Summary
Hypoxisk lungevakostrition (HPV) er et vigtigt fysiologisk fænomen, hvorved alveolar hypoxi lunge perfusion matches til ventilation. Det største vaskulære segment, der bidrager til HPV, er intra-acinar arterien. Her beskriver vi vores protokol for analyse af HPV af murinpulmonære fartøjer med en diameter på 20-100 μm.
Abstract
Akut alveolar hypoxi forårsager lungevakostrition (HPV) - også kendt som von Euler-Liljestrand mekanisme - som tjener til at matche lunge perfusion til ventilation. Indtil nu er de underliggende mekanismer ikke fuldt ud forstået. Det største vaskulære segment, der bidrager til HPV, er intra-acinar arterien. Denne karsektion er ansvarlig for blodforsyningen af en individuel acinus, der defineres som den del af lungerne, der er distal til en terminalbronchiole. Intra-acinar arterier er for det meste placeret i den del af lungen, der ikke kan opnås selektivt ved en række almindeligt anvendte teknikker såsom måling af lungepulsåren tryk i isolerede perfunderes lunger eller kraft optagelser fra dissekeret proksimale lungepulsåren segmenter1,2. Analysen af subpleurale beholdere ved realtids confocal laserscanning luminescensmikroskopi er begrænset til beholdere med en diameter på op til 50 μm i diameter3.
Vi leverer en teknik til at studere HPV af murin intra-lungearterier i intervallet 20-100 μm indre diametre. Den er baseret på den videomorfometriske analyse af tværsnitsarterier i præcisionsskårne lungeskiver (PCLS). Denne metode gør det muligt at måle vasoreaktiviteten i små arterier inden for acinar med indvendig diameter på mellem 20 og 40 μm, som er placeret ved kiler af alveolar septa ved siden af alveolarkanaler og af større præ-acinararterier med indvendige diametre mellem 40-100 μm, der løber ved siden af bronchi og bronchioles. I modsætning til realtidsbilleddannelse af subpleurale beholdere i bedøvede og ventilerede mus forekommer videomorfometrisk analyse af PCLS under forhold, der er fri for forskydningsstress. I vores eksperimentelle model udviser begge arterielle segmenter en monofasisk HPV, når de udsættes for medium gasset med 1% O2, og reaktionen falmer efter 30-40 minutter ved hypoxi.
Introduction
I de fleste systemiske vaskulære senge hypoxi inducerer vasodilatation, i forhold til vasoconstriction forårsaget af hypoxi i lungevakulaturen. Denne lunge-specifikke reaktion på nedsat iltspænding kaldes hypoxisk lungevakostrition (HPV), debut inden for få sekunder og vender hurtigt efter switchback til normoxisk ventilation. Selvom HPV er kendt i mere end 60 år, er den eller de cellulære iltsensorer og den eller de signalkaskade(er), der resulterer i vasoconstriction, stadig under debat. Der er relativ bred enighed om, at hypoxi-fremkaldte redox- og ROS-ændringer er afgørende for HPV og udviklingen af pulmonal hypertension (gennemgået i Sylvester et al. 4 og Schumacker et al. 5). Vores egne data understøtter en central rolle i komplekse II i mitokondrie åndedrætskæden i HPV6,7. For nylig Wang et al. præsenteret et helt nyt koncept for iltføling og HPV: Baseret på deres data foreslår de, at alveolar hypoxi fornemmes af de tilstødende kapillærer, der forårsager membrandepolarisering af endotelcellerne. Reaktionen formeres via connexion 40 hul vejkryds af endotelceller, der fører til indsnævring af glatte muskelceller i opstrøms arterioler8.
Arterierne i lungerne løber langs luftvejene, gren med dem, løbende fald i diameter, og endelig levere blod til kapillærsystemet placeret i alveolar vægge. Denne arterielle cirkulation er sammensat af anatomisk og funktionelt forskellige segmenter. De proksimale rørarterier, der er karakteriseret ved en overflod af elastiske fibre i væggene, efterfølges af fuldt muskuløse intrapulmonale arterier, som i vid udstrækning styrer lungevaskulær modstand. Trin-for-trin, disse arterier transit i segmenter, hvor muskellaget bliver ufuldstændig, og endelig fartøjerne er fri for glatte muskel actin-immunoreaktive celler. Den intra-acinar arterie fodring en individuel lunge acinus med blod repræsenterer en delvis muskuløs segment6. Ligeledes repræsenterer lungepulsåresystemet ikke en ensartet struktur med hensyn til den hypoksiske reaktion, men udviser markant regional mangfoldighed9,10. For eksempel fremkalder hypoxiia i proksimale lungearterier isoleret fra rotte lunger en bifasisk reaktion, der viser en indledende hurtig sammentrækning af kort varighed, som - efter ufuldstændig afslapning - efterfølges af en anden langsom, men vedvarende sammentrækning11. I modstandsarterier isoleret fra rotte lunge parenchyma som fjerde- og femte division af lungearterier (ekstern diameter <300 μm), hypoxi forårsager monofasisk indsnævring9. Allerede i 1971 konkluderede Glazier og Murray fra målinger af ændringer i kapillær røde blodlegemer koncentration i lungerne hos hunde ventileret med hypoxic gas blandinger, at hypoxi-induceret stigning i vaskulær resistens hovedsagelig fandt sted opstrøms for kapillærerne12. I dag repræsenterer intravital mikroskopi af intakte lunger af bedøvede og mekanisk ventilerede mus et kraftfuldt værktøj til analyse af lungemikrovasculaturen13,14. Udskæring af et cirkulært vindue i brystvæggen giver mikroskopisk adgang til lungernes overflade og gør det muligt at analysere subpleurale lungefartøjer med en diameter på op til 50 μm. Ved at kombinere denne teknik med infusionen af FITC-dextran, Tabuchi et al. påviste, at kun mellemstore arterioler med en diameter på 30-50 μm udviser en markant reaktion på hypoxi, som opretholdt over en periode på 60 minutter med en mindre dæmpning efter 30 min. I modsætning hertil viste små arterioler med diametre på 20-30 μm kun en mindre reaktion på hypoxi3. Denne teknik tillader dog ikke analyse af arterier med diameter, der er større end 50 μm, da disse fartøjer er placeret for dybt i lungevævet.
