronal kalciumsensor Nedströms Regulatory Element Antagonist Modulator .

Abstract

Fototermisk strålavböjningsenheten tillsammans med fotoakustisk kalorimetri och termisk galler tillhör familjen av fototermiska metoder som övervakar tidsprofil volym och entalpiförändringar av ljus inducerade konformationsförändringar i proteiner på mikrosekund att millisekund tidsskalor som inte är tillgängliga med hjälp av traditionella stopp flödesinstrument. Eftersom övergripande förändringar i volym och / eller entalpi är sonde, dessa tekniker kan tillämpas på proteiner och andra biomakromolekyler som saknar en fluorofor och eller en kromofor etikett. För att följa dynamiken och energin av strukturella förändringar i samband med ^{Ca2 +} binder till kalcium givare, sådana neuronala kalcium sensorer, en bur kalciumförening, DM-nitrophen, används för att foto utlösa en snabb (τ <20 ^ sek) ökning av fritt kalcium koncentration och tillhörande volym och entalpi ändringar sonderas med hjälp av fototermisk strålavböjningsenheten teknik.

Introduction

Fototermiska metoder såsom fotoakustisk kalorimetri, fototermisk strålavböjningsenheten (PDB), och övergående galler i kombination med nanosekund laserexcitation representerar ett kraftfullt alternativ till övergående optiska spektroskopier för tidsupplösta studier av kortlivade intermediärer ^1,2. I motsats till optiska tekniker, såsom övergående absorption och IR-spektroskopi, att övervaka tidsprofilen för absorption förändringar i kromoforen omgivningen; fototermiska tekniker detektera tidsberoende förändringar värme / volym och därför är värdefulla verktyg för att undersöka tidsprofilerna för optiskt "tysta" processer. Hittills har fotoakustisk kalorimetri och övergående galler med framgång tillämpats för att studera konforma dynamik foto-inducerade processer inklusive diatomic ligand migration i globiner ^3,4, ligand interaktioner med syresensor protein FixL ^5, elektron-och protontransport i heme-koppar oxidases ⁶ ennd fotosystem II samt foto-isomerisering i rhodopsin ⁷ och konforma dynamik i kryptokrom ^8.

För att utvidga tillämpningen av fototermiska tekniker för biologiska system som saknar en inre kromofor och / eller fluoroforen var PBD-tekniken i kombination med användning av bur förening för foto utlösa en ökning av ligand / substratkoncentration inom några mikrosekunder eller snabbare, beroende på bur förening. Detta tillvägagångssätt möjliggör övervakning av dynamik och energetics av ​​strukturella förändringar i samband med den ligand / substrat bindning till proteiner som saknar en intern fluorofor eller kromofor och om tidsskala som inte är tillgänglig för kommersiella stop-flödesinstrument. Här en tillämpning av PBD att övervaka termodynamik av buren förening, Ca ^{2 +} DM-nitrophen, foto-klyvning samt kinetiken för Ca ^{2 +} förening att den C-terminala domänen av det neuronala kalciumsensor fallandeström Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) presenteras. Ca ^{2 +} är foto-frisättas från ^{Ca2 +} DM-nitrophen inom 10 ps och rebinds till en unphotolysed bur med en tidskonstant av ~ 300 ^ sek. Å andra sidan, i närvaro av apoDREAM ytterligare kinetisk inträffar på millisekundtidsskala observeras och återspeglar den ligand som binder till proteinet. Tillämpningen av PBD att proba konformationsövergångar i biologiska system har på något sätt begränsad på grund av instrumentella svårigheter, t.ex. mödosam justering av sonden och pumpstrålen för att uppnå en stark och reproducerbar PBD signal. Emellertid en noggrann utformning av en instrumenterings set-up, en exakt kontroll av temperaturen, och en noggrann inriktning av sonden och pumpstrålen får en enhetlig och robust PBD signal som medger övervakning av tidsupplöst volym och entalpiförändringar på ett brett tidsskala från 10 ^ sek till cirka 200 msek. Dessutom MODIFICningar av den experimentella proceduren för att säkerställa upptäckt av prov-och referensspår i samma temperatur, buffertsammansättning, optisk cell orientering, lasereffekt, etc. reducerar avsevärt den experimentella fel i uppmätta reaktionsvolymer och entalpier.

