Summary
アグロインフィルトレーションおよびPVXのアグロパネシスは、植物の遺伝子の一過性異所性発現に関する日常的な機能アッセイです。これらの方法は、エフェトロミクス戦略(迅速抵抗性およびアビルール遺伝子発見)における効率的なアッセイであり、分子植物病理における現代研究にとって極めて重要である。プラントでの堅牢な高スループット機能分析の需要に対応します。
Abstract
アグロインフィルトレーションとPVXのアグロパネシスは、植物の候補遺伝子の機能解析のための2つの効率的な一過性発現アッセイです。アグロインフィルグに最も一般的に使用される薬剤は、多くの二分植物種の病原体であるアグロバクテリウム・トゥメファシエンスです。これは、多くの植物種にアグロインフィルトレーションを適用できることを意味します。ここでは、これらの方法をジャガイモ(ソラナム結節)、その関連野生の塊茎を含むソラナム種(ソラナムセクションペトタ)およびモデル植物ニコティアナベンタミナにこれらの方法を適用する際に、我々のプロトコルと期待される結果を提示する。単一遺伝子の機能解析に加えて、抵抗性(R)またはアビロリジェンス(Avr)遺伝子、農浸浸法アッセイは、単にRとAvrトランスジーンを同じ細胞に送達することによって、特定の宿主病原体相互作用に関連するR-AVR相互作用を再現するのに非常に適している。しかし、いくつかの植物遺伝子型は、例えばいくつかのジャガイモの遺伝子型について観察されるように、アグロバクテリウムに対する非特異的な防御応答を上げることができる。アグロインフィルトレーションと比較して、PVXアグロプレシフィシンによるAVR活性の検出は、より敏感で、機能的なスクリーンでより高いスループットであり、アグロバクテリウムに対する非特異的な防御応答に対する感受性が低い。しかし、PVXに対する非特異的な防御が起こり、ウイルスによる極度の抵抗による応答を逃す危険性があります。このような制限にもかかわらず、我々の経験では、アグロインフィルトレーションとPVXの農業感染は、お互いの結果を確認するために同時に使用することができる適切かつ補完的なアッセイの両方です。
Introduction
エフェクトロミクスは、近年、作物植物における耐性(R)遺伝子を同定する強力なツールとして、高スループット機能ゲノミクスアプローチが出現し、病原体のアビラレンス(Avr)遺伝子と一致する。R遺伝子を使用してより時間のかかる安定した変換とは対照的に、エフェトロミクス戦略は病原体遺伝子配列の一過性アッセイに基づいています。
ゲノミクス時代以降、植物病原体のゲノムは広く探求されてきました。例えば、最も壊滅的な植物病原体を含むoomycetesの場合、大規模な配列が生成され、植物5-10との相互作用の間に役割を果たす遺伝子について分析されている。病原体タンパク質の1つのクラスは、感染を促進するために宿主細胞の構造および機能を操作するエフェクターを表す(病原性因子)または防御応答(アビルール因子)11-13を誘発する。R遺伝子を含む植物細胞におけるAvr遺伝子の発現は、通常、過敏細胞死反応(HR)14,15をもたらす。RおよびAvr遺伝子のプランタ発現では、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス-ベースの一過性変換(アグロインフィルトレーション)16などの一過性発現系を用いて達成することができる。この一過性の変換は、ウイルス発現系(agro感染)17,18と組み合わせて適用することもできる。
アグロインフィルトレーションの場合、最も一般的に使用される薬剤は、ジコット植物の広範な宿主病原体である A.tumefaciens である。 タメファシエンス には、腫瘍誘発(Ti)プラスミドが含まれている。TiプラスミドからのDNA(T-DNA)の転写は、細菌の病原性機械が活性化された後に植物細胞に移入する。これは、傷ついた植物細胞において、わずかに酸性環境19で放出される低分子量フェノール化合物および単糖体によって引き起こされ得る。病原性遺伝子は、主要な静脈によって定義された葉パネルへの アグロバクテリウム 懸濁液の浸潤後に活性化される。そして、葉パネル内の植物細胞を形質転換し、T-DNA領域に含まれるトランスジーンを発現させます。
アグロ感染は、植物細胞へのウイルスの転座を媒介する創傷接種 性アグロバクテリウムに基づいています。その後、ウイルスはアグ ロバクテリウムの不在下で、隣接する植物組織にさらに広がる。農菌感染のために、いくつかの植物ウイルスを使用することができます。RNAウイルスは、感染した植物の非常に高いレベルに増殖することができるので、遺伝子発現のための理想的なベクターです。植物RNAウイルスの中でも、 ポテトウイルス X(PVX)は、エフェロミクススクリーンに広く使用されています。挿入遺伝子の機能試験を容易にするために、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターおよびノパリン合成酵素ターミネーターによって横たわるPVXゲノムを含むバイナリベクターを 、A.トゥメファシエンス20のT-DNAにクローン化した。T-DNAが植物細胞に移された後、T-DNAに含まれるPVXゲノムは、35Sプロモーターから転写される。その後、ウイルス粒子は感染した植物に全身的に広がり、その結果、挿入された遺伝子の発現が生じる。この方法は 、アグロバクテリウム とPVXの両方に基づいて、PVXのアグロパレンス感染と呼ばれています。