For at bygge bro over kløften i analysen af store og meget små lungearterier (såsom subpleural fartøjer) af murin lunger, vi vedtog en metode, der blev beskrevet af Martin et al. til analyse af luftvejenes reaktivitet15. Baseret på en agarose gel indgyde teknik, det letter forberedelsen af præcision skåret lunge skiver (PCLS) fra denne relativt bløde og elastiske organ. Inden for PCLS vasoreaktivitet af tværsnitsarterier med indvendig diameter mellem 20-100 μm kan observeres direkte ved videomikroskopi. Anvendelse af lægemidler under den hypoksiske inkubation af PCLS gør det muligt at analysere deres virkninger på HPV. Det er særlig vigtigt, at denne teknik også kan anvendes på gensplejset mus. Baseret på deres placering i lungerne klassificerer vi arterierne som præ- og intra-acinarbeholdere med indvendige diametre på henholdsvis 20-40 μm og 40-100 μm. Under et funktionelt synspunkt intra-acinar arterie leverer en individuel lunge acinus med blod og præ-acinar arterie er den foregående fartøj sektioner. Optagelse af billeder på et digitalt kamera giver mulighed for efterfølgende kvantificering af vasoreaktion. En indlysende egenskab ved denne PCLS-model er manglen på shear-stress, der virker på endothelium. I modsætning hertil fører akut HPV i perfunderede beholdere til en stigning i forskydningsstress, hvilket fremkalder sekundære mekanismer som NO release16. Derudover tillader brugen af PCLS målinger af HPV uden ekstrapulmoniske neurale eller hormonelle påvirkninger. I modsætning til cellekultursystemer, for eksempel fremstillet af hundepulmonal arterielle glatte muskelceller17, er karvæggens histologiske arkitektur næsten helt bevaret.
Sammenfattende giver denne protokol en nyttig metode til analyse af potentielle molekylære iltsensorer og/eller cellulære veje, der er ansvarlige for HPV i intrapulmonal arterier med indvendige diametre på mellem 20-100 μm under forhold, der er fri for forskydningsstress.
Protocol
1. Fremstilling af gasblandinger, udstyr, instrumenter og opløsninger
I dette afsnit beskrives det nødvendige udstyr og opsætningen af protokollen. Yderligere oplysninger og oplysninger fra producenten findes i den medfølgende tabel.
- Der fremstilles eller fremstilles følgende gasblandinger:
- To flasker med normoxisk gasblanding bestående af 21 % O2, 5,3 % CO2, 73,7 % N2.
- En flaske med hypoxisk gasblanding bestående af 1 % O2, 5,3 % CO2, 93,7 % N2.
- Indsaml følgende udstyr:
- En mikrobølgeovn til smeltning af agarose.
- Et varmeskab til udvaskning af agarose fra lungesektionerne (se nedenfor). Sæt et rør forbundet til en flaske med normoxisk gasblanding i kabinettet.
- En vibratome med passende barberblade, til at skære lungerne i 200 μm tykke skiver. Det er en fordel, hvis vibratomet er indrettet med et kølesæt til at køle bufferen ned i vibratomebassinet.
- Et gennemstrømnings-superfusionskammer monteret på et omvendt mikroskop til analyse af HPV af intrapulmonal arterier.
- For at lette fikseringen af lungesektionerne til bunden af kammeret skal nylonstrengene forbindes med en platinring (selvkonstrueret). Tilslut perfusionskammeret til en peristaltisk pumpe med strømningshastigheder justeret til henholdsvis 0,7 ml/min. og 6 ml/min.
- Udstyret samles således, at mediet under forsøgene opbevares i et 37 °C vandbad og bobles med normoxisk eller hypoksisk gas ved hjælp af 21 G x 4 3/4 kanyler. Derudover skal du bruge en anden forbindelse fra gasflasken for at gøre det muligt at føre de normoxiske/hypoksiske gasblandinger ind i perfusionskammerets luftrum. Sørg for, at alle rør i dette system er gastætte.
- En CCD-kamera monteret på en opretstående omvendt mikroskop til at optage billeder af arterien analyseret.
- Forbered følgende instrumenter:
- Til fremstilling af lungerne: et sterilt dissekeringssæt med en grov saks og to par pincet, en fin saks til åbning af brystet, en mikroscissor til at skære et hul i luftrøret til påfyldning af agarose og syning af bomuld (ca. 20 cm) til ligation af luftrøret for at forhindre udstrømning af agarose.
- Til påfyldning af luftvejene med agarose: Tilslut en 2 ml sprøjte til det fleksible plastrør i en IV-iwellerende kanyle (20 G x 1 1/4).
- Til perfusion af lungerne med buffer: Fastgør en 50 ml sprøjte som et bufferbeholder ca. 40 cm over arbejdspladsen til museforberedelse.
- Til udstrømning af bufferen: Tilslut sprøjten til et rør, som en 25 G x 1 kanyle er fastgjort til. Brug en klemme ved røret til at justere udstrømningen til ca. 1 dråbe/sek (ca. 0,3-0,4 ml/min.).