Protocol

1. Exempel Beredningar

1. Utför provpreparering och alla prov manipulationer i ett mörkt rum för att förhindra en oönskad uncaging.
2. Solubilisera DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetoxifenyl) - N, N, N ', N'-tetrakis [(oxi-karbonyl) metyl] -1,2-etandiamin) i 50 mM HEPES buffert, 100 mM KCl, pH 7,0 till en slutlig koncentration av 400 ^ M (ε _350nm = 4330 M ^-1 cm ^{-1 9).}
3. Lägg _CaCl2 från 0,1 M stamlösning för att uppnå ett önskvärt förhållande mellan [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen]. För proteiner med _Kd för Ca ^{2 +} förening är större än 10 | iM, varvid förhållandet mellan [Ca ^{2 +]:} är [DM-nitrophen] av 01:01 att föredra för att förhindra bindning av fotoTillstånd Ca ^{2 +} till uncaged DM-nitrophen . I själva verket, med tanke på _Kd värde för DM-nitrophen vara 10 nM och den totala koncentrationen av DM-nitrophen och Ca ^{2 +} för att vara 400 mM, ~ 90% av ett kalciumbindande proteinmed _Kd = kommer 10 ^ M vara i apoform. Å andra sidan, för studier av ^{Ca2 +-bindning} till proteiner med _Kd <10 | iM, är det att föredra att minska [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen] förhållande till 0,95 för att förhindra att Ca ^{2 +} komplexbildning med apo- proteinet före buren foto dissociation.
4. Solubilisera referensföreningen, K ₃ [Fe (III) (CN) _6] eller Na ₂ CrO _4, i samma buffert som för provet.

2. Ställa in experimentet

1. Den grundläggande experimentella konfigurationen visas i figur 2.
2. Använd ett stifthål (P ₂₎ för att justera diametern hos sondstråle (632 nm utgången från He-Ne-laser, ~ 5 mW lasereffekt) till 1 mm och utbreda sondstrålen genom centrum av en cell placeras i en temperatur kontrollerad cellhållare med hjälp av en M ₁ spegel.
3. Använd en spegel (M ₂₎ bakom provet att centrera sondstrålenpå ett centrum för lägeskänslig detektor.
4. Fokus sondstrålen mitt på detektorn på ett sådant sätt att skillnaden i spänning mellan de två övre dioderna och botten två dioder samt skillnaden i spänning mellan de två dioderna på vänster och höger sida av detektorn är noll.
5. Därefter forma en diameter av pumpstrålen, en 355 nm utgången från Q-switchad Nd: YAG-laser, FWHM 5 nsek) med användning av ett 3 mm hål (P ₁₎ placerades mellan två 355 nm laser speglar.
6. Copropagate pumpstrålen genom mitten av kyvetten som visas i fig 2. Det är viktigt att de båda laserstrålarna propageras genom centrum av den optiska cellen i nästan kolinjära sätt för att erhålla en mätbar avböjningsvinkel och därmed hög amplitud hos PBD-signal. Under experimentella förhållanden, är vinkeln för skärningen mellan sond-och pump balkar är mindre än 15 °.
7. Använd en referenssammansättning för att rikta in proben och pumpenstråle för att uppnå en tillfredsställande PBD-signal, dvs en bra signal / brusförhållande och stabil PBD amplitud på längre tidsskalor (~ 100 ms).
8. Justera placeringen av pumpstrålen med avseende på sondstrålen genom en stegvis justering av 355 nm-laserspeglarna.
9. Mät amplitud av PBD referenssignalen som en skillnad mellan två övre och undre fotodioder på den lägeskänsliga detektorn. I PBD-signalen bör uppvisa en snabb ökning av amplituden på en snabb tidsskala (<10 ^ sek) och förblir stabila på 100 ms tidsskala som visas i figur 3. Skottet till skott variabilitet av det preliminära budgetförslaget amplituden ligger inom 5% av signalens amplitud och signalen reproducerbarhet påverkas främst av vibrationer.
10. Kontrollera linjäritet hos PBD signalamplituden med avseende på den frigjorda värmeenergin genom att mäta det linjära beroendet av PBD-signalen på exciteringslasereffekten och på antalet Einsteins absorberas _Ea= (1 till ^10-A), där A motsvarar referens absorbans vid excitationsvåglängden.
11. Håll lasereffekt under ca 1000 μJ och absorbansen av provet / referensföreningen vid excitationsvåglängden mindre än 0,5 för att förhindra att multi absorption och minskning av pumpstrålens effekt, respektive, och säkerställa linjäritet PBD signalen.

