Summary
हाइपोक्सिक पल्मोनरी वासोकॉन्स्ट्रिक्शन (एचपीवी) एक महत्वपूर्ण शारीरिक घटना है जिसके द्वारा अल्वेलर हाइपोक्सिया फेफड़े परफ्यूजन वेंटिलेशन से मेल खाता है। एचपीवी में योगदान देने वाला प्रमुख संवहनी खंड इंट्रा-एकिनार धमनी है। यहां, हम 20-100 माइक्रोन के व्यास के साथ मुरीन पल्मोनरी जहाजों के एचपीवी के विश्लेषण के लिए अपने प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
एक्यूट अल्वेलर हाइपोक्सिया पल्मोनरी वासोकॉन्स्ट्रक्शन (एचपीवी) का कारण बनता है - जिसे वॉन यूलर-लिजेस्ट्रैंड मैकेनिज्म के रूप में भी जाना जाता है - जो फेफड़ों के परफ्यूजन को वेंटिलेशन से मैच करने का काम करता है। अब तक, अंतर्निहित तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । एचपीवी में योगदान देने वाला प्रमुख संवहनी खंड इंट्रा-एकिनार धमनी है। यह पोत अनुभाग एक व्यक्तिगत एकिनस की रक्त आपूर्ति के लिए जिम्मेदार है, जिसे टर्मिनल ब्रोंकिओल के फेफड़ों के डिस्टल के हिस्से के रूप में परिभाषित किया गया है। इंट्रा-एकिनार धमनियां ज्यादातर फेफड़ों के उस हिस्से में स्थित होती हैं जिन्हें कई आमतौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीकों जैसे अलग-थलग पड़ने वाले फेफड़े के फेफड़े में पल्मोनरी धमनी के दबाव को मापने या विच्छेदित समीपस्थ फेफड़े की धमनी खंडों से बल रिकॉर्डिंग1,2तक नहीं पहुंचा जा सकता है। वास्तविक समय के कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग ल्यूमिनेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा उप-दीर्घकालिक जहाजों का विश्लेषण व्यास3में 50 माइक्रोन तक के जहाजों तक सीमित है।
हम 20-100 माइक्रोन आंतरिक व्यास की सीमा में मुरीन इंट्रा-पल्मोनरी धमनियों के एचपीवी का अध्ययन करने के लिए एक तकनीक प्रदान करते हैं। यह सटीक कट फेफड़ों के स्लाइस (पीसीएलएस) में क्रॉस-सेक्शनेड धमनियों के वीडियोमॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण पर आधारित है। यह विधि 20-40 माइक्रोन के बीच आंतरिक व्यास के साथ छोटी इंट्रा-एकिनार धमनियों की वैसोरएक्टिविटी की मात्रात्मक माप की अनुमति देती है जो अल्वेलर नलिकाओं के बगल में अल्वेलर सेप्टा के गसेट में स्थित हैं और 40-100 माइक्रोन के बीच आंतरिक व्यास के साथ बड़े प्री-ऐनर धमनियों की है जो ब्रोंची और ब्रोन्चिओल्स के निकट चलती हैं। एनेस्थेटाइज्ड और हवादार चूहों में उप-दीर्घकालिक जहाजों की वास्तविक समय इमेजिंग के विपरीत, पीसीएलएस का वीडियोमॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण कतरनी तनाव से मुक्त स्थितियों के तहत होता है। हमारे प्रयोगात्मक मॉडल में दोनों धमनी खंड एक मोनोफेसिक एचपीवी प्रदर्शित करते हैं जब 1% O2 के साथ मध्यम गैसों के संपर्क में आता है और हाइपोक्सिया में 30-40 मिनट के बाद प्रतिक्रिया फीका होती है।
Introduction
अधिकांश प्रणालीगत संवहनी बिस्तरों में हाइपोक्सिया पल्मोनरी वैक्यूलेचर में हाइपोक्सिया के कारण होने वाले वासोकॉन्स्ट्रक्शन की तुलना में वासोडिलेशन को प्रेरित करता है। कम ऑक्सीजन तनाव के लिए इस फेफड़े की विशिष्ट प्रतिक्रिया को हाइपोक्सिक पल्मोनरी वासोकॉन्स्ट्रक्शन (एचपीवी) कहा जाता है, जो सेकंड के भीतर शुरुआत करता है और नॉर्मॉक्सिक वेंटिलेशन पर स्विचबैक के बाद जल्दी से उलट जाता है। हालांकि एचपीवी को 60 से अधिक वर्षों से जाना जाता है, लेकिन सेलुलर ऑक्सीजन सेंसर (एस) और सिग्नलिंग झरना (ओं) जिसके परिणामस्वरूप वासोकोंस्ट्रक्शन अभी भी बहस चल रही है। एक सापेक्ष व्यापक आम सहमति है कि हाइपोक्सिया-पैदा किए गए रेडॉक्स और आरओएस परिवर्तन एचपीवी और फेफड़े के उच्च रक्तचाप के विकास (सिल्वेस्टर एट अल में समीक्षा) के विकास के लिए आवश्यक हैं। 4 और शूमाकर एट अल। 5)हमारे अपने डेटा एचपीवी6,7में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला के जटिल द्वितीय की एक केंद्रीय भूमिका का समर्थन करते हैं। हाल ही में, वांग एट अल। ऑक्सीजन संवेदन और एचपीवी के लिए एक पूरी तरह से नई अवधारणा प्रस्तुत की: उनके डेटा के आधार पर वे प्रस्ताव करते हैं कि अल्वेलर हाइपोक्सिया आसन्न केशिकाओं द्वारा महसूस किया जाता है जिससे एंडोथेलियल कोशिकाओं की झिल्ली डीपोलराइजेशन होता है। इस प्रतिक्रिया को एंडोथेलियल कोशिकाओं के 40 गैप जंक्शनों के माध्यम से प्रचारित किया जाता है जिससे अपस्ट्रीम धमनियों की चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का संकुचन होता है8.