- Forbered følgende buffere og medier:
- Lav 1.000 ml HEPES-Ringer buffer (10 mM HEPES, 136,4 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl2•6H2O, 2,2 mM CaCl2•2H2O, 11 mM glukose, pH 7,4). Den sterile filtrated buffer (filterstørrelse: 0,2 μm) opbevares ved 4 °C.
- Ca. 30 minutter før du starter isoleringen af lungerne, forberedes følgende opløsninger:
- 1,5% m/v lavt smeltepunkt agarose opløses i HEPES-Ringer buffer (samlet volumen 10 ml) og smeltes ved tilberedning i en mikrobølgeovn. Derefter afkøles den til 37 °C ved opbevaring i et varmeskab. Før krigen 2 ml sprøjten til påfyldning af agarose i lunge luftvejene.
- Der tages 20 ml HEPES-Ringer-buffer, der tilsættes heparin til en endelig koncentration på 250 I.U./ml, og bufferen opvarmes til 37 °C. Umiddelbart før brug tilsættes natriumnitroprusside til en endelig koncentration på 75 μM. Dette er perfusionsbufferen til at løbe af blodet fra lungevakulaturen.
- Sæt 200 ml HEPES-Ringer buffer i et glasbæger og opbevar det på is. Denne buffer vil være nødvendig for afkøling af agarose-fyldte isolerede lunger.
- Der fyldes ca. 200 ml MEM suppleret med 1% penicillin/streptomycin i et glasbægerglas, og det opbevares ved 37 °C i varmeskabet. Boble mediet med normoxisk gasblanding. Dette vil blive brugt til fjernelse af agarose fra lungesektionerne.
- Prewarm 2 flasker MEM suppleret med henholdsvis 1% penicillin/streptomycin i et vandbad til 37 °C og boble dem med henholdsvis normoxisk og hypoxisk gasblanding i mindst 2 timer, før videomorfometriske målinger påbegyndes. Der kræves ca. 250 ml MEM pr. måling.
- Saml følgende yderligere materialer:
- 70% EtOH til desinfektion.
- Stamopløsning af heparin (25.000 I.U./5 ml), opbevaret ved 4 °C (se ovenfor).
- Stamopløsning af NO donornatriumnitroprussiden (Nipruss): 10 mM i H2O, opbevaret på is (se ovenfor).
- Stamopløsning af thromboxan analog U46619: 10 μM i ethanol, opbevaret på is.
- Superlim.
- Syning af bomuld til ligation af luftrøret efter påfyldning med agarose.
2. Dyr
Brug mus (for eksempel af stammen C57Bl6) af begge køn i en alder af 10-25 uger. HPV kan også analyseres i knockout stammer og de tilsvarende vilde type stammer.
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med NIH's retningslinjer for pasning og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af de lokale institutionelle bestyrelser.
3. Isolering af murin lunger og forberedelse af Precision Cut Lung Slices (PCLS)
- Dræb musen ved livmoderhalskræft dislokation. Umiddelbart efter aflivning steriliseres ventral kropsoverfladen med 70% EtOH og brug den uslebne saks til at skære huden langs den ventrale midterlinje fra hagen til bækkenet.
Bemærk: Da det er kendt, at inhalativ anæstesi som isoflurane har indflydelse på den vaskulære tone18,19, skal du ikke bruge flygtig anæstesi. - Efter åbning af bughulen skal du lægge tarmsløjferne til side og afskære de store abdominale kar for blødning. Efter at have gennemtræsat mellemgulvet med den fine saks, vil lungerne kollapse som følge af luftindgang i pleural hulrummet. Brug saksen til at løsne mellemgulvet fra den ringere bryståbning. Skær ribbenene og kravebenet sideværts for at fjerne den ventrale del af ripburet.
Bemærk: Det er vigtigt, at lungerne ikke beskadiges i dette trin, da ellers oppustethed af lungerne med agarose vil være umuligt! Brug kun sterile instrumenter og laboratorieglas. - Før du starter perfusionen af lungevakulaturen, skæres et lille hul i hjertets venstre hjertekammer til udledning af bufferen. Sprøjtebeholderen fyldes med en varm (37 °C) HEPES-Ringer-buffer, der indeholder heparin og natriumnitroprusside (perfusionsbuffer), og pulmonalvakulturen gennemgås langsomt via højre hjertekammer.
Bemærk: Perfusion er effektiv, når lungerne ændrer deres farve og får et hvidt udseende. I dette trin er det vigtigt at tilføje natriumnitroprusside i perfusionsbufferen; Dette forhindrer præ-acinar arterierne i at rippe ud fra det omgivende væv. - Fjern spytkirtlerne, små muskler og bindevæv fra luftrøret. Afbryd luftrøret fra det omgivende bindevæv og trådsyende bomuld mellem spiserøret og luftrøret til senere ligation.
- Brug mikroscissoren til at skære et lille hul i den øverste del af luftrøret mellem to nærliggende trakeale brusk. Sæt nu det fleksible plastrør i en IV-iboende kanyle via det lille hul i luftrøret, og fastgør det forsigtigt med sybomulden. Fyld langsomt luftvejene med det varme (37 °C) lave smeltepunkt agarose. Overhold lungerne: I første omgang højre lunge begynder at udvide efterfulgt af venstre lunge. Påfyldningen er afsluttet, når begge lunger er oppustet til et volumen, der kan sammenlignes med in vivo-situationen (ca. 1,2-2,0 ml afhængigt af køn, alder og vægt).
Bemærk: Hvis kun én lunge udvides, kan plastrøret være indsat for dybt, så det har nået bronkus. I dette tilfælde skal det trækkes lidt ud. Husk, at agarose vil størkne, når det gradvist køler ned. - Når lungerne er fulde, skal du samtidig trække plastrøret ud og ligate luftrøret med sybomulden for at forhindre udstrømning af agarose. Efterfølgende skæres luftrøret over ligaturen og løsner lunger og hjerte på blok fra brystet.