3. PBD Mätningar

1. Börja med mätningen av de PBD spår för referensen. Placera lösningen av referensföreningen i en 1,0 cm x 1,0 cm eller 1,0 cm x 0,5 cm kvartscell och placera cellen i temperaturkontrollerad hållaren. Båda väglängd ger jämförbara PBD amplitud.
2. Detect referens PBD signalen som en funktion av temperaturen inom temperaturområdet 16 till 35 ° C, varvid temperaturen i steg om 3 ° C.
3. Vid varje temperaturförändring, kontrollera positionen hos sondstråle på den lägeskänsliga detektorn och rejustera positionen till centrum av detektorn om nödvändigt.
4. Kontrollera lineariteten hos PBD signalen som en funktion av [(dn / dt) / _Cp ρ] Termen enligt ekvation 2.
5. Placera provlösning på samma optiska cellen som för referensföreningen hålla samma orientering av den optiska cellen som för referensmätning.
6. Identifiera prov PBD spår i samma temperaturområde som för referens och kontrollera linearitet prov PBD amplitud i förhållande till [(dn / dt) / C _p ρ] sikt.

4. Dataanalys

Storleken av deformationen är direkt proportionell mot volymförändringen på grund av prov uppvärmning _{(AV: e)} och nonthermal volymförändring (AV _nonth) enligt ekvation 1:

Amplituden av provet (A _S) Och referens (A _r) PBD signal kan beskrivas med användning av ekvationerna 2 och 3, respektive.

PBD signal är direkt proportionell mot den parameter instrumentets svar (K) och antalet Einsteins absorberas _(Ea). Den första termen i ekvation 2, (dn / dt) (1/ρC _p) Q, motsvarar den signaländring på grund av den värme som frigörs till lösningsmedlet. Den dn / dt termen representerar den temperaturberoende förändringen av brytningsindex, är ρ densiteten för lösningsmedlet, är _Cp värmekapaciteten. Alla parametrar som är kända för det destillerade vattnet och kan bestämmas för en buffertlösning genom att jämföra en PBD-signal för referensföreningen i destillerat vatten och i en lämplig buffert. Q är den mängd värme som returned till lösningsmedlet. Den ρ (dn / d ρ) term är en enhet-mindre konstant som är temperaturoberoende i temperaturområdet 10-40 ° C ^10. An _abs term motsvarar förändringen i brytningsindex till följd av närvaron av absorberande species i lösningen och det är försumbar om våglängden av sondstrålen är förskjuten relativt den absorptionsspektra för alla arter i lösningen. Den signal som uppstår från referensföreningen (A _r) uttrycks genom Ekvation 3 där E _{​​h ν} är fotonenergi vid excitationsvåglängden, E _{h ν} = 80,5 kcal / mol för 355 nm excitation.

