Summary
Агроинфильтрация и агроинфекция PVX являются обычными функциональными анализами для преходящей эктопической экспрессии генов в растениях. Эти методы являются эффективными анализами в стратегиях effectoromics (быстрое сопротивление и открытие гена авируляции) и имеют решающее значение для современных исследований в молекулярной патологии растений. Они отвечают спросу на надежный функциональный анализ высокой пропускной способности на заводах.
Abstract
Агроинфильтрация и агроинфекция PVX являются двумя эффективными переходными экспрессиями для функционального анализа генов-кандидатов в растениях. Наиболее часто используемым агентом для агроинфильтрации является Agrobacterium tumefaciens, патоген многих видов растений дикота. Это означает, что агроинфильтрация может быть применена ко многим видам растений. Здесь мы представляем наши протоколы и ожидаемые результаты при применении этих методов к картофелю(Solanum tuberosum), связанный с ним дикий клубень-несущий вид Solanum (раздел Solanum Petota) и модель растения Nicotiana benthamiana. В дополнение к функциональному анализу отдельных генов, таких какрезистентность (R) или avirulence(Avr) гены, анализ агроинфильтрации очень подходит для повторения R-AVR взаимодействий, связанных с конкретными взаимодействиями патогенов хозяина, просто доставляя R и Avr трансгенов в ту же клетку. Тем не менее, некоторые генотипы растений могут вызвать неспецифические ответы обороны на Agrobacterium, как мы наблюдали, например, для нескольких генотипов картофеля. По сравнению с агроинфильтрацией, обнаружение активности AVR с PVX агроинфекции является более чувствительным, более высокой пропускной способностью в функциональных экранах и менее чувствительны к неспецифическим ответы обороны Agrobacterium. Тем не менее, неспецифическая защита PVX может произойти, и есть риск пропустить ответы из-за вирус-индуцированной крайней устойчивости. Несмотря на такие ограничения, по нашему опыту, агроинфильтрация и PVX агроинфекции являются подходящими и дополнительными анализами, которые могут быть использованы одновременно для подтверждения результатов друг друга.
Introduction
Effectoromics, высокой пропускной способности функциональной геномики подход недавно появился в качестве мощного инструмента для выявления резистентности (R) генов в растениеводствах и соответствующиеавируляции( Avr ) геныпатогенов 1-4. В отличие от более трудоемкой стабильной трансформации с генами R, стратегия эффекторомии основана на переходных анализах последовательностей генов патогенов.
Со времен геномики были широко изучены геномы растительных патогенов. Например, для oomycetes, которые включают наиболее разрушительных патогенов растений, большие коллекции последовательностей были созданы и проанализированы для генов, которые играют определенную роль во время взаимодействия срастением 5-10. Один класс патогенных белков представляет эффекторы, которые манипулируют структурой клеток-хозяина и функционируют либо для облегчения инфекции (факторы вирулентности), либо для запуска защитных реакций(факторов авируляции) 11-13. Выражение генов Avr в клетках растений, содержащих R-гены, обычно приводит к гиперчувствительной реакции смерти клеток (HR) 14,15. В подошве экспрессия генов R и Avr может быть выполнена с помощью переходных систем экспрессии, таких как Agrobacterium tumefaciens - основаннаяпреходящая трансформация (агроинфильтрация)16. Эта преходящая трансформация также может быть применена в сочетании с вирусными системами экспрессии (агроинфекция)17,18.
Для агроинфильтрации наиболее часто используемым агентом является A. tumefaciens, широко распространенный патоген дикотовых растений. A. tumefaciens содержит опухолеобразующую (Ti) плазмиду. Передача ДНК (Т-ДНК) из плазмиды Ti будет транслокироваться в клетки растений после активации вирулентного механизма бактерии. Это может быть вызвано в раненых растительных клеток, выпущенных низкоямокулярно-вес фенольных соединений и моносакхаридов в слегка кислойсреде 19. Ген вирулентности активируется после проникновения суспензий Agrobacterium в листовые панели, определяемые основными венами. Затем растительные клетки в листовых панелях преобразуются и выражают трансген (ы), содержащийся в области Т-ДНК.