Bemærk: For begyndere kan det være nyttigt at bede en kollega om støtte i ligationstrinnet. - Overfør organpakken til iskold HEPES-Ringer buffer for at størkne agarose. Dette sker inden for et par minutter.
- Adskil de enkelte lungelapper og fastgør en lap med superlim på prøveholderen på vibratomet.
Bemærk: Det er nyttigt at sætte et stykke champagneprop på holderen, der fungerer som skævhed under skæring af det elastiske lungevæv. Afhængigt af den anvendte lungelap og dens orientering på prøveholderen kan den opnåede PCLS være mere egnet til analyse af små eller store beholdere. For det meste bruger vi venstre lap og højre kranieflippe til forberedelse af PCLS. For at få tværsnit små intra-acinar arterier, lim kraniet højre lap med hilum til holderen og skive fra periferien. For at få tværsnit pre-acinar arterier, tilpasse hilum af højre lap med champagne kork. - Brug en vibratome udstyret med et frisk barberblad til at skære lungeflappen i 200 μm tykke skiver (hastighed: 12 = 1,2 mm/sek; frekvens: 100; amplitude: 1,0). Pcls opsamles i vibratomebassinet fyldt med 4 °C kold HEPES-Ringer buffer.
Bemærk: Køling af HEPES-Ringer anbefales, men uvæsentligt. - Til fjernelse af agarose overføres orgelsektionerne til et glasbæger fyldt med ca. 200 ml 37 °C varm MEM. Sæt bægeret i varmeskabet, hvor et rør, der er forbundet til en flaske med normoxisk gasblanding, indsættes. Boble MEM med normoxic gas, så lungesektionerne langsomt bevæger sig i mediet. Efter ca. 2 timer fjernes "agarose plaques", der fylder luftrummet, fra lungevævet. Dette kan genkendes af det faktum, at sektionerne ikke længere svømmer på toppen af mediet, men sætter sig på bunden af bægeret.
4. Videomorfometrisk analyse af intrapulmoniske arterier af PCLS
- Til videomorfometrisk analyse af intrapulmonal arterier overføres en PCLS til gennemstrømnings-superfusionskammeret fyldt med 1,2 ml normoxisk gasset MEM. Fastgør PCLS i bunden af kammeret med nylonstrenge forbundet til en platinring (ydre/indre diameter: 14/10 mm).
- Scan PCLS mikroskopisk for tværsnitsarterier med indvendige diametre mellem 20-100 μm.
Bemærk: Arteriernes lumen er foret med flade endotelceller. De omgivende glatte muskler celler kan identificeres i fase kontrast billedet som en "mørk ring" omkring lumen (se fase kontrast billeder i figur 2). I modsætning hertil kan luftvejene identificeres ved det oprindeligt pseudostratificerede kolonneepitele, der på vej til pleuraloverfladen passerer ind i et simpelt søjlearepitetel efterfulgt af et simpelt kuboidal epitel.- Mål den indvendige diameter i begyndelsen af hvert eksperiment.
Bemærk: I let skråt udskårne beholdere kan den sande indvendige diameter af rørstrukturen bestemmes i en 90° vinkel til lumens længste akse. Store præ-acinar arterier med indvendige diametre > 40 μm løber støder op til bronkier og bronchioles. Små intra-acinar arterier med indvendig diameter <40 μm er placeret på kiler af alveolar septa ved siden af alveolae og alveolar kanaler6.
- Mål den indvendige diameter i begyndelsen af hvert eksperiment.
- Eksperimentelt design:
- Begynd hvert forsøg med en "tilpasningsfase", hvor kammeret er perfunderet med normoxisk gasset medium (strømningshastighed: 0,7 ml/min.; 10 min). Dernæst testes fartøjets levedygtighed: Analyserer arteriens kontraktilitet ved tilsætning af 12 μl på 10 μM U46619 (endelig koncentration 0,1 μM; 10 min; ingen strøm).
Bemærk: Til dette arbejde defineres et fartøj som levedygtigt, når lysområdet reduceres med mindst 30% (for målemetoden se nedenfor). - Efter udvaskning af lægemidlet med normoxisk gasset medium (strømningshastighed: 6 ml/min.) udvides arterien ved anvendelse af 3 μl på 10 mM Niprus (endelig koncentration 25 μM; 10 min; ingen strøm).
- Fjern igen lægemidlet med en 10 minutters vask med normoxisk gasset medium (strømningshastighed: 6 ml / min) efterfulgt af 10 minutter ved en strøm på 0,7 ml / min.
- Der fremkaldes hypoxisk lungevakostriktion ved inkubation af PCLS med hypoxisk gasset medium (strømningshastighed: 0,7 ml/min., 40 min). Ved et ekstra rørsystem fodres den hypoxiske gasblanding i perfusionskammerets luftrum.
- Det hypoksiske medium fjernes med en 20 minutters vask med normoxisk gasset medium (strømningshastighed: 6 ml/min).
- Ved afslutningen af hvert forsøg tilsættes 1,2 μl af 10 μM U46619 (endelig koncentration 0,01 μM; 20 min; ingen strøm) til perfusionskammeret for at fremkalde vasoconstriction.
Bemærk: Dette sidste trin gør det muligt at afgøre, om en ændring i den hypoksiske reaktion (f.eks. forårsaget af samtidig anvendelse af et lægemiddel i den hypoksiske fase eller observeret i en PCLS fremstillet af en knockoutmusstamme) er specifik for den hypoxi-inducerede indsnævring, eller om den afspejler en generel indvirkning på kontraktiliteten. Koncentrationen på 0,01 μM svarer til EC50-værdien af U46619, som blev anslået i tidligere koncentrationssammentrækningsmålinger (ikke offentliggjort). - Brug en anden PCLS til at udføre kontrolforsøg med normoxisk i stedet for hypoxisk gasset MEM og normoxisk gasblanding i perfusionskammerets luftrum.