1. Ta amplituden hos referens PBD signal som skillnaden mellan den pretrigger och eftertrigg PBD signal såsom visas i fig. 3. På ett liknande sätt, bestämmer amplituden för den snabba (A _er ^snabbt) och långsam fas (A _s ^långsam) Av provet PBD signalen.
2. För att eliminera svarsparameterinstrument, K, skalas amplituden hos provet PBD signalen med amplituden hos PBD signalen för referensen. Förhållandet mellan provsignalen till referenssignalen ger Ekvation 4 och kan skrivas som:
   
   
3. Med användning av denna ekvation, fastställa den värme som frigörs till lösningen (Q) och nonthermal volymförändring (AV _nonth) associerad med en fotoinitierad reaktion från lutningen och interceptet, respektive, av en avsättning av [(A _s / A _r) E _{h ν]} term kontra temperaturberoende term [(dn / dt) (1/ρCp)].
4. För bestämning av reaktionsvolymen och entalpiändringen för den snabba och den långsamma processen, skala den observerade volym och entalpiändringen till lämplig kvantutbyte i enlighet med ekvationerna 5-7.
   
   
   
   
   
   För en flerstegsprocess med kinetik som inträffar på tidsskalan mellan 10 ^ s ~ 200 ms, kan volymen och entalpi förändringar i samband med de enskilda stegen i reaktionen bestämmas. Amplituderna och livslängder för de enskilda stegen analyseras genom anpassning av data till funktionen F (t) som beskriver tidsprofilen för volymen och entalpiförändringar.
   
   där α ₀ motsvarar den A _s ^snabb och α _I motsvarar A _s ^långsam för varje enskild process och τ _i är livstiden för de individuella reaktionsstegen. Från temperaturberoende hastighetskonstanten for enskilda processer _(Ki = 1 / τ _i) aktivering entalpi och entropi parametrar kan lätt bestämmas med användning av Eyring plottningar.

Representative Results

Ett representativt exempel på PBD spårar för Ca ^{2 +} foto-frisättning från ^{Ca2 +} DM-nitrophen visas i figur 3. Den snabba fasen motsvarar den bild-spjälkning av Ca ^{2 +} DM-nitrophen och Ca ^{2 +} frigörelse, medan den långsamma fasen reflekterar ^{Ca2 +-bindning} till nonphotolysed bur. Handlingen av provet PBD amplitud för den snabba och långsamma fasen skalas till amplituden för referensföreningen som en funktion av temperaturen beroende faktor _[Cp ρ / (dn / dt)] faktorn enligt ekvation 4 och skalning av den observerade mängden av värme som frigörs till lösningen och nonthermal volymförändring till kvantutbytet för DM-nitrophen foto-dissociation (Φ = 0,18) ¹¹ enligt ekvationerna 5-7 ges värdena för reaktions entalpi och volym för den snabba fasen (AV _snabbt = - 12 ± 5 ml / mol och AH _snabb = -50 ± 20 kcal / mol) ochför den långsamma fasen (AV _långsam = 9 ± 5 ml / mol och AH _långsamt = -23 ± 12 kcal / mol). The PBD trace för Ca ^{2 +} förening att den C-terminala domänen av det neuronala kalciumsensorn nedströms regulatoriska elementet Antagonist regulator (Dream) (aminosyrarester 161-256) visas i Figur 4. Vid ^{Ca2 +} foto-dissociation, foto släppt ligand associerar till C-terminal domän av DREAM med tidskonstant på 1,3 ± 0,3 ms vid 20 ° C. Från temperaturberoendet för den iakttagna hastighetskonstanten, aktiveringsbarriär för ^{Ca2 +-bindning} till den C-terminala domänen av DREAM bestämdes till att vara 9,2 ± 0,4 kcal / mol.

Figur 1. Reaktionsschema för ^{Ca2 +} DM-nitRohen uncaging och ^{Ca2 +} binder till en ^{Ca2 +-sensor.} Schematisk presentation av en foto-initiering av ^{Ca2 +} utlöste konforma övergång i Ca ^{2 +-givare.} Foto-klyvning av ^{Ca2 +} DM-nitrophen leder till en ökning av den fria ^{Ca2 +-koncentrationen} (protokoll 1), ^{Ca2 +} association till ^{Ca2 +} givare och samtidig strukturell övergång (protokoll 2). Klicka här för att visa en större image .