Агроинфекция основана на ране-прививке Agrobacterium, который является посредником при транслокации вируса в клетки растений. Затем вирус распространяется на соседние ткани растений, при отсутствии агробактерий. Для агроинфекции можно использовать несколько растительных вирусов. РНК-вирусы являются идеальными векторами экспрессии генов, поскольку они могут размножаться до очень высоких уровней в инфицированных растениях. Среди вирусов РНК растений, Картофельный вирус X (PVX) широко используется для эффектомических экранов. Для облегчения функциональных тестов для вставленного гена, бинарные векторы, которые содержат геном PVX в окружении вируса мозаики цветной капусты 35S промоутер и терминатор нопалин синтазы, были клонированы в T-ДНК A. tumefaciens20. После передачи Т-ДНК в растительные клетки геном PVX, содержащийся в Т-ДНК, транскрибируется из промоутера 35S. Затем вирусные частицы системно распространяются в зараженных растениях, что приводит к экспрессии вставленного гена. Этот метод, основанный как на Agrobacterium, так и pvX, называется PVX agroinfection.
Здесь мы покажем примеры как для агроинфильтрации, так и для анализов агроинфекции PVX. В качестве принимающих растений мы используем зародышевуюплазму картофеля (раздел Solanum Petota), для которой подходы effectoromics были впервые идоказали свою успешноту 3,4. Мы также используем Nicotiana benthamiana, который известен как модель завода в Solanaceous растений 14,21,22.
Protocol
1. Условия выращивания и тестирования растений
- Выращивать и поддерживать растения в контролируемых теплицах или климатических камерах в пределах температурного диапазона 18-22 градусов по Цельсию и в режиме естественного света или с режимом 16 часов/8 часов днем/ночью. Удалите подмыслие ветви, чтобы сделать растения более управляемыми.
- Для картофеля, поддерживать в пробирке растения в стерильных пластиковых банок, содержащих Murashige-Skoog (MS) среды (20 г/ л сахарозы, 5 г/л солей МС с витаминами, 8 г/л агара, рН 5,8) в контролируемых условиях в климатических камерах при 18 градусах Цельсия с режимом 16 часов/8 часов в течение двух недель, а затем перенесите их в горшки стерилизованной почвы в регулируемых тепличных отсеках.
2. Агроинфильтрация
- Растительный материал:
Для Nicotiana benthamiana,используйте около 4-5 недель старых семян выращенных растений. Для картофеля, используйте около 4-5 недель пересадки из in vitro. Выбирайте молодые, здоровые и полностью развитые листья для инфильтрации. -
Культура агробактерий:
- Подготовьте носитель YEB заранее(таблица 1). Заполните 50 мл трубок 10 мл ЕЭБ среды, дополненной 1 ацетосириноном (200 мМ), буфером МЭЗ (2-(N-морфолино) - этановой сульфоновой кислотой, 1 М) и соответствующими антибиотиками. Пипетт 20 хликерол запас желаемых штаммов (Таблица 2) (содержащий ген интереса) в YEB. Инициировать культуры для всех штаммов Агробактерий в этом анализе в то же время. Инкубировать клетки путем встряхивания в течение 1-2 дней при 28 градусов по Цельсию и 200 об / мин до OD600 примерно 1,0.
- Урожай клеток центрифугации на 3000 х г в течение 10 мин. Слейте супернатант и повторно помеская гранулы в свежеприготовленной среде ММА (таблица3) в OD600 из 0,3. Аккуратно вихревые клетки, чтобы повторно их перерасходовать. Для фильтрации двух бактериальных штаммов смешайте культуру в соотношении 1:1.
- Оставьте культуру на скамейке при комнатной температуре на 1-6 часов до проникновения. В то же время, этикетка растений, которые будут проникли и дата эксперимента.
- Инфильтрации:
Используйте 1 мл безгольного шприца, чтобы проникнуть в подвески Agrobacterium. Тщательно и медленно впрыскив листовые панели с подвесками из шприца (по соображениям здоровья и безопасности во время этого процесса следует носить защиту глаз). Проникнуть по крайней мере три растения для каждого штамма. Используйте три листа на растение, чтобы служить в качестве тройной.