फेफड़ों की धमनियां वायुमार्ग के साथ चलती हैं, उनके साथ शाखा, व्यास में लगातार कमी आती है, और अंत में अल्वियोलर दीवारों में स्थित केशिका प्रणाली को रक्त की आपूर्ति करती है। यह धमनी परिसंचरण शारीरिक रूप से और कार्यात्मक रूप से अलग-अलग खंडों से बना है। दीवारों में लोचदार फाइबर की बहुतायत की विशेषता वाली समीपस्थ नाली धमनियों को पूरी तरह से मांसपेशियों वाली इंट्रा-पल्मोनरी धमनियों द्वारा पीछा किया जाता है जो काफी हद तक फेफड़े के संवहनी प्रतिरोध को नियंत्रित करते हैं। कदम-दर-कदम, ये धमनियां उन खंडों में पारगमन करती हैं जहां मांसपेशियों की परत अधूरी हो जाती है, और अंत में जहाजों चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन-इम्यूनोएक्टिव कोशिकाओं से मुक्त होते हैं। रक्त के साथ एक व्यक्तिगत फेफड़े के एकिनस खिलाने वाली इंट्रा-एकिनार धमनी आंशिक रूप से मांसपेशियों के खंड6का प्रतिनिधित्व करता है। इसी तरह, फेफड़े की धमनी प्रणाली हाइपोक्सिक प्रतिक्रिया के बारे में एक समान संरचना का प्रतिनिधित्व नहीं करती है, लेकिन क्षेत्रीय विविधता9,10को चिह्नित करती है। उदाहरण के लिए, चूहे के फेफड़ों हाइपोक्सिया से अलग समीपस्थ फेफड़े की धमनियों में एक द्विचरण प्रतिक्रिया लाती है, जो अल्प अवधि के प्रारंभिक तेजी से संकुचन को प्रदर्शित करती है, जो अधूरी छूट के बाद- एक दूसरे धीमे लेकिन निरंतर संकुचन11के बाद होती है। प्रतिरोध धमनियों में चूहा फेफड़े के परेंचिमा से पल्मोनरी धमनियों (बाहरी व्यास <300 माइक्रोन) के रूप में अलग- चौथे और पांचवें- विभाजन के रूप में, हाइपोक्सिया मोनोफैसिक कसना9का कारण बनता है। पहले से ही 1971 में ग्लेज़ियर और मरे ने हाइपोक्सिक गैस मिश्रण के साथ हवादार कुत्तों के फेफड़ों में केशिका लाल रक्त कोशिका एकाग्रता में परिवर्तन के माप से निष्कर्ष निकाला कि हाइपोक्सिया-संवहनी प्रतिरोध में वृद्धि मुख्य रूप से केशिका12के ऊपर हुई। आजकल, एनेस्थेटाइज्ड और यांत्रिक रूप से हवादार चूहों के अक्षुण्ण फेफड़ों की इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी पल्मोनरी माइक्रोवैस्कुलेचर13,14के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है। छाती की दीवार में एक गोलाकार खिड़की का उत्तेजना फेफड़ों की सतह तक सूक्ष्म पहुंच प्रदान करती है और व्यास में 50 माइक्रोन के साथ उप-बद्ध फेफड़े के जहाजों के विश्लेषण की अनुमति देती है। इस तकनीक को फिटसी-डेक्सट्रान, तबुची एट अलके अर्क के साथ जोड़कर । प्रदर्शन किया कि 30-50 माइक्रोन के व्यास के साथ केवल मध्यम आकार के धमनियों हाइपोक्सिया के लिए एक चिह्नित प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं जो 30 मिनट के बाद एक मामूली क्षीणन के साथ 60 मिनट की अवधि में निरंतर होता है। इसके विपरीत, 20-30 माइक्रोन के व्यास वाले छोटे धमनियों ने हाइपोक्सिया3के लिए केवल एक मामूली प्रतिक्रिया दिखाई। हालांकि, यह तकनीक व्यास के साथ धमनियों के विश्लेषण की अनुमति नहीं देती है जो 50 माइक्रोन के बाद से इन जहाजों फेफड़ों के ऊतकों में बहुत गहरी स्थित हैं।
मुरीन फेफड़ों की बड़ी और बहुत छोटी फेफड़े की धमनियों (जैसे उप-नापीय जहाजों) के विश्लेषण में अंतर को पाटने के लिए, हमने एक विधि अपनाई जिसे मार्टिन एट अलद्वारा वर्णित किया गया था। एयरवेज15की प्रतिक्रियाशीलता के विश्लेषण के लिए . एक एगर्ला उठे जेल इन्स्टिलिंग तकनीक के आधार पर, यह इस अपेक्षाकृत नरम और लोचदार अंग से सटीक कट फेफड़ों के स्लाइस (पीसीएलएस) की तैयारी की सुविधा प्रदान करता है। 20-100 माइक्रोन के बीच आंतरिक व्यास के साथ क्रॉस-सेक्शनेड धमनियों की पीसीएलएस वासोरेएक्टिविटी सीधे वीडियोमाइक्रोस्कोपी द्वारा देखी जा सकती है। पीसीएलएस के हाइपोक्सिक इनक्यूबेशन के दौरान दवाओं का उपयोग एचपीवी पर उनके प्रभावों के विश्लेषण की अनुमति देता है। यह विशेष महत्व का है कि इस तकनीक को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस पर भी लागू किया जा सकता है। फेफड़ों के भीतर उनके स्थान के आधार पर, हम धमनियों को क्रमशः 20-40 माइक्रोन और 40-100 माइक्रोन के आंतरिक व्यास के साथ पूर्व और इंट्रा-एकिनार जहाजों के रूप में वर्गीकृत करते हैं। एक कार्यात्मक दृश्य के तहत इंट्रा-एकिनार धमनी रक्त के साथ एक व्यक्तिगत फेफड़े की धमनी की आपूर्ति करती है और पूर्व-एकिनार धमनी पूर्ववर्ती पोत अनुभाग है। डिजिटल कैमरे पर चित्रों की रिकॉर्डिंग वासोरक्शन के बाद की मात्रा की अनुमति देती है। इस पीसीएलएस मॉडल का एक स्पष्ट गुण एंडोथेलियम पर अभिनय कतरनी-तनाव की कमी है। इसके विपरीत, perfused जहाजों में तीव्र एचपीवी कतरनी-तनाव में वृद्धि की ओर जाता है जिससे कोई रिलीज16के रूप में माध्यमिक तंत्र उत्प्रेरण । इसके अतिरिक्त, पीसीएलएस का उपयोग एक्स्ट्रापल्मोनरी न्यूरल या हार्मोनल प्रभावों के बिना एचपीवी के माप की अनुमति देता है। सेल कल्चर सिस्टम के विपरीत, उदाहरण के लिए कैनाइन पल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से तैयार17,पोत दीवार की हिस्टोलॉजिकल वास्तुकला लगभग पूरी तरह से संरक्षित है।
संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल कतरनी तनाव से मुक्त परिस्थितियों में 20-100 माइक्रोन के बीच आंतरिक व्यास के साथ अंतर-फेफड़े की धमनियों के एचपीवी के लिए जिम्मेदार संभावित आणविक ऑक्सीजन सेंसर और/या सेलुलर रास्तों के विश्लेषण के लिए एक उपयोगी तरीका प्रदान करता है ।
Protocol
1. गैस मिश्रण, उपकरण, उपकरण, और समाधान की तैयारी
यह अनुभाग प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक उपकरण और सेट-अप का वर्णन करता है। अतिरिक्त विवरण और निर्माता जानकारी साथ तालिका में पाया जा सकता है।
- निम्नलिखित गैस मिश्रण प्राप्त करें या तैयार करें:
- नॉर्मॉक्सिक गैस मिश्रण के साथ दो बोतलें 21% O2, 5.3% सीओ2, 73.7% एन2से बना है।
- हाइपोक्सिक गैस मिश्रण वाली एक बोतल जो 1% O2, 5.3% सीओ2, 93.7% एन2से बना है।
- निम्नलिखित उपकरण इकट्ठा करें:
- एक माइक्रोवेव ओवन, एगर उठे पिघलने के लिए।
- फेफड़ों के वर्गों से एगर उठे को धोने के लिए एक हीटिंग कैबिनेट (नीचे देखें)। कैबिनेट में नॉर्मॉक्सिक गैस मिश्रण के साथ एक बोतल से जुड़ी ट्यूब डालें।