Figur 2. Fototermisk strålavböjningsenheten set-up. Försöksuppställningen för foto-termisk balk deformationsmätningarna i collinear konfigurationen. M ₁ och M 355 representerar hög energi Nd: YAG laser speglar, L ₁ representerar en konvex lins placerad framför en detektor, P ₁ och P ₂ representerar småhål att forma pumpen och sonden stråldiameter, respektive, och DM är en dikroisk spegel. F ₁ representerar ett 500 nm långpassfilter. Infällt: Beam nedböjning på grund av fototermiska effekten. Sonden stråle som färdas genom ett brytningsindex gradient skapas på grund av en temperaturgradient i ett medium böjs genom en vinkel θ och avböjningsvinkel mäts med en positionskänslig detektor. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Representant PBD spår för ^{Ca2 +} DM-nitrophen uncaging. PBD spår för ^{Ca2 +} foto-frisättning frisättning från ^{Ca2 +} DM-nitrophen (visas i rött) och referensförening (visas i blått). De villkor: 1 mM DM-nitrophen i 20 mM HEPES-buffert, 100 mM KCl, pH 7,0 och 0,8 mM Ca ^{2 +.} K ₃ [Fe (CN) _6] användes som referensförening. Absorptionen av provet vid 355 nm matchade den för referensföreningen (A _355nm = 0,4). Den optiska densiteten av 0,4 är valt eftersom det är inom området av lineariteten hos PBD-signalen som en funktion av antalet av Einsteins absorberas . De PBD spår representerar ett genomsnitt av 20 spår. Klicka här för att visa en större bild .

innehåll-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4.jpg" width = "600px" />
Figur 4. Representativa PBD spårar för Ca ^{2 +} DM-nitrophen uncaging i närvaro av C-terminala domänen av dröm. PBD trace för Ca ^{2 +} foto-frisättning från ^{Ca2 +} DM-nitrophen i närvaro av C-terminala domänen av DREAM protein ( visas i rött) och för referensföreningen (visade i svart). Infällt: Eyring tomten med hjälp av de som återvunnits från en exponentiellt avtagande till provet PBD spår vid olika temperaturer kinetik. Villkor 400 ^ M DM-nitrophen, 390 ^ M _CaCl2, 100 ^ C-terminal DREAM i 20 mM HEPES-buffert pH 7,4, 100 mM KCl och 500 mikroM TCEP och spåra för referensen på samma villkor. Den PBD spår för referens representerar ett genomsnitt av 20 spår och att för provet är ett genomsnitt av tre spår.hres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Den fysikaliska principen bakom fototermiska metoder är att en fotoexciterade molekylen avleder överskottsenergi via vibrational relaxa till grundtillståndet, vilket resulterar i termisk uppvärmning av omgivande ^1,12 lösningsmedel. För lösningsmedel, såsom vatten, ger detta en snabb expansion volym _{(AV: e).} Excited state molekyler kan också genomgå fotokemiska processer som resulterar i nonthermal förändringar volym (AV _nonth) på grund av att bindningsklyvning / bildning och / eller förändringar i molekylstruktur som kan förändra de molekylära dimensionerna av molekyl (er) (dvs. ändringar i van der Waals-volym), samt ändra laddningsfördelningen hos molekylen (er) som resulterar i electrostriction effekter. Detta resulterar i en snabb expansion av den belysta volymen som genererar brytningsindexförändring som kan sonderas med en mängd olika optiska metoder. PBD drar fördel av det faktum att ett brytningsindex-gradient etablerad i provet due med den Gaussiska formade laserpuls, orsakar avböjning av en sondstråle fortplantas genom provet som visas i Figur 2.