Примечание: Обычно, 1 мл подвески Agrobacterium s может быть достаточно для 3 растений N. benthamiana. Для картофеля требуется больше суспензии, потому что листья видов Solanum труднее проникнуть. Необходимые объемы суспензий зависят от вида Solanum. Избегайте перекрестного загрязнения путем изменения перчатки или стерилизации перчатки с этанолом между инфильтрациями и не полива растений до следующего дня после прививки. - озвучивание:
Оценка макроскопических ответов примерно через 3 дня после инфильтрации, когда фенотип смерти клетки ясен(рисунок 1). Если фенотип смерти клетки является количественным, используйте данные критерии(рисунок 2). Короче говоря, весы для макроскопической скоринга клеточной смерти в основном зависит от процентной доли клеточной смерти в проникли области. Проценты клеточной смерти изображены по шкале от 0% (без симптомов) до 100% (слияние клеточной смерти). Промежуточные реакции варьируются от слабых реакций, таких как хлороз, до повышения уровня клеточной смертности. При желании макроскопический скоринг также может быть количественно оценен с помощью современного фотовизионного оборудования.
3. PVX Агроинфекция
- Растительный материал:
Для N. benthamiana,используйте около 2-3 недель старых семян выращенных растений. Для картофеля, используйте около 2-3 недельных трансплантаций из in vitro. Для крупномасштабных испытаний используйте немного более старые (4-5 недель) растения, так как эти растения имеют все больше и больше листьев для размещения большего количества мест прививки Agrobacterium. -
Культивирование агробактерий:
- Подготовь ЕБ заранее. Заполните 10 мл трубок 3 мл YEB, дополненных соответствующими антибиотиками. Пипетт 20 хликерол запас желаемых штаммов (Таблица 2) (содержащий ген интереса) в YEB. Инициировать культуры для всех штаммов Агробактерий в этом анализе в то же время. Инкубировать клетки путем встряхивания в течение 1-2 дней при 28 градусов по Цельсию и 200 об / мин до OD600 примерно 1,0.
- Pipette около 300 мкл каждого штамма Агробактерий и распространение их на LB твердых агар средних пластин, дополненных соответствующими антибиотиками и инкубации клеток при 28 градусов по Цельсию в течение 1-2 дней.
- Инфекций:
Используйте шпатель для сбора культуры Агробактерий в тарелке. Опустите деревянную зубочистку в культуру Агробактерий на шпатель и проколите листья, чтобы привить большое количество бактерий. Прививать по крайней мере три растения для каждого штамма. Используйте три листа на растение, чтобы служить в качестве тройной. В каждом листе, сделать несколько мест прививки для каждого штамма. - озвучивание:
Оценка макроскопических ответов примерно через две недели после прививки(рисунок 3). Для экранов с высокой пропускной способностью записывают качественные ответы (да/нет) для каждого места прививки. Затем рассчитайте процент ответивших сайтов и сравните их с элементами управления.
Representative Results
На рисунке 1 показан репрезентативный эксперимент агроинфильтрации с 7 различными эффекторами (E1-E7) в картофеле и N. benthamiana. Клеточная смерть появляется в проникших листовых панелях примерно через 3 дня после проникновения. Степень фенотипа смерти клеток должна быть сравнена с контролем. Смесь штамма Agrobacterium AGL1 (pVirG)23, содержащая pBINplus-R3a и pK7WG2-AVR3a, использовалась в качестве положительногоконтроля 24,25, в то время как AGL1 (pVirG) использовался в качестве отрицательного контроля. Цифры 1A и 1B показывают хорошие примеры агроинфильтрации в генотипе картофеля MaR8 (Mastenbroek R8)26 и N. benthamiana,соответственно, которые очень податлив для агроинфильтрации. Существует слияние клеточной смерти в лист панели coinfiltrated с положительным контролем, в то время как не реакция смерти клеток происходит с отрицательным контролем или pBINplus-R3a. В MaR8 два эффектора AVR3a (E2) и AVR4 (E3) вызывают гибель клеток, в то время как другие эффекторы (E1 и E4-E7) не вызывают. На рисунках 1С и 1D приведены примеры агроинфильтрации дикого картофеля Solanum berthaultii 483-1 и Solanum rechei 210-5, которые не очень хорошо подотнося для техники агроинфильтрации. В S. berthaultii 483-1, ткани листьев показывает неспецифический некроз к отрицательному контролю также, как к всем испытанным effectors. В S. rechei 210-5, проникшие листовые панели показывают очень слабую реакцию смерти клеток на положительный контроль.