- फेफड़ों को 200 माइक्रोन मोटी स्लाइस में काटने के लिए उपयुक्त रेजर ब्लेड के साथ एक कंपन। यह फायदे में है अगर वाइब्रेकोम को वाइब्रेकरोम बेसिन में बफर को ठंडा करने के लिए रेफ्रिजरेशन सेट के साथ सुसज्जित किया जाता है।
- इंट्रापल्मोनरी धमनियों के एचपीवी के विश्लेषण के लिए, एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर एक प्रवाह के माध्यम से सुपरफ्यूजन कक्ष।
- कक्ष के नीचे फेफड़ों के वर्गों के निर्धारण को सुविधाजनक बनाने के लिए, नायलॉन के तारों को प्लेटिनम रिंग (स्व-निर्मित) से जोड़ें। क्रमशः 0.7 मिलीलीटर/न्यूनतम और 6 मिलीलीटर/न्यूनतम के लिए समायोजित प्रवाह दरों के साथ एक परिष्टिक पंप के लिए परफ्यूजन चैंबर में शामिल हों।
- उपकरणों को इकट्ठा करें ताकि प्रयोगों के दौरान मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में संग्रहीत किया जाए और 21 जी x 4 3/4 कैनुलास का उपयोग करके नॉर्मॉक्सिक या हाइपोक्सिक गैस के साथ बुलबुला किया जाए। इसके अतिरिक्त गैस की बोतल से एक दूसरे कनेक्शन का उपयोग करने के लिए नॉर्मॉक्सिक/हाइपोक्सिक गैस मिश्रण परफ्यूजन चैंबर के हवा अंतरिक्ष में खिलाया जा करने के लिए अनुमति देते हैं । सुनिश्चित करें कि इस प्रणाली की सभी ट्यूब गैस तंग हैं।
- एक सीसीडी कैमरा एक ईमानदार उल्टे माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार धमनी की छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए विश्लेषण किया ।
- निम्नलिखित उपकरणों को तैयार करें:
- फेफड़ों की तैयारी के लिए: एक बाँझ विच्छेदन सेट जिसमें एक मोटा कैंची और दो जोड़े संदंश, छाती के उद्घाटन के लिए एक ठीक कैंची, एगर उठी में भरने के लिए श्वासनली में एक छेद काटने के लिए एक माइक्रोसिसर, और एग्रिस के बहिर्वाह को रोकने के लिए श्वासनली के लिए सिलाई कपास (लगभग 20 सेमी) ।
- एगर उठे के साथ वायुमार्ग को भरने के लिए: एक 2 मिलीलीटर सिरिंज को एक चतुर्थ इंडवेलिंग कैनुला (20 जी x 1 1/4) के लचीले प्लास्टिक पाइप से कनेक्ट करें।
- बफर के साथ फेफड़ों के पर्फफ्यूजन के लिए: माउस तैयार करने के लिए काम करने की जगह के ऊपर लगभग 40 सेमी बफर जलाशय के रूप में 50 मिलीलीटर सिरिंज को ठीक करें।
- बफर के बहिर्वाह के लिए: सिरिंज को एक ट्यूब से कनेक्ट करें जिससे 25 जी x 1 कैनुला जुड़ा हुआ है। के बारे में 1 बूंद/सेकंड (के बारे में 0.3-0.4 मिलीलीटर/मिनट) के लिए बहिर्वाह समायोजित करने के लिए ट्यूब पर एक क्लैंप का प्रयोग करें ।
- निम्नलिखित बफ़र्स और मीडिया तैयार करें:
- 1,000 मिलीलीटर HEPES-रिंगर बफर (10 mM HEPES, 136.4 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1 mM MgCl2• 6H2O, 2.2 m M CaCl2•2H2O, 11 mm ग्लूकोज, पीएच 7.4)। बाँझ फिल्ट्रेटेड बफर (फिल्टर का पोर आकार: 0.2 माइक्रोन) को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- फेफड़ों के अलगाव को शुरू करने से पहले लगभग 30 मिनट निम्नलिखित समाधान तैयार करते हैं:
- HEPES-रिंगर बफर (कुल मात्रा 10 मिलीलीटर) में 1.5% w/v कम पिघलने वाले बिंदु को भंग करें और माइक्रोवेव ओवन में खाना पकाने से इसे पिघला दें। बाद में, इसे एक हीटिंग कैबिनेट में भंडारण द्वारा 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। पूर्व युद्धाकार फेफड़े के वायुमार्ग में एगिंग भरने के लिए 2 मिलीलीटर सिरिंज।
- हेपेस-रिंगर बफर के 20 मिलीलीटर लें, 250 आईयू/एमएल की अंतिम एकाग्रता में हेपरिन जोड़ें, और बफर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। उपयोग से तुरंत पहले 75 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में सोडियम नाइट्रोप्रस जोड़ें। यह फेफड़े के वाक्यूलेचर से रक्त को चलाने के लिए परफ्यूजन बफर है।
- एक ग्लास बीकर में 200 मिलीलीटर HEPES-रिंगर बफर रखो और इसे बर्फ पर स्टोर करें। एगर उठे अलग-थलग फेफड़ों को ठंडा करने के लिए इस बफर की जरूरत होगी।
- एक ग्लास बीकर में 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक लगभग 200 मिली एमईएम भरें और इसे हीटिंग कैबिनेट में 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नॉर्मॉक्सिक गैस मिश्रण के साथ माध्यम बुलबुला। इसका उपयोग फेफड़ों के वर्गों से एगरे को हटाने के लिए किया जाएगा।
- प्रीवार्म मेम की 2 बोतलें 37 डिग्री सेल्सियस तक पानी के स्नान में 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक होती हैं और उन्हें क्रमशः नॉर्मॉक्सिक और हाइपोक्सिक गैस मिश्रण के साथ बुलबुला करती हैं, जो वीडियोमॉर्फोमेट्रिक मापन शुरू करने से पहले कम से कम 2 घंटे के लिए होती हैं। लगभग 250 मिली एमईएम माप प्रति आवश्यक होगा।
- निम्नलिखित अतिरिक्त सामग्री इकट्ठा करें:
- कीटाणुशोधन के लिए 70% एटोह।
- हेपरिन (25.000 I.U./5 मिलीलीटर) का स्टॉक समाधान, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत (ऊपर देखें)।
- कोई दाता सोडियम नाइट्रोप्रससाइड (Nipruss) का स्टॉक समाधान: एच2ओ में 10 mm, बर्फ पर संग्रहीत (ऊपर देखें) ।
- थ्रोमबॉक्सेन एनालॉग U46619 का स्टॉक समाधान: इथेनॉल में 10 माइक्रोन, बर्फ पर संग्रहीत।
- सुपरग्लू।
- एगर उठे से भरने के बाद श्वासनली के लिगेशन के लिए सिलाई कपास।
2. पशु
10-25 सप्ताह की उम्र में दोनों लिंगों के चूहों (तनाव C57Bl6 के उदाहरण के लिए) का उपयोग करें। एचपीवी का विश्लेषण नॉकआउट उपभेदों और इसी जंगली प्रकार के उपभेदों में भी किया जा सकता है।
सभी प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग के लिए NIH दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया, और स्थानीय संस्थागत बोर्डों द्वारा अनुमोदित किया गया ।
3. मुरीन फेफड़ों का अलगाव और सटीक कट फेफड़ों के स्लाइस (पीसीएलएस) की तैयारी
- सर्वाइकल अपभ्रंश द्वारा माउस को मार डालो। हत्या के तुरंत बाद, वेंट्रल शरीर की सतह को 70% एटोह के साथ स्टरलाइज करें और ठोड़ी से श्रोणि तक वेंट्रल मिडलाइन के साथ त्वचा को काटने के लिए किसी न किसी कैंची का उपयोग करें।