- Begynd hvert forsøg med en "tilpasningsfase", hvor kammeret er perfunderet med normoxisk gasset medium (strømningshastighed: 0,7 ml/min.; 10 min). Dernæst testes fartøjets levedygtighed: Analyserer arteriens kontraktilitet ved tilsætning af 12 μl på 10 μM U46619 (endelig koncentration 0,1 μM; 10 min; ingen strøm).
5. Analyse af vasoreaktivitet og grafisk præsentation
- Brug passende software tage billeder fra tværsnit arterie hvert minut i hele eksperimentet.
- Ved hjælp af passende software evaluere ændringer af det luminale område af fartøjerne ved foring de indre grænser i hånden ved hjælp af fuldskærmsbilleder.
Bemærk: Det er tilstrækkeligt at analysere hvert andet billede for at få klare grafer. Men når en tilstand i gennemstrømnings-superfusionskammeret ændres til en anden, skal du analysere hvert billede. De resterende billeder fungerer som back-up, hvis et fotografi ikke kan analyseres.
Desværre skal dette tidskrævende skridt udføres manuelt og ikke af passende programmer, da blodceller undertiden er fastgjort til den vaskulære væg, der bevæger sig under målingen, eller det er ikke et perfekt tværsnit af fartøjet, men et tangentielt afsnit, hvor en pålidelig lokalisering af de indre grænser kun kan udføres under visuel kontrol. - Den værdi, der opnås for fartøjets område i begyndelsen af eksperimentet, defineres som 100% og ekspresvakolonstriktion eller dilatation som relativt fald eller forøgelse af denne værdi.
- For hvert eksperiment plot den relative luminal område mod tiden ved hjælp af passende software.
- For at opsummere flere eksperimenter skal du afbilde midlerne til de relative lysområder +/- standardfejlen i middelværdien (SEM) mod tiden.
Bemærk: For en klar præsentation af forskellige stoffers virkninger på hypoxi- eller U46619-induceret lungevakolontriktion eller af den hypoksiske reaktion fra knockoutmusstammer kan den indledende fase af forsøgene, hvor fartøjets levedygtighed testes, udelades fra grafen. I dette tilfælde defineres de værdier, der opnås ved begyndelsen af eksponeringen for reduceret ilt, som 100%.
6. Statistisk analyse
- Analyser forskelle mellem eksperimentelle grupper med Kruskal-Wallis- og Mann-Whitney-testen, hvor p≤0,05 betragtes som signifikante, og p≤0.01 meget betydelig.
Bemærk: Yderligere oplysninger om forberedelse og drift af PCLS findes også under20,21.
Representative Results
I figur 1 gives resultaterne af målingen af HPV af en stor præ-acinararterie og i figur 2 af små intra-acinararterier. I fasekontrastbillederne (Figur 1A og 2A) bliver det klart, at det er muligt at skelne mellem disse 2 arterieklasser baseret på deres placering i lungevævet: Præ-acinararterier løber i tæt nabolag til bronchi og bronchioli (Figur 1A), mens intra-acinar arterierne er placeret ved kiler af alveolar septa og omgivet af alveolae (Figur 2A). Med lidt øvelse er det muligt at se ændringerne i lysområdet som reaktion på U46619 på fasekontrastbillederne (Figur 1A og 2A). Hypoxisk lungevakolontriktion er imidlertid ofte ikke så udtalt og bliver først tydelig efter fuldstændig evaluering af ændringerne i lysområderne(Figur 1B, 1C, 2B og 2C). Af didaktisk grund har vi givet et eksempel på en præ-acinar arterie, som viser en usædvanlig udtalt vasoconstriction. I gennemsnit resulterer HPV i en 20-30% reduktion af det luminale område.
I figur 2 vises registreringer af små intra-acinararterier, der inkuberes med hypoxisk-gasset medium med eller uden 50 μM pinacidil (en ikkeselektiv åbner af mitokondrie ATP-følsomme kaliumkanaler), og lægemidlets hæmmende virkning bliver tydeligt synlig. Den sidste del af eksperimentet viser selektiviteten af lægemidlets virkning på HPV: Vasoconstriction induceret af thromboxane analog U46619 ændres ikke ved tilsætning af pinacidil. Faktisk kurven for arterien udsat pinacidil løber tydeligt lavere end de to andre, men omfanget af reduktionen af det luminale område ved U46619 alene er sammenlignelig. I dette tilfælde var det den ufuldstændige reversion af HPV, der forårsager forskellen mellem kurverne. I denne graf også en arterie udsat for normoxic gasset medium er inkluderet som yderligere kontrol. Under denne betingelse kan ingen ændringer af lysområdet registreres.
I figur 3 vises data for den komplette måleserie om pinacidils indflydelse på HPV. Til sammenligning af de to grupper for statistiske forskelle blev datasættene for de angivne tidspunkter analyseret med Kruskal-Wallis- og Mann-Whitney-testen. HPV blev klart afskaffet i nærværelse af pinacidil mens U46619-induceret sammentrækning var uændret.