На рисунке 2 показан ряд скоринга весы, которые могут быть использованы для количественной оценки ответ на агроинфильтрированный агробактерий. Проценты клеточной смерти изображены в масштабе 0-100%. Наблюдаемые фенотипы варьируются от макроскопически не видимых симптомов (0%), через ряд промежуточных реакций, отображающих хлороз и повышение уровня клеточной смерти, до смерти в результате слияния клеток (100%).
На рисунке 3 показан репрезентативный эксперимент после агроинфекции PVX в картофеле. Как правило, расширение клеточной смерти можно найти на участках примерно через две недели после прививки зубочистки. Как показано на обеих панелях фигуры, расширение клеточной смерти присутствует на участках, которые были зуб-выбрать прививки с pGR106-CRN2 (положительный контроль с использованием эффектора crinkler Crn2), который является общей клеточной смерти индуцирующих ген от P. infestans27. Помимо незначительной реакции на раны, не расширяется гибель клеток отмечается в местах, которые были зуб-выбрать прививки с pGR106-пустой (отрицательный контроль). На рисунке 3A, представляющих генотип картофеля MaR3 (Mastenbroek R3), два pGR106-эффекторов (E1 и E2) не вызывают клеточной смерти. На рисунке 3Bпредставлен положительный результат скрининга эффектора в дикой природе Solanum huancabambense 354-1; реакция смерти клетки наблюдалась к 2 pGR106-effectors (E1-E3, представляя elicitins)28.
Рисунок 1. Примеры агроинфильтрации картофеля и N. benthamiana. Растения, втом числе( A ) картофель генотип MaR8 (Mastenbroek R8), ( B )N. benthamiana, (C) Solanum berthaultii 483-1 и (D) Solanum rechei 210-5 были проникли с смесь штамма Агробактерий AGL1 (pVirG) 23, содержащего pBINplus-R3a и pK7WG2-AVR3a (положительный контроль), AGL1 (pvirG) (отрицательный контроль), pBINplus-R3a, и семь эффекторов (E1-E7). Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 2. Количественная оценка ответов на агроинфильтрацию. На фотографии показаны репрезентативные шкалы скоринга для клеточной смерти, от 0% (без симптомов) до 100% (слияние клеточной смерти). Промежуточные реакции варьируются от слабых реакций, таких как хлороз, до повышения уровня клеточной смертности. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Рисунок 3. Примеры агроинфекции PVX в картофеле. Картофельный генотип MaR3 (Mastenbroek R3) (A) и Solanum huancabambense 354-1 (B) зубочистка, привитая pGR106-CRN2 (положительный контроль), pGR106-пустой (отрицательный контроль) и pGR106-E1-2 (эффекторы), или pGR106-E1-E3, соответственно. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
Таблица 1. ЕБ средний
| 1 л | дистиллированной H2O |
| 5 г | сахароза |
| 5 г | экстракт говядины |
| 5 г | бактериологический пептон |
| 1 г | дрожжевой экстракт |
| 2 мл | MgSO4 (1 М) |
Таблица 2. Векторы и штаммы, используемые для агроинфильтрации и агроинфекции PVX. Можно использовать несколько бинарных векторов. Векторы в приведенном ниже списке позволяют высоко экспрессии генов-кандидатов и хорошо сработали в наших руках. Мы предпочитаем использовать штамм Agrobacterium GV3101 (pMP90)29 в N. benthamiana и найти AGL130, содержащий плазмидную плазмину pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 больше подходит вкартофеле 31. Дополнительные штаммы были проанализированы в других группах на различных модельных растений, включая N. benthamiana, но не вкартофеле 32.
GW: шлюз версия36
Таблица 3. ММА среды.
Отрегулируйте рН до 5,6.
Discussion
Переходные анализы, такие как агроинфильтрация и агроинфекция являются эффективными методами, которые имеют жизненно важное значение для современных молекулярных исследований патологии растений. Несмотря на некоторые ограничения, эти методы отвечают спросу на эффективный и надежный функциональный анализ высокой пропускной способности на заводах.