नोट: चूंकि यह ज्ञात है कि आइसोफ्लुनाइन जैसे इनसोफेटिव एनेस्थेटिक्स का संवहनी स्वर18,19पर प्रभाव पड़ता है, इसलिए अस्थिर एनेस्थेटिक्स का उपयोग न करें। - पेट की गुहा खोलने के बाद, आंतों के छोरों को एक तरफ रख दें और रक्तस्राव के लिए पेट के बड़े जहाजों को तोड़ दें। ठीक कैंची के साथ डायाफ्राम मर्मज्ञ के बाद, फेफड़े प्ल्युरल गुहा में हवा में प्रवेश के परिणामस्वरूप गिर जाएंगे। अवर वक्ष एपर्चर से डायाफ्राम को अलग करने के लिए कैंची का उपयोग करें। चीर पिंजरे के वेंट्रल भाग को हटाने के लिए पसलियों और हंसली को बाद में काट लें।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि फेफड़ों को इस चरण में क्षतिग्रस्त नहीं किया जाता है क्योंकि अन्यथा फेफड़ों की सूजन असंभव होगी! केवल बाँझ उपकरणों और प्रयोगशाला कांच के बर्तन का प्रयोग करें। - पल्मोनरी वैक्यूलेचर के परफ्यूजन शुरू करने से पहले, बफर के निर्वहन के लिए दिल के बाएं वेंट्रिकल में एक छोटा सा छेद काट लें। सिरिंज जलाशय को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) हेप्स-रिंगर बफर के साथ भरें जिसमें हेपरिन और सोडियम नाइट्रोफ्रूसाइड (परफ्यूजन बफर) होता है और सही वेंट्रिकल के माध्यम से पल्मोनरी वेक्यूलेचर को धीरे-धीरे बढ़ाया जाता है।
नोट: जब फेफड़े अपना रंग बदलते हैं और सफेद उपस्थिति प्राप्त करते हैं तो पर्फ्यूजन कुशल होता है। इस चरण में परफ्यूजन बफर में सोडियम नाइट्रोप्रुसाइड जोड़ना महत्वपूर्ण है; यह पूर्व-acinar धमनियों को आसपास के ऊतकों से तेजस्वी से रोकता है। - श्वासनली से लार ग्रंथियों, छोटी मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को हटा दें। बाद में लिगामेंटेशन के लिए घेघा और श्वासनली के बीच आसपास के संयोजी ऊतक और धागे सिलाई कपास से श्वासनली डिस्कनेक्ट करें।
- दो पड़ोसी श्वासनली काराल्टेज के बीच श्वासनली के ऊपरी हिस्से में एक छोटे से छेद को काटने के लिए माइक्रोसिसर का उपयोग करें। अब श्वासनली में छोटे छेद के माध्यम से एक चतुर्थ indwelling कैनुला के लचीले प्लास्टिक पाइप डालें और ध्यान से सिलाई कपास के साथ इसे ठीक करें। धीरे-धीरे गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) कम पिघलने वाले बिंदु के साथ वायुमार्ग को भरें। फेफड़ों का निरीक्षण करें: सबसे पहले दाहिने फेफड़े बाएं फेफड़ों के बाद विस्तार करना शुरू कर देते हैं। भरने पूरा हो गया है जब दोनों फेफड़ों में विवो स्थिति के बराबर मात्रा के लिए फुलाया जाता है (लिंग, आयु, और वजन के आधार पर लगभग 1.2-2.0 मिलीलीटर)।
नोट: यदि केवल एक फेफड़े का विस्तार होता है, तो प्लास्टिक पाइप बहुत गहरा डाला गया होगा ताकि यह ब्रोंकस तक पहुंच गया हो। इस मामले में इसे थोड़ा-थोड़ा बाहर निकाला जाना है। ध्यान रखें कि धीरे-धीरे ठंडा होने पर एगरेग्नेस जम जाएगा। - जब फेफड़े भरे होते हैं, तो एक साथ प्लास्टिक पाइप को बाहर निकालें और एगर उठे के बहिर्वाह को रोकने के लिए सिलाई कपास के साथ श्वासनली को बाहर निकालें। इसके बाद, लिगेचर के ऊपर श्वासनली काटें और छाती से ब्लॉक पर फेफड़ों और दिल को अलग करें।
नोट: शुरुआती लोगों के लिए, लिगेशन चरण में समर्थन के लिए किसी सहकर्मी से पूछना मददगार हो सकता है। - अंग पैकेट को बर्फ-ठंडे हेपेस-रिंगर बफर में स्थानांतरित करें ताकि एगर उठे को जमना हो। यह कुछ ही मिनटों में होता है।
- व्यक्तिगत फेफड़ों के पालि को अलग करें और कंपन के नमूना धारक पर सुपरग्लू के साथ एक पालि को ठीक करें।
नोट: यह धारक जो लोचदार फेफड़ों के ऊतकों को काटने के दौरान तिरछा के रूप में कार्य करता है पर एक शैंपेन कॉर्क का एक टुकड़ा छड़ी करने के लिए उपयोगी है । उपयोग किए गए फेफड़ों के पालि के आधार पर और नमूना धारक पर इसके अभिविन्यास पर, प्राप्त पीसीएलएस छोटे या बड़े जहाजों के विश्लेषण के लिए अधिक अनुकूल हो सकता है। ज्यादातर हम पीसीएलएस की तैयारी के लिए बाएं पालि और दाहिने कपाल पालि का उपयोग करते हैं। क्रॉस-सेक्शनेड छोटी इंट्रा-एकिनार धमनियों को प्राप्त करने के लिए, कपाल दाहिने लोब को हिलम के साथ धारक को गोंद करें और परिधि से टुकड़ा करें। क्रॉस-सेक्शन्ड प्री-एकिनार धमनियों को प्राप्त करने के लिए, शैंपेन कॉर्क के साथ सही पालि के हिलम को संरेखित करें। - फेफड़ों के पालि को 200 माइक्रोन मोटी स्लाइस (गति: 12 = 1.2 मिमी/सेकंड; आवृत्ति: 100; आयाम: 1.0) में काटने के लिए एक ताजा रेजर ब्लेड से लैस कंपन का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे HEPES-रिंगर बफर से भरे वाइब्रेटहोम बेसिन में पीसीएलएस ले लीजिए।
नोट: हेप्स-रिंगर के कूलिंग की सिफारिश की जाती है लेकिन गैरजरूरी। - एगर उठे को हटाने के लिए, अंग वर्गों को लगभग 200 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस गर्म मेम से भरे ग्लास बीकर में स्थानांतरित करें। हीटिंग कैबिनेट में बीकर रखो जिसमें एक ट्यूब नॉर्मॉक्सिक गैस मिश्रण के साथ एक बोतल में शामिल हो गया है डाला जाता है । नॉर्मॉक्सिक गैस के साथ एमईएम को बुलबुला करें ताकि फेफड़ों के वर्ग धीरे-धीरे मध्यम में आगे बढ़ रहे हैं। लगभग 2 घंटे के बाद, हवाई क्षेत्रों को भरने वाले "एगर उठे सजीले टुकड़े" फेफड़ों के ऊतकों से हटा दिए जाएंगे। यह इस तथ्य से पहचाना जा सकता है कि अनुभाग अब माध्यम के शीर्ष पर तैर नहीं रहे हैं लेकिन बीकर के तल पर व्यवस्थित होते हैं।
4. पीसीएलएस की इंट्रापल्मोनरी धमनियों का वीडियोमॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण
- इंट्रा-पल्मोनरी धमनियों के वीडियोमॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए, 1.2 मिलीलीटर नॉर्मॉक्सिक गैसेड एमईएम से भरे प्रवाह-थ्रसफ्यूजन कक्ष में एक पीसीएलएस स्थानांतरित करें। एक प्लेटिनम अंगूठी (बाहरी/भीतरी व्यास: 14/10 मिमी) से जुड़े नायलॉन तार के साथ कक्ष के तल पर पीसीएलएस ठीक करें ।
- 20-100 माइक्रोन के बीच आंतरिक व्यास के साथ क्रॉस-सेक्शनेड धमनियों के लिए पीसीएलएस को सूक्ष्म रूप से स्कैन करें।
नोट: धमनियों के ल्यूमेन को फ्लैट एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा रेखांकित किया जाता है। आसपास की चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को चरण विपरीत छवि में लुमेन के आसपास "डार्क रिंग" के रूप में पहचाना जा सकता है (चित्रा 2में चरण विपरीत छवियां देखें)। इसके विपरीत, वायुमार्ग की पहचान शुरू में छद्म स्तंभीय एपिथेलियम द्वारा की जा सकती है जो एक साधारण स्तंभीय एपिथेलियम में प्ल्युरल सतह के रास्ते में पारगमन करता है जिसके बाद एक साधारण क्यूबोइडल एपिथेलियम होता है।- प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में आंतरिक व्यास को मापें।