Alternativt er det muligt at identificere forskelle mellem grupper ved sammenligning af det område under kurven, der er beskrevet i Müller-Redetzky et al. 22 år
Figur 1. Måling af HPV af en stor præ-acinar arterie. (A) Fase kontrast billeder af et tværsnit pre-acinar arterie (a), der løber i tæt kvarter til et tværsnit bronchus (B). Billederne tages på de tidspunkter, der er angivet i (B) af cirkler: i begyndelsen af målingen (a), ved afslutningen af behandlingen med U46619 (b), ved afslutningen af eksponeringen for Nipruss (c), efter 30 eller 40 minutter i hypoxisk gasset medium (d, e), efter vask med normoxisk gasset medium (f) og efter den endelige anvendelse af U46619 (g). I grafen (B) afbildes ændringer i lysområdet mod tiden, mens det luminale område i begyndelsen af eksperimentet defineres som 100%, og vasoconstriction/-dilatation angives som relative værdier. I dette tilfælde fremkalder hypoxi en 60% reduktion af det luminale område. (C) For en klarere præsentation af den hypoksiske reaktion er den indledende fase af det forsøg, hvor vasoreaktiviteten blev testet, ikke medtaget, men den værdi, der opnås umiddelbart før eksponering for reduceret ilt, er fastsat til 100% (se også figur 2). Klik her for at se større billede.
Figur 2. Virkningen af pinacidil (en nonselective oplukker af mitokondrie ATP-følsomme kaliumkanaler; mitoKATP) på HPV af små intra-acinar arterier. (A)Intra-acinar arterier (a) er placeret på kiler af alveolar septa. Alv = alveolus. Rækkefølgen af de individuelle betingelser, der anvendes i disse forsøg, er angivet i grafens overskrift (B). Hypoksisk eksponering udføres i nærværelse af eller fravær af 50 μM pinacidil. Kontrol inkubationer sker med normoxisk gasset medium. Billeder vist i (A) tages i begyndelsen af målingen (a, a', a"), i slutningen af behandlingen med U46619 (b, b', b"),ved afslutningen af eksponeringen for niprus (c, c', c"), efter 30 eller 40 min. i hypoksisk eller normoxisk gasset medium (d, d', d'; e, e', e"), efter vask med normoxisk gasset medium (f, f', f) og efter den endelige anvendelse af U46619 (g, g', g"). For en klarere præsentation af reaktionen på normoxia/hypoxi/hypoxi+pinacidil er de værdier, der opnås umiddelbart før eksponering for normoxisk-/hypoxisk-gasset medium, fastsat til 100% (C). Klik her for at se større billede.
Figur 3. Hæmning af HPV ved pinacidil. Registreringer af små intra-acinar arterier udsat for hypoxic gasset medium med eller uden 50 μM pinacidil opsummeres og præsenteres som middel ± SEM. I (A) anføres de fuldstændige registreringer i (B) de relative data i forhold til værdien i begyndelsen af den hypoksiske inkubation. Ingen vasoreaktivitet kan påvises i PCLS, som udsættes for hypoxisk-gasset medium, der indeholder pinacidil. Vasoconstriction induceret af U46619 påvirkes ikke af stoffet. "n" i parentes henviser til antallet af arterier/antallet af dyr, hvorfra PCLS blev fremstillet. Med andre ord beskriver det første tal antallet af analyserede lungesektioner, og det andet tal giver antallet af mus, hvorfra disse sektioner blev forberedt. På det givne tidspunkt testes forskellene mellem de to grupper for betydning. n.s.: ikke signifikant, *: p≤0.05, **: p≤0.01, ***: p≤0.001. Klik her for at se større billede.
Figur 4. Skematisk oversigt over metoden. Kort, mus dræbes af livmoderhalskræft dislokation. Efter åbning af brystet fyldes lungerne med lavt smeltepunkt agarose og efter afkøling skæres ned skåret i 200 μm tykke præcisionsskærede lungeskiver (PCLS). Efter fjernelse af agarose ved 37 °C overføres en PCLS til gennemstrømnings-superfusionskammeret, hvor den udsættes for normoxisk medium eller medium gas med 1% O2. Vasoreaktivitet registreres som ændringer i det luminale område. Klik her for at se større billede.
Discussion
Den isolerede ventilerede og perfunderede muse lunger er en glimrende model til analyse af lungepulsårens fysiologiske respons på ændringer i ilttilførslen og tillader blandt andet kontinuerlig måling af lungepulsårens tryk1. Denne model tillader dog ikke identifikation og analyse af de vaskulære segmenter, der viser den stærkeste reaktion på hypoxi. Dette er fordelen ved vores videomorfometriske analyse af PCLS, som letter målingen af HPV af individuelle arterier med indvendige diametre på 20-100 μm. PCLS repræsenterer en attraktiv in vitro-model, da de ligner det organ, hvorfra de fremstilles. I modsætning til cellekultursystemer er alle celletyper til stede i deres oprindelige vævsmatrixkonfiguration. Desuden er en lunge tilstrækkelig til fremstilling af mange PCLS, således at i det mindste delvist eksperimenter kan standardiseres ved brug af sektioner fra samme mus. Ifølge 3R-konceptet (reduktion, raffinement og udskiftning af forsøgsdyr i biovidenskab) af Russell og Burch23 argumenterer dette også for brugen af PCLS.
Man skal dog huske på, at vævet beskadiges ved at skære med en vibratome og langsgående signalering for eksempel via endotelcellerne som postuleret af Kübler et al. 14 er ikke længere muligt.
I begyndelsen blev PCLS hovedsagelig anvendt til biokemiske, farmakologiske og toksikologiske undersøgelser, men i mellemtiden anvendes de også til måling af bronkial kontraktilitet, mucociliary funktion og vaskulære reaktioner (for anmeldelser se Sanderson20 og Davies21). Afholdt et al. har udført en undersøgelse, hvor de sammenlignede modellerne af isoleret perfunderet og ventileret muse lunger og PCLS24. De fandt ved analyse af luftvejenes og lungefartøjernes reaktioner på en række endogene mæglere, at vigtige egenskaber ved hele lungerne blev opretholdt i PCLS.