Система агроинфильтрации является широко используемым функциональным анализом в ряде видов растений. Агроинфильтрация облегчает доставку нескольких трансгенов в ту же клетку с одновременным выражением взаимодействующих белков. Это выгодно для повторения R-AVR отношений, путем coinfiltrating Агробактерии штаммов, которые выражают Avr генов с штаммами, которые выражают соответствующие R генов. Кроме того, для известных пар R-AVR, такие coinfiltrations могут быть использованы в качестве положительного контроля. Включение таких элементов управления имеет важное значение, поскольку в некоторых генотипах растений эффективность преобразования может быть ниже порога для обнаружения ответов. В том числе отрицательный контроль, например, штамм Агробактерий, содержащий вектор без вставки гена, также имеет важное значение для определения того, является ли определенный генотип растений поднимает неспецифические ответы обороны на Agrobacterium. Эта особенность происходит на определенной частоте в зародышевой плазме картофеля, и не все виды Solanum хорошо подходят для этой системывыражения на основе агробактерий. Как правило, анализ агроинфильтрации очень хорошо работает в N. benthamiana и большинстве генотипов картофеля. В дополнение к effectoromics, Существуют различные другие потенциальные применения для техники агроинфильтрации, такие как производство белков из трансгенов и локализации белка в клетках растений конфокальной микроскопии.
PVX agroinfection является очень чувствительной системой скрининга и, как правило, более подходит для высокопроходных скринингов. Так как Agrobacterium в настоящее время присутствует только локально, неспецифические реакции на эту бактерию в настоящее время не очень тревожные, так как вирус PVX берет на себя дальнейшее распространение трансгена. Тем не менее, растения могут быть устойчивы к PVX, или монтировать экстремальные сопротивления (ER) ответы, и в этом случае метод агроинфекции не подходит. Еще одним ограничением метода агроинфекции PVX является размер вставки гена интереса. Наблюдаемые фенотипы реакций могут варьироваться от интенсивного черного некроза, окружающего рану, до слабого некроза вблизи места прививки. Как в N. benthamiana, так и в Solanum виды, PVX агроинфекция признана более чувствительной, чем агроинфильтрация.
Учитывая, что генетический фон различных проверенных генотипов растений может иметь некоторые ограничения (см. выше), мы обычно получаем аналогичные выводы по PVX агроинфекции и агроинфильтрации. Эти результаты также сопоставимы, как получено в других анализах, таких как инфильтрациябелка 29 и ELISA3. Учитывая преимущества и ограничения обеих систем, мы рекомендуем использовать оба метода, чтобы либо дополнять друг друга, либо подтверждать независимые результаты.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Работа частично поддерживается Фондом Университета Вагенингена (WUF), Программой Стипендиального Совета Китая для аспирантов и грантом NWO-VIDI 12378.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
| Incubator | Infors HT | Multitron II | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |
References
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors. Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).
- Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes. Plos One. 3, 1-10 (2008).
- Oh, S. K., et al. In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2. Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).
- Tyler, B. M., et al. Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis. Science. 313, 1261-1266 (2006).
- Haas, B. J., et al. Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans. Nature. 461, 393-398 (2009).
- Levesque, C. A., et al. Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire. Genome Biol. 11, 1-22 (2010).
- Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. Oomycete genomics: new insights and future directions. FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).
- Stassen, J. H. M., et al. Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing. Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).
- Kemen, E., et al. Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).
- Win, J., et al. Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , Cold Spring Harbor. 1-13 (2012).
- Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms. Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).
- Kamoun, S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes. Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).
- van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 122, 101-108 (1997).
- Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. In planta expression of oomycete and fungal genes. Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).
- Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H. In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics. Diversity, Interactions, and Research Tools. Lamour, K., Kamoun, S. 23, 455-475 (2009).
- Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE. J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).
- Lu, R., et al. High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance. EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).
- Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves. Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).
- Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., Ané, J. M., Jiang, J. Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato. Plos One. 4, 1-8 (2009).
- van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).
- Huang, S., et al. Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato. Plant J. 42, 251-261 (2005).
- Armstrong, M. R., et al. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).
- Kim, H. J., et al. Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes. Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).
- Torto, T. A., et al. EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora. Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum. Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).
- Koncz, C., Schell, J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary. Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).
- Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).
- Rietman, H. Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , Wageningen University. (2011).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- van engelen, F. A., et al. pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).
- Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. A mini binary vector series for plant transformation. Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).
- Curtis, M. D., Grossniklaus, U. A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).