नोट: थोड़ा तिरछा कटौती जहाजों में, ट्यूबलर संरचना का असली आंतरिक व्यास लुमेन की सबसे लंबी धुरी के लिए 90 डिग्री कोण में निर्धारित किया जा सकता है। आंतरिक व्यास >40 माइक्रोन के साथ बड़ी पूर्व-acinar धमनियों ब्रोंची और ब्रोंकिओल्स के निकट चलते हैं। 40 माइक्रोन के भीतरी व्यास < वालीछोटी इंट्रा-एकिनार धमनियां अल्वेओले और अल्वेलर नलिका6के बगल में अल्वेलर सेप्टा के गसेट में स्थित हैं।
- प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में आंतरिक व्यास को मापें।
- प्रायोगिक डिजाइन:
- प्रत्येक प्रयोग को "अनुकूलन चरण" के साथ शुरू करें जिसमें कक्ष को नॉर्मॉक्सिक गैस्ड माध्यम (प्रवाह दर: 0.7 मिलीलीटर/न्यूनतम; 10 मिनट) के साथ प्रेरित किया जाता है। इसके बाद, पोत की व्यवहार्यता का परीक्षण करें: 10 माइक्रोन U46619 (अंतिम एकाग्रता 0.1 माइक्रोन; 10 मिनट; कोई प्रवाह नहीं) के 12 माइक्रोन के अलावा धमनी की संकुचनता का विश्लेषण करें।
नोट: इस काम के लिए, एक पोत को व्यवहार्य के रूप में परिभाषित किया गया है जब चमकदार क्षेत्र कम से कम 30% तक कम हो जाता है (माप की विधि के लिए नीचे देखें)। - नॉर्मॉक्सिक गैस्ड माध्यम (प्रवाह दर: 6 मिलीलीटर/न्यूनतम; 10 मिनट) के साथ दवा को धोने के बाद 10 एमएम निप्रस (अंतिम एकाग्रता 25 माइक्रोन; 10 मिनट; कोई प्रवाह) के 3 माइक्रोन के आवेदन द्वारा धमनी को डिलेट करें।
- फिर, नॉर्मॉक्सिक गैस्ड माध्यम (प्रवाह दर: 6 मिलीलीटर/न्यूनतम) के साथ 10 मिनट धोने के द्वारा दवा को हटा दें और इसके बाद 0.7 मिलीलीटर/मिनट के प्रवाह पर 10 मिनट का समय दिया जाए।
- हाइपोक्सिक गैस्ड माध्यम (प्रवाह दर: 0.7 मिलीलीटर/मिनट; 40 मिनट) के साथ पीसीएलएस के इनक्यूबेशन द्वारा हाइपोक्सिक पल्मोनरी वासोकॉन्स्ट्रिशन को प्रेरित करें। एक अतिरिक्त ट्यूब प्रणाली द्वारा, हाइपोक्सिक गैस मिश्रण को परफ्यूजन कक्ष के वायु क्षेत्र में खिलाएं।
- नॉर्मॉक्सिक गैस्ड मीडियम (फ्लो रेट: 6 एमएल/मिनट) के साथ 20 मिनट धोने से हाइपोक्सिक मीडियम को हटा दें ।
- प्रत्येक प्रयोग के अंत में, वासोकोंस्ट्रिशन को प्रेरित करने के लिए परफ्यूजन चैंबर में 10 माइक्रोन U46619 (अंतिम एकाग्रता 0.01 माइक्रोन; 20 मिनट; कोई प्रवाह नहीं) जोड़ें।
नोट: यह अंतिम चरण हाइपोक्सिक प्रतिक्रिया में परिवर्तन (उदाहरण के लिए हाइपोक्सिक चरण में एक दवा के एक साथ आवेदन से प्रेरित या नॉकआउट माउस तनाव से तैयार पीसीएलएस में मनाया गया) के निर्धारण की अनुमति देता है, हाइपोक्सिया-प्रेरित संकीर्तन के लिए विशिष्ट है या क्या यह संकुचन पर सामान्य प्रभाव को दर्शाता है। 0.01 माइक्रोन की एकाग्रता U46619 के EC50 मूल्य से मेल खाती है जो पिछले एकाग्रता-संकुचन माप (प्रकाशित नहीं) में अनुमानित किया गया था। - पर्फ्यूजन कक्ष के वायु क्षेत्र में हाइपोक्सिक गैस्ड एमईएम और नॉर्मॉक्सिक गैस मिश्रण के बजाय नॉर्मॉक्सिक के साथ नियंत्रण प्रयोग करने के लिए एक और पीसीएलएस का उपयोग करें।
- प्रत्येक प्रयोग को "अनुकूलन चरण" के साथ शुरू करें जिसमें कक्ष को नॉर्मॉक्सिक गैस्ड माध्यम (प्रवाह दर: 0.7 मिलीलीटर/न्यूनतम; 10 मिनट) के साथ प्रेरित किया जाता है। इसके बाद, पोत की व्यवहार्यता का परीक्षण करें: 10 माइक्रोन U46619 (अंतिम एकाग्रता 0.1 माइक्रोन; 10 मिनट; कोई प्रवाह नहीं) के 12 माइक्रोन के अलावा धमनी की संकुचनता का विश्लेषण करें।
5. वैसोरएक्टिविटी और ग्राफिक प्रस्तुति का विश्लेषण
- उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग पूरे प्रयोग के दौरान हर मिनट पार अनुभागित धमनी से तस्वीरें लेते हैं।
- उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करना पूर्ण स्क्रीन चित्रों का उपयोग करके हाथ से आंतरिक सीमाओं को अस्तर करके जहाजों के चमकदार क्षेत्र के परिवर्तनों का मूल्यांकन करता है।
नोट: स्पष्ट रेखांकन प्राप्त करने के लिए हर दूसरी तस्वीर का विश्लेषण करना पर्याप्त है। हालांकि, जब प्रवाह के माध्यम से सुपरफ्यूजन कक्ष में एक शर्त दूसरे में बदल जाती है, तो हर तस्वीर का विश्लेषण करें। शेष तस्वीरें बैक-अप के रूप में काम करते हैं यदि एक तस्वीर का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है।
दुर्भाग्य से, इस समय लेने वाले कदम को हाथ से किया जाना चाहिए न कि उपयुक्त कार्यक्रमों द्वारा क्योंकि कभी-कभी रक्त कोशिकाएं संवहनी दीवार से जुड़ी होती हैं जो माप के दौरान आगे बढ़ रही हैं या यह पोत का एक आदर्श क्रॉस सेक्शन नहीं है बल्कि एक स्पर्शरेखा अनुभाग है जिसमें आंतरिक सीमाओं का विश्वसनीय स्थानीयकरण केवल दृश्य नियंत्रण के तहत किया जा सकता है। - प्रयोग की शुरुआत में पोत ल्यूमेन के क्षेत्र के लिए प्राप्त मूल्य को 100% के रूप में परिभाषित करें और इस मूल्य की सापेक्ष कमी या वृद्धि के रूप में वासोकॉन्स्रिक्शन या फैलाव व्यक्त करें।
- प्रत्येक प्रयोग के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर समय के खिलाफ रिश्तेदार चमकदार क्षेत्र साजिश।
- कई प्रयोगों को संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, रिश्तेदार चमकदार क्षेत्रों के साधनों को प्लॉट करें +/-समय के विरुद्ध मतलब (एसईएम) की मानक त्रुटि।
नोट: हाइपोक्सिया पर विभिन्न पदार्थों के प्रभावों की स्पष्ट प्रस्तुति के लिए- या U46619-प्रेरित फेफड़े के वासोकॉन्स्ट्रक्शन या नॉकआउट माउस उपभेदों की हाइपोक्सिक प्रतिक्रिया के लिए, प्रयोगों का प्रारंभिक चरण, जिसमें पोत की व्यवहार्यता का परीक्षण किया जाता है, ग्राफ से छोड़ा जा सकता है। इस मामले में, कम ऑक्सीजन के संपर्क की शुरुआत में प्राप्त मूल्यों को 100% के रूप में परिभाषित किया गया है।
6. सांख्यिकीय विश्लेषण
- Kruskal-Wallis के साथ प्रयोगात्मक समूहों के बीच मतभेदों का विश्लेषण-और मान-व्हिटनी परीक्षण, पी≤0.05 के साथ महत्वपूर्ण माना जा रहा है, और पी≤0.01 अत्यधिक महत्वपूर्ण है ।
नोट: पीसीएलएस की तैयारी और परिचालन उपयोग के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए भी20,21देखें।
Representative Results