I PCLS er hypoksiske tilstande ikke etableret via luftvejene som i den intakte lunge, men ved inkubation af lungesektionen i hypoxisk-gasset medium. Vi har analyseret ilt delvis tryk (pO2)af medium forgasset med 1% O2, 5,3% CO2, 93,7% N2 og med 21% O2, 5,3% CO2, 73,7% N2, henholdsvis ved hjælp af en blodgas analysator. Umiddelbart før den blev tilsat perfusionskammeret, var pO2 i den hypoxiske gassede MEM 40 mmHg og den normoxiske gassede medium 160 mmHg6. I den intakte lunge HPV induceres, når alveolar pO2 falder til under 50 mmHg25, en situation, der naturligvis kan efterlignes ved anvendelse af hypoxisk-gasset medium. Vores data om omfanget af HPV matcher godt til resultater opnået med en anden eksperimentel tilgang. Yamaguchi et al. har anvendt isolerede rotte lunger til at undersøge mikrovesseler med en diameter på 20-30 μm ved real-time confocal laserscanning luminescens mikroskopi koblet til en høj følsomhed kamera med et billede forstærker10. De observerede en gennemsnitlig reduktion i diameter på 2,7 μm efter eksponering af lungerne for hypoxi. Man kan beregne, at en 20% reduktion af det luminale område, som vi måler det i vores system svarer til omkring 15% fald i diameter.
I vores eksperimenter har vi klassificeret arterierne som henholdsvis præ- og intra-acinarbeholdere med indvendige diametre på henholdsvis 40-100 μm og 20-40 μm. Hos mennesker sker overgangen fra muskuløse til ikkemuskulære arterier i diameterområdet 70-100 μm. Hos mus er glatte muskelceller til stede ned til en ekstern diameter på 20 μm26. Af denne grund er det ikke muligt at analysere arterier med diametre under 20 μm, da de ikke kan pålidelige identificeres baseret på fasekontrastbilledet. I den anden ende af skalaen er fartøjer med en diameter på over 100 μm næppe at finde i PCLS og almindeligvis fjernet fra det omgivende væv.
Faktisk diskuteres en række molekylære kandidater som molekylær iltsensor (r) eller som en del af signalkaskaden, hvilket resulterer i HPV (for en gennemgang se Sylvester et al. 4). Når passende knockout mus er tilgængelige videomorfometrisk kan bruges til analyse af vasoreaktivitet af præ-og intra-acinar arterier i forhold til vilde type dyr. Pcls er dog også blevet brugt til andre spørgsmål: Faro et al. ansat dem til at karakterisere udviklingen af endotelafhængig dilation i lungerne efter fødslen29 og PCLS fremstillet af marsvin, der dagligt blev udsat for røg eller luft i 2 uger, blev brugt til at påvise cigaretrøgs indvirkning på vasoreaktivitet via induktion af endotel dysfunktion30.
Kritiske trin i protokollen
I vores eksperimenter klassificerede vi arterierne som præ-acinar (indvendige diametre på 40-100 μm) og intra-acinar (indvendige diametre på 20-40 μm). Især til fremstilling af lungesektioner, der skal anvendes til analyse af større beholdere, er det vigtigt at tilføje natriumnitroprusside til perfusionsbufferen. Dette lægemiddel forhindrer sammentrækning af karrene under prøveforberedelsen og derved deres rip off fra det omgivende væv, der fører til ufuldstændig vasodilation. Natriumnitroprusside i perfusionsbufferen er ikke så vigtig for forberedelsen af lungesektionen, som bør anvendes til analyse af små arterier, fordi de er stærkt forankret til alveolar septa.
Alle forsøg skal startes med inkubationer, hvor arteriernes reaktivitet testes. Sjældent opnåede vi lungepræparater, hvor skibenes reaktion på entreprenører eller dilatatorer ikke kunne påvises. Vi kender ikke årsagen til dette: Kan være, at mængden af agarose fyldt i lungerne var for stor eller for lav, så skæring af organet i PCLS ikke var optimal. Alternativt er det tænkeligt, at agarose kølede ned for hurtigt under indgydelsesproceduren, hvilket resulterede i skadelig forskydningsstress. Hvis der i en individuel PCLS ikke kan påvises nogen levedygtig arterie, skal sektionen kasseres og erstattes af en anden.
Beslutningen om levedygtigheden af en arterie blev truffet på grundlag af reaktionen på U46619. Anvendelse af U46619 i en koncentration på 0,1 μM fremkalder en vasoconstriction, som - efter en vis øvelse - er synlig direkte i billedsekvensen på skærmen. Da der er nogle afvigelser i vasoreaktiviteten, undersøger vi virkningen af et lægemiddel på HPV ved at måle vasoresponset i lungesektioner, der udsættes for stoffet eller til mediet alene igen.
HPV af en individuel arterie er ofte næppe påvises i mikroskopet, og i gennemsnit resulterer det i en reduktion af det luminale område på omkring 20-30%. Men små ændringer i diameteren af en arterie har en særskilt input på flow modstand. Ifølge ligningen "R = 1/r4"med R=modstand og r=radius er strømningsmodstanden omvendt proportional med radiusens fjerde effekt. Lad mig give et eksempel: En "ideel arterie", der udviser et cirkulært tværsnit med en diameter på 40 μm (r = 20 μm) har et luminalt område på ca. 1.260 μm2. Når det luminale område reduceres med 20%, kan vi beregne, at beholderens diameter reduceres med 10,5% til 35,8 μm (r = 17,9 μm). Ifølge ligningen ovenfor vil dette fartøjs strømningsmodstand stige fra 6,25 x 10-6 til 9,71 x 10-6, der er med ca. 55%. I tilfælde af en reduktion af det luminale område med 30% ville radius falde med ca. 16%, men strømningsmodstanden ville stige med ca. 100%. Selv om disse beregninger er en oversimplificering, hvor en laminar blodgennemstrømning og en kar form af et stift rør antages det tyder på virkningen af allerede mindre ændringer i diameteren på flow modstand.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning er sponsoreret af Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
| Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
| Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
| Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
| Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
| Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
| Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
| Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
| Various scissors and forceps | |||
| Sewing cotton | |||
| 2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
| Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
| Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
| Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
| Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
| HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
| NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
| KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
| MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
| CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
| Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
| Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
| Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
| Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
| 70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
| Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
| U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
| Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
| Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
| SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |
References
- Weissmann, N., Akkayagil, E., et al. Basic features of hypoxic pulmonary vasoconstriction in mice. Respir. Physiol. Neurobiol. 139, 191-202 (2004).