Den foto termisk strålavböjningsenheten teknik möjliggör fastställandet av tidsupplöst volym och entalpiförändringar för ett brett spektrum av foto-initierade processer inklusive reaktionsmekanismen av bild-klyvning av ligand-hem komplex ¹³ och frisättningen av en bioaktiv molekyl från buren förening komplex ¹⁴ samt sondera fluoroforen triplettillstånd livstid. Den här lösningen har flera fördelar jämfört med traditionella tekniker som vanligen används för att övervaka strukturella förändringar i biomakromolekyler, såsom övergående absorptionsspektroskopi och fluorescens. Ingen inneboende kromofor / fluorofor eller extra proteinmärkning krävs eftersom strukturella övergångar sonderas genom att följa förändringar i volym och / eller i entalpi, även om närvaron av en kromofor i provet sålution är nödvändigt att generera PBD signal. Dessutom kinetiska parametrar (hastighetskonstanter, aktiverings entalpi och entropi) för processer som sker på submicrosecond tidsskalan, som inte löses i stop-flödesexperiment, är lätt tillgängliga i PBD mätningar. Nyligen har andra etikettfria detektionssystem som testar en förändring i brytningsindex eller en våglängdsförändring såsom ytplasmonresonans och BioLayer interferometri, respektive, har utvecklats och tillämpats för att studera ligand / protein och protein / protein-interaktioner. Men till skillnad från PBD, dessa metoder innebär immobilisering av biologiska målmolekyler på ytan och därför krävs ytterligare bio-makromolekyl modifieringar av det kan störa den observerade processen.

Vi har antagit flera ändringar vår instrumentering set-up som resulterade i bättre reproducerbarhet uppgifter och mindre fel i återvunna termodynamiska parametrar. Specifikt för tillämpningen av enfyrdubbel fotodioden som PBD detektor möjliggjorde en exakt inriktning av sondstrålen på lägesdetektorn och således bättre signal reproducerbarhet medan en ytterligare vibrations isolering av både sondstrålen och PBD detektorn med dämpad upphängnings inlägg minskat bullret från PBD-signalen och expanderade de tidsskalor tillgängliga i PBD mätningar. Vi vill understryka att känsligheten hos experimentet beror på tidsskalan för evenemanget (er) och övervakning av långsamma processer (τ> 10 ms) är mycket känsliga för den instrumente setup och experimentella förhållanden. Dessutom, att placera en dikroisk spegel framför provcellen förenklar en kolinjär inriktning av sonden och pumpstrålen, ökning av S / N-förhållandet för PBD-signalen.

De kritiska stegen i protokollet innefattar regelbundna genomgångar av linearitet PBD-signalen som en funktion av i) den temperaturberoende faktor, [(dn / dt) / C _p ρ], ii) laser power, samt iii) prov / referens absorbansen vid excitationsvåglängden. Dessutom är avgörande för robusta PBD mätningar och framgångsrik datainsamling exakt kontroll av temperatur och identiska experimentella förhållanden för prov-och referensmätningar.

Den största begränsningen av PBD teknik påminner kravet att en studerade biologisk makromolekyl bär en fotoetikettgruppen. Denna nackdel kan övervinnas genom tillämpning av olika Caged föreningar. Faktum senaste utvecklingen av nya placering i kasse strategier inklusive bur peptider, bur protein och bur DNA möjliggör bred tillämpning av PBD att övervaka komplexa biologiska system och processer inklusive protein - peptid och protein - proteininteraktioner samt snabb kinetik i samband med DNA-vika på fysiologiskt relevanta tidsskalor. Den strategi som presenteras här visar tydligt att i kombination med en lämplig bur föreningen systemet, PBD tekniker kan lätt användas för attkarakterisera mikrosekund att millisekund strukturella övergångar i samband med ^{Ca2 +} binder till kalcium sensorer samt att övervaka små ligander interaktioner med proteingivare eller bindning av substratmolekyler till enzymer etc.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma Adrich	0909C	HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	reference compound for PBD measurements
Sodium chromate	Sigma Aldrich	307831	reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror	Edmund Optics	47-324	laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror	Edmund Optics	43-532	visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm	Edmund Optics	62-649	pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens	Thorlabs	LB1844	a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror	Thorlabs	DMLP505	a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter	Andower	500FH90-25	a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder	Quantum Northwest	FLASH 300