चित्रा 1 में एक बड़ी पूर्व-acinar धमनी के एचपीवी के माप के परिणाम और छोटे इंट्रा-acinar धमनियों के चित्रा 2 में दिए गए हैं। चरण के विपरीत छवियों में(आंकड़े 1A और 2A)यह स्पष्ट हो जाता है कि फेफड़ों के ऊतकों के भीतर उनके स्थान के आधार पर धमनियों के इन 2 वर्गों के साथ भेदभाव करना संभव है: प्री-acinar धमनियों ब्रोंची और ब्रोंकिओली(चित्रा 1A)के लिए करीब पड़ोस में चलाने के लिए, जबकि अंतर-acinar धमनियों alveolar सेप्टा के gussets पर स्थित है और alveolae सेप्टा(चित्रा 2A)से घिरा हुआ है । एक छोटे से अभ्यास के साथ यह चरण विपरीत चित्रों(आंकड़े 1A और 2A) पर U46619 के जवाब में चमकदार क्षेत्र में परिवर्तन देखना संभव है। हालांकि, हाइपोक्सिक पल्मोनरी वासोकॉन्स्ट्रक्शन अक्सर इतना स्पष्ट नहीं होता है और चमकदार क्षेत्रों(आंकड़े 1B, 1C, 2B, और, 2 सी) के परिवर्तनों के पूर्ण मूल्यांकन के बाद ही स्पष्ट हो जाताहै। शिक्षाप्रद कारण से हमने एक पूर्व-acinar धमनी का एक उदाहरण दिया है जो असामान्य रूप से स्पष्ट वासोकॉन्स्ट्रक्शन दिखाता है। औसतन, एचपीवी के परिणामस्वरूप चमकदार क्षेत्र में 20-30% की कमी आती है।
चित्रा 2 में छोटी इंट्रा-एकिनार धमनियों की रिकॉर्डिंग हाइपोक्सिक-गैस्ड माध्यम के साथ या 50 माइक्रोन पिनासीडिल (माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम चैनलों का एक गैर-चयन सलामी बल्लेबाज) के साथ या बिना इनक्यूबेटेड होती है और दवा का निरोधात्मक प्रभाव स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। प्रयोग का अंतिम भाग एचपीवी पर दवा की कार्रवाई की चयनशीलता को दर्शाता है: थ्रोमबॉक्साने एनालॉग U46619 द्वारा प्रेरित वासोकॉनस्ट्रिशन पिनाकिडिल के अलावा नहीं बदला जाता है। दरअसल, धमनी के लिए वक्र उजागर pinacidil अन्य दो की तुलना में स्पष्ट रूप से कम चलाता है, लेकिन अकेले U46619 द्वारा चमकदार क्षेत्र की कमी की सीमा तुलनीय है। इस मामले में यह एचपीवी का अधूरा प्रतिवर्तन था जो घटता के बीच अंतर का कारण बनता है। इस ग्राफ में भी नॉर्मॉक्सिक गैस्ड माध्यम के संपर्क में आने वाली एक धमनी को अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया है। इस स्थिति के तहत, चमकदार क्षेत्र के कोई परिवर्तन का पता लगाने योग्य नहीं हैं।
चित्र 3 में एचपीवी पर पिनाकिडिल के प्रभाव पर माप की पूरी श्रृंखला के डेटा दिखाए जाते हैं। सांख्यिकीय मतभेदों के लिए दो समूहों की तुलना के लिए, बताए गए समय बिंदुओं के डेटा सेट का विश्लेषण क्रुस्कल-वालिस-और मान-व्हिटनी-टेस्ट के साथ किया गया । एचपीवी को पिनासिडिल की उपस्थिति में स्पष्ट रूप से समाप्त कर दिया गया था जबकि U46619-प्रेरित संकुचन अपरिवर्तित था।
वैकल्पिक रूप से, मुलर-रेडेत्स्की एट अल में वर्णित वक्र के तहत क्षेत्र की तुलना करके समूहों के बीच मतभेदों की पहचान करना संभव है। 22
चित्रा 1. एक बड़ी पूर्व-acinar धमनी के एचपीवी का माप। (क)क्रॉस-सेक्शन्ड प्री-एकिनार धमनी (ए) की चरण विपरीत छवियां जो एक क्रॉस-सेक्शन्ड ब्रोंचस(बी)के करीब पड़ोस में चलती हैं। चित्रों को हलकों द्वारा(बी)में इंगित किए गए समय बिंदुओं पर लिया जाता है: माप (ए) की शुरुआत में, U46619 (बी) के साथ उपचार के अंत में, निप्रस (सी) के संपर्क में आने के अंत में, हाइपोक्सिक गैस्ड माध्यम (डी, ई) में 30 या 40 मिनट के बाद, नॉर्मॉक्सिक गैस्ड मीडियम (एफ) के साथ धोने के बाद, और U46619 (g g) के अंतिम आवेदन के बाद) । ग्राफ(बी)में चमकदार क्षेत्र के परिवर्तनों को समय के विरुद्ध प्लॉट किया जाता है जबकि प्रयोग की शुरुआत में चमकदार क्षेत्र को 100% के रूप में परिभाषित किया जाता है और वासोकॉन्स्रिक्शन/-फैलाव सापेक्ष मूल्यों के रूप में दिया जाता है। इस मामले में हाइपोक्सिया चमकदार क्षेत्र की 60% कमी लाती है। (ग)हाइपोक्सिक प्रतिक्रिया की एक स्पष्ट प्रस्तुति के लिए, प्रयोग के प्रारंभिक चरण जिसमें वासोरएक्टिविटी का परीक्षण किया गया था शामिल नहीं है, लेकिन कम ऑक्सीजन के संपर्क में आने से तुरंत पहले प्राप्त मूल्य १००% के रूप में सेट किया जाता है (यह भी चित्रा 2देखें) । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। छोटी इंट्रा-acinar धमनियों के एचपीवी पर पिनासिडिल (माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी-सेंसिटिव पोटेशियम चैनलों का एक गैर-चयनकारी सलामी बल्लेबाज; मितोकाट्प) का प्रभाव। (क)इंट्रा-एकिनार धमनियां (क) अल्वियोलर सेप्टा के गसेट में स्थित हैं । अलव = अल्वियोलस। इन प्रयोगों में लागू व्यक्तिगत शर्तों का क्रम ग्राफ(बी)के शीर्षक में दिया गया है। हाइपोक्सिक एक्सपोजर 50 माइक्रोन पिनासिडिल की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किया जाता है। नियंत्रण इन्क्यूबेशन नॉर्मॉक्सिक गैस्ड माध्यम के साथ किया जाता है। (ए)में दिखाए गए चित्रों को माप (ए, ए', ए") की शुरुआत में लिया जाता है, U46619 (ख, बी', बी "), निप्रस (सी, सी,सी") के संपर्क के अंत में, हाइपोक्सिक या नॉर्मॉक्सिक गैस्ड माध्यम (डी, डी,डी"; ई, ई', ई") में 30 या 40 मिनट के बाद, नॉर्मॉक्सिक गैस्ड माध्यम (एफ, एफ', एफ") के अंतिम आवेदन के बाद और U46619 (जी, जी,,जी") के अंतिम आवेदन के बाद। नॉर्मॉक्सिया/हाइपोक्सिया/हाइपोक्सिया + पिनासिडिल के प्रति प्रतिक्रिया की स्पष्ट प्रस्तुति के लिए, नॉर्मॉक्सिक-/हाइपोक्सिक-गैस्ड माध्यम के संपर्क में आने से तुरंत पहले प्राप्त मूल्यों को १००%(सी)के रूप में सेट किया जाता है । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3। पिनाकिडिल द्वारा एचपीवी का अवरोध। 50 माइक्रोनएम पिनासीडिल के साथ या उसके बिना हाइपोक्सिक गैस्ड माध्यम के संपर्क में आने वाली छोटी इंट्रा-एकिनार धमनियों की रिकॉर्डिंग संक्षेप में प्रस्तुत की जाती है और एसईएम ± साधन के रूप में प्रस्तुत की जाती है। (क)में पूरी रिकॉर्डिंग दी जाती है,(बी)में हाइपोक्सिक इनक्यूबेशन की शुरुआत में मूल्य के संबंध में सापेक्ष डेटा दिखाया जाता है। पीसीएलएस में कोई वैसोरएक्टिविटी का पता नहीं लगाया जा सकता है जो पिनासीडिल युक्त हाइपोक्सिक-गैस्ड माध्यम के संपर्क में हैं। U46619 द्वारा प्रेरित वासोकॉन्ट्रिक्शन दवा से प्रभावित नहीं होता है। कोष्ठक में "एन" धमनियों की संख्या/जानवरों की संख्या को संदर्भित करता है जिनसे पीसीएलएस बनाए गए थे । दूसरे शब्दों में पहला नंबर फेफड़ों के वर्गों की गिनती का विश्लेषण करता है और दूसरा नंबर चूहों की गिनती देता है जिसमें से इन वर्गों को तैयार किया गया था । दिए गए समय बिंदुओं पर दोनों समूहों के बीच मतभेदों को महत्व के लिए परीक्षण किया जाता है । n.s.: महत्वपूर्ण नहीं, *: पी≤0.05, **: पी≤0.01, ***: पी≤0.001। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4. विधि का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। संक्षेप में, चूहों को सर्वाइकल अव्यवस्था से मारा जाता है। छाती के खुलने के बाद, फेफड़े कम पिघलने वाले बिंदु से भरे होते हैं और ठंडा होने के बाद 200 माइक्रोन मोटी सटीक कटौती फेफड़ों के स्लाइस (पीसीएलएस) में कटौती करते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर एगर उठी को हटाने के बाद एक पीसीएलएस को प्रवाह-माध्यम सुपरफ्यूजन कक्ष में स्थानांतरित कर दिया जाता है जिसमें यह नॉर्मॉक्सिक माध्यम या 1% ओ2के साथ मध्यम गैसों के संपर्क में आता है। वैसोरएक्टिविटी को ल्यूमिनल एरिया में बदलाव के रूप में दर्ज किया जाता है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