- Leach, R. M., Hill, H. M., Snetkov, V. A., Robertson, T. P., Ward, J. P. T. Divergent roles of glycolysis and the mitochondrial electron transport chain in hypoxic pulmonary vasoconstriction of the rat: identity of the hypoxic sensor. J. Physiol. 536, 211-224 (2001).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104 (2), 338-3346 (2008).
- Sylvester, J. T., Shimoda, L. A., Aaronson, P. I., Ward, J. P. Hypoxic pulmonary vasoconstriction. Physiol. Rev. 92 (1), 367-520 (2012).
- Schumacker, P. T. Lung cell hypoxia: role of mitochondrial reactive oxygen species signaling in triggering responses. Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 477-4784 (2011).
- Paddenberg, R., König, P., Faulhammer, P., Goldenberg, A., Pfeil, U., Kummer, W. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir. Res. 29 (7), 93-109 (2006).
- Paddenberg, R., et al. Mitochondrial complex II is essential for hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction of intra- but not of pre-acinar arteries. Cardiovasc. Res. 93 (4), 702-710 (2012).
- Wang, L., Yin, J., et al. Hypoxic pulmonary vasoconstriction requires connexin 40-mediated endothelial signal conduction. J. Clin. Invest. 122 (11), 4218-4230 (2012).
- Archer, S. L., Huang, J. M., et al. Differential distribution of electrophysiologically distinct myocytes in conduit and resistance arteries determines their response to nitric oxide and. 78, 431-442 (1996).
- Yamaguchi, K., Suzuki, K., et al. Response of intra-acinar pulmonary microvessels to hypoxia, hypercapnic acidosis, and isocapnic acidosis. Circ. Res. 82, 722-728 (1998).
- Bennie, R. E., Packer, C. S., Powell, D. R., Jin, N., Rhoades, R. A. Biphasic contractile response of pulmonary artery to hypoxia. Am. J. Physiol. 261(2 Pt. 1, 156-163 (1991).
- Glazier, J. B., Murray, J. F. Sites of pulmonary vasomotor reactivity in the dog during alveolar hypoxia and serotonin and histamine infusion). J. Clin. Invest. 50 (12), 2550-2558 (1971).
- Bhattacharya, J., Staub, N. C. Direct measurement of microvascular pressures in the isolated perfused dog lung. Science. 210, 327-328 (1980).
- Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 458-4565 (2011).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur. Respir. J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Grimminger, F., Spriestersbach, R., Weissmann, N., Walmrath, D., Seeger, W. Nitric oxide generation and hypoxic vasoconstriction in buffer-perfused rabbit lungs. J. Appl. Physiol. 78, 1509-1515 (1995).
- Ng, L. C., Kyle, B. D., Lennox, A. R., Shen, X. M., Hatton, W. J., Hume, J. R. Cell culture alters Ca2+ entry pathways activated by store-depletion or hypoxia in canine pulmonary arterial smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294 (1), 313-323 (2008).
- Fehr, D. M., Larach, D. R., Zangari, K. A., Schuler, H. G. Halothane constricts bovine pulmonary arteries by release of intracellular calcium. J. Pharmacol. Exp. Ther. 277 (2), 706-713 (1996).
- Oshima, Y., Ishibe, Y., Okazaki, N., Sato, T. Isoflurane inhibits endothelium-mediated nitric oxide relaxing pathways in the isolated perfused rabbit lung. Can. J. Anaesth. 44 (10), 1108-1114 (1997).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm. Pharmacol. Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Davies, J. Replacing Animal Models: A Practical Guide to Creating and Using Culture-based Biomimetic Alternatives (Google eBook. , John Wiley & Sons. 57-68 (2012).
- Müller-Redetzky, H. C., Kummer, W., et al. Intermedin stabilized endothelial barrier function and attenuated ventilator-induced lung injury in mice). PLoS One. 7 (5), (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. Universities Federation for Animal Welfare. , Wheathampstaed, UK. (1959).
- Held, H. D., Martin, C., Uhlig, S. Characterization of airway and vascular responses in murine lungs. Br. J. Pharmacol. 126 (5), 1191-1199 (1999).
- Köhler, D., Schönhofer, B., Voshaar, T. Pneumologie: Ein Leitfaden für rationales Handeln in Klinik und Praxis. Thieme Verlag. , 198-19 (2009).
- Will, J. The Pulmonary Circulation. in Health and Disease. Elsevier Science, p49. , (1987).
- Faro, R., Moreno, L., Hislop, A. A., Sturton, G., Mitchell, J. A. Pulmonary endothelium dependent vasodilation emerges after birth in mice. Eur. J. Pharmacol. 567 (3), 240-244 (2007).
- Wright, J. L., Churg, A. Short-term exposure to cigarette smoke induces endothelial dysfunction in small intrapulmonary arteries: analysis using guinea pig precision cut lung slices. J. Appl. Physiol. 104, 1462-1469 (2008).