अलग हवादार और परफ्यूस वाला माउस फेफड़े ऑक्सीजन की आपूर्ति में परिवर्तन पर फेफड़े के संवहनी प्रणाली की शारीरिक प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है और अन्य लोगों के बीच फेफड़े की धमनी दबाव के निरंतर माप की अनुमति देता है1। हालांकि, यह मॉडल उन संवहनी खंड (ओं) की पहचान और विश्लेषण की अनुमति नहीं देता है जो हाइपोक्सिया के लिए सबसे मजबूत प्रतिक्रिया दिखाता है। यह पीसीएलएस के हमारे वीडियोमॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण का लाभ है जो 20-100 माइक्रोन के आंतरिक व्यास के साथ व्यक्तिगत धमनियों के एचपीवी के माप की सुविधा प्रदान करता है। पीसीएलएस एक आकर्षक इन विट्रो मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि वे उस अंग के समान होते हैं जिससे वे तैयार होते हैं। सेल कल्चर सिस्टम के विपरीत, सभी सेल प्रकार अपने मूल ऊतक-मैट्रिक्स विन्यास में मौजूद हैं। इसके अलावा, एक फेफड़े कई पीसीएलएस की तैयारी के लिए पर्याप्त है, ताकि कम से कम आंशिक रूप से प्रयोगों को एक ही माउस से वर्गों के उपयोग द्वारा मानकीकृत किया जा सके। रसेल और बर्च23 की 3आर अवधारणा (जीवन विज्ञान में प्रयोगशाला जानवरों की कमी, शोधन और प्रतिस्थापन) के अनुसार यह तथ्य पीसीएलएस के उपयोग के लिए भी तर्क देता है।
हालांकि, किसी को ध्यान में रखना होता है, कि ऊतक को एक वाइब्रेटोम और देशांतर संकेत के साथ काटने से क्षतिग्रस्त हो जाता है उदाहरण के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं के माध्यम से कुबलर एट अलद्वारा पोस्टकिया जाता है। 14 अब संभव नहीं है ।
प्रारंभ में, पीसीएलएस मुख्य रूप से जैव रासायनिक, औषधीय और विष विज्ञान अध्ययन के लिए लागू किए जाते थे, लेकिन इस बीच उनका उपयोग ब्रोंकियल संकुचन, म्यूकोसिलिएरी फ़ंक्शन और वैस्कुलर प्रतिक्रियाओं के मापन के लिए भी किया जाता है (समीक्षा के लिए सैंडरसन20 और डेविस21देखें)। एट अलआयोजित किया । एक अध्ययन किया है जिसमें वे अलग perfused और हवादार माउस फेफड़े और पीसीएलएस24के मॉडल की तुलना में प्रदर्शन किया है . उन्होंने विभिन्न अंतर्जात मध्यस्थों को वायुमार्ग और फेफड़े के जहाजों की प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण से पाया कि पीसीएलएस में पूरे फेफड़ों की महत्वपूर्ण विशेषताओं को बनाए रखा गया था।
पीसीएलएस में, हाइपोक्सिक स्थितियां वायुमार्ग के माध्यम से अक्षुण्ण फेफड़ों में स्थापित नहीं होती हैं, लेकिन हाइपोक्सिक-गैस्ड माध्यम में फेफड़ों के खंड की इनक्यूबेशन से। हमने रक्त गैस एनालाइजर का उपयोग करते हुए क्रमशः 1% O2,5.3% CO2,93.7% एन2और21% O 2, 5.3% सीओ2,73.7% एन2के साथ मध्यम प्रीगैस्ड के ऑक्सीजन आंशिक दबाव (पीओ2)का विश्लेषण किया है। परफ्यूजन चैंबर में इसे खिलाने से तुरंत पहले, हाइपोक्सिक गैस्ड एमईएम का पीएओ2 40 एमएमएचजी था और नॉर्मॉक्सिक गैस्ड मीडियम 160 एमएमएचजी6था। अक्षुण्ण फेफड़ों में एचपीवी प्रेरित होता है जब अल्वेलर पीओ 2 50 एमएमएचजी25 सेनीचे गिरताहै, एक ऐसी स्थिति जिसे स्पष्ट रूप से हाइपोक्सिक-गैस्ड माध्यम के आवेदन से नकल की जा सकती है। एचपीवी की सीमा पर हमारा डेटा एक अलग प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के साथ प्राप्त परिणामों के लिए अच्छी तरह से मेल खाता है। यामागुची एट अल। एक इमेज तेज10के साथ एक उच्च संवेदनशीलता कैमरे के साथ वास्तविक समय कॉन्फोसल लेजर स्कैनिंग ल्यूमिनेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा 20-30 माइक्रोनम के व्यास के साथ माइक्रोवेसेल्स की जांच करने के लिए अलग चूहा फेफड़ों लागू किया है . उन्होंने हाइपोक्सिया के लिए फेफड़ों के संपर्क में आने के बाद 2.7 माइक्रोन के व्यास में एक औसत कमी देखी। एक गणना कर सकते है कि चमकदार क्षेत्र की एक 20% की कमी के रूप में हम इसे हमारे सिस्टम में उपाय व्यास में लगभग 15% कमी से मेल खाती है ।
हमारे प्रयोगों में हमने धमनियों को क्रमशः 40-100 माइक्रोन और 20-40 माइक्रोन के भीतरी व्यास के साथ पूर्व और इंट्रा-एकिनार जहाजों के रूप में वर्गीकृत किया है। मनुष्यों में मांसपेशियों से गैर-संगीत धमनियों में संक्रमण 70-100 माइक्रोन की व्यास सीमा में होता है। चूहों में, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं 20 माइक्रोन26के बाहरी व्यास तक मौजूद होती हैं। इस कारण से 20 माइक्रोन से नीचे व्यास के साथ धमनियों का विश्लेषण करना संभव नहीं है क्योंकि वे चरण विपरीत छवि के आधार पर विश्वसनीय पहचाने नहीं जा सकते हैं। पैमाने के दूसरे छोर पर, 100 माइक्रोन से ऊपर व्यास वाले जहाजों को शायद ही पीसीएलएस में पाया जा सके और आमतौर पर आसपास के ऊतकों से छीन लिया जाए।
दरअसल, आणविक उम्मीदवारों की एक संख्या आणविक ऑक्सीजन सेंसर (एस) के रूप में या संकेत झरना के घटक के रूप में एचपीवी में जिसके परिणामस्वरूप चर्चा कर रहे है (एक समीक्षा के लिए सिल्वेस्टर एट अल देखते हैं । 4)एक बार उपयुक्त नॉकआउट चूहों उपलब्ध हो वीडियोमॉर्फोमेट्री जंगली प्रकार के जानवरों की तुलना में पूर्व और इंट्रा-acinar धमनियों की वासोरेएक्टिविटी के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, पीसीएलएस का उपयोग अन्य मुद्दों के लिए भी किया गया है: फारो एट अल। उन्हें जन्म के बाद फेफड़ों में एंडोथेलियम निर्भर फैलाव के विकास की विशेषता के लिएनियोजित 29 और पीसीएलएस 2 सप्ताह के लिए दैनिक धुएं या हवा के संपर्क में गिनी सूअरों से तैयार एंडोथेलियल रोग30के प्रेरण के माध्यम से वासोरएक्टिविटी पर सिगरेट के धुएं के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया .
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
हमारे प्रयोगों में हमने धमनियों को प्री-एकिनार (40-100 माइक्रोन के भीतरी व्यास) और इंट्रा-एकिनार (20-40 माइक्रोन के भीतरी व्यास) के रूप में वर्गीकृत किया। विशेष रूप से फेफड़ों के वर्गों की तैयारी के लिए जिनका उपयोग बड़े जहाजों के विश्लेषण के लिए किया जाना चाहिए, परफ्यूजन बफर में सोडियम नाइट्रोप्रुसाइड जोड़ना महत्वपूर्ण है। यह दवा नमूना तैयार करने के दौरान जहाजों के संकुचन को रोकती है और इस तरह आसपास के ऊतकों से उनका चीर बंद हो जाती है जिससे अधूरा वासोडिलेशन हो जाता है। पर्फ्यूजन बफर में सोडियम नाइट्रोप्रुसाइड फेफड़ों के खंड की तैयारी के लिए इतना महत्वपूर्ण नहीं है जिसका उपयोग छोटी धमनियों के विश्लेषण के लिए किया जाना चाहिए क्योंकि वे दृढ़ता से अल्वेलर सेप्टा के लिए लंगर डाले जाते हैं।
सभी प्रयोगों को इनक्यूबेशन के साथ शुरू किया जाना चाहिए जिसमें धमनियों की प्रतिक्रियाशीलता का परीक्षण किया जाता है। शायद ही कभी, हमने फेफड़ों की तैयारी प्राप्त की जिसमें ठेकेदारों या दिलवाले को जहाजों की कोई प्रतिक्रिया पता नहीं चल सकती थी। हम इस के लिए कारण पता नहीं है: हो सकता है कि फेफड़ों में भरा agarose की मात्रा भी महान या बहुत कम था ताकि पीसीएलएस में अंग की काटने इष्टतम नहीं था । वैकल्पिक रूप से, यह कल्पना है कि अगर उठी नीचे ठंडा था भी तेजी से instillation प्रक्रिया के दौरान जिसके परिणामस्वरूप हानिकारक कतरनी तनाव में जिसके परिणामस्वरूप । यदि एक व्यक्तिगत पीसीएलएस में कोई व्यवहार्य धमनी का पता नहीं लगाया जा सकता है, तो अनुभाग को त्याग दिया जाना चाहिए और दूसरे द्वारा प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।
एक धमनी की व्यवहार्यता पर निर्णय U46619 के जवाब के आधार पर किया गया था। 0.1 माइक्रोन की एकाग्रता पर U46619 का आवेदन एक वासोकॉन्स्रिक्शन को प्रेरित करता है जो - कुछ व्यायाम के बाद - स्क्रीन पर छवि अनुक्रम में सीधे दिखाई देता है। चूंकि वासोरेएक्टिविटी में कुछ भिन्नताएं हैं, इसलिए हम दवा के संपर्क में आने वाले फेफड़ों के वर्गों में या बदले में अकेले माध्यम में वेस्टोरस्पॉन को मापकर एचपीवी पर दवा के प्रभाव की जांच करते हैं।
एक व्यक्तिगत धमनी का एचपीवी अक्सर माइक्रोस्कोप में शायद ही पता लगाने योग्य होता है, और औसतन इसके परिणामस्वरूप लगभग 20-30% के चमकदार क्षेत्र में कमी आती है। हालांकि, धमनी के व्यास में छोटे परिवर्तनों में प्रवाह प्रतिरोध पर एक अलग इनपुट होता है। आर = प्रतिरोध और आर = त्रिज्या के साथ समीकरण "आर = 1/r4"के अनुसार, प्रवाह प्रतिरोध त्रिज्या की चौथी शक्ति के विपरीत आनुपातिक है। मुझे एक उदाहरण देते हैं: एक "आदर्श धमनी" 40 माइक्रोन (आर = 20 माइक्रोन) के व्यास के साथ एक परिपत्र क्रॉस-सेक्शन का प्रदर्शन करने वाले लगभग 1,260 माइक्रोन2का एक चमकदार क्षेत्र है। जब चमकदार क्षेत्र 20% से कम हो जाता है, तो हम गणना कर सकते हैं कि पोत का व्यास 10.5% से 35.8 माइक्रोन (आर = 17.9 माइक्रोन) तक कम हो जाता है। ऊपर दिए गए समीकरण के अनुसार, इस पोत का प्रवाह प्रतिरोध 6.25 x 10-6 से 9.71 x 10-6 तक बढ़ जाएगा जो लगभग 55% है। चमकदार क्षेत्र में 30% की कमी के मामले में त्रिज्या लगभग 16% तक कम हो जाएगी, लेकिन प्रवाह प्रतिरोध लगभग 100% तक बढ़ जाएगा। यद्यपि ये गणनाएं एक अतिसरलीकरण हैं जिसमें एक लैमिनार रक्त प्रवाह और कठोर पाइप के एक पोत रूप को माना जाता है कि यह प्रवाह प्रतिरोध पर व्यास के पहले से ही मामूली परिवर्तनों के प्रभाव का विचारोत्तेजक है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह शोध एक्सीलेंस क्लस्टर कार्डियो-पल्मोनरी सिस्टम द्वारा प्रायोजित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
| Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
| Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
| Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
| Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
| Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
| Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
| Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
| Various scissors and forceps | |||
| Sewing cotton | |||
| 2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
| Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
| Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
| Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
| Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
| HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
| NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
| KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
| MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
| CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
| Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
| Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
| Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
| Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
| 70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
| Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
| U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
| Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
| Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
| SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |
References
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