ここでは、農浸潤とPVXの両方の農業感染アッセイの例を示します。宿主植物として、エフェトロミクスのアプローチが開拓され、成功した3,4を証明したポテト胚芽(ソラナムセクションペトータ)を使用しています。我々はまた、ソラナス植物14,21,22のモデル植物として有名なニコチアナベンタミアナを使用しています。
Protocol
1. 植物の成長と試験条件
- 18-22 °Cの温度範囲内で、自然光の体制の下で、または16時間/8時間の昼/夜体制で制御された温室または気候室で植物を成長させ、維持します。植物をより管理しやすくするために、腋窩枝を取り除きます。
- ジャガイモの場合は、ムラシゲ・スクーグ(MS)培地(20g/Lスクロース、ビタミン5g/L MS塩、8g/L寒天、pH 5.8)を含む無菌プラスチック瓶の中の体外プランレットを18°Cの気候室で制御された条件下で2週間維持し、その後、2週間の殺菌された土壌中のポットに移します。
2. アグロインフィルトレーション
- 植物材料:
ニコティアナベンタミアナのために、約4-5週の古い種子栽培植物を使用してください。ジャガイモの場合は、in vitroから4〜5週齢の移植を使用してください。浸潤のための若い、健康で完全に発達した葉を選択してください。 -
アグロバクテリウム 培養:
- YEB培地を事前に準備する(表1)。50 ml のチューブに 1 0 ml の YEB 培地を 1 μl アセトシリンギヨン (200 mM)、100 μl MES バッファー (2-(N モルフォリーノ)エタン スルホン酸、 1 M) と適切な抗生物質を加えます。所望の株のピペット20μlグリセロールストック(表2)(対象遺伝子を含む)をYEBに入す。このアッセイですべての アグロバクテリウム 株の培養を同時に開始する。28°Cで1~2日間、200rpm程度のOD600 に1~2日間振盪して細胞をインキュベートします。
- 3,000 x g で 10 分間遠心分離して細胞を収穫します。上清を注ぎ、作りたてのMMA培地(表3)でペレットを0.3のOD600 に再懸濁します。穏やかに渦細胞はそれらを再中断する。2つの細菌株のコインフィルトの場合、培養液を1:1の比率で混合する。
- 浸潤する前に1〜6時間室温でベンチに培養を残します。その間に、浸潤する植物と実験の日付にラベルを付けます。
- 浸潤：
1mlの無針注射器を使用して 、アグロバクテリウム 懸濁液に浸透させます。注意深くゆっくりとシリンジからサスペンションで葉パネルを注入します(健康と安全上の理由から、このプロセス中に目の保護を着用する必要があります)。各株に対して少なくとも3つの植物に浸透する。トリプライズとして機能する植物ごとに3つの葉を使用してください。
注:通常、1 ml の アグロバクテリウム 懸濁液は 、N. ベンタミアナの 3 つの植物に十分な場合があります。ジャガイモの場合、 ソラナム 種の葉は浸透することがより困難であるため、より多くの懸濁液が必要です。サスペンションの必要量は 、ソラナム 種に依存します。手袋を交換したり、浸潤の間にエタノールで手袋を殺菌したり、接種の翌日まで植物に水をやらないようにすることで、クロスコンタミネーションを避けてください。 - 採点：
細胞死表現型が明らかなとき、浸潤から約3日後に巨視的応答をスコア付けする(図1)。細胞死表現型が定量的である場合、与えられた基準を使用する(図2)。簡単に言えば、細胞死の巨視的スコアリングのスケールは、主に浸潤領域の細胞死率に依存する。細胞死の割合は、0%(症状なし)から100%(コンフルエント細胞死)までのスケールで描かれています。中間応答は、クロロシスなどの弱い応答から細胞死のレベルの増加まで多岐に及ぶ。必要に応じて、巨視的スコアリングは、現代の写真画像装置を使用して定量的に評価することもできる。
3. PVXの農業感染
- 植物材料:
ベンタミアナの場合は、2-3週齢の種子栽培植物を使用してください。ジャガイモの場合は、in vitroから2〜3週程度の移植を使用してください。大規模なテストのために、これらの植物は、アグロバクテリウム接種スポットの数を増やすために、より大きな葉を持っているように、わずかに古い(4-5週間)植物を使用してください。 -
アグロバクテリウム 培養:
- YEB培地を事前に準備してください。適切な抗生物質を補う3 ml YEBで10 mlのチューブを充填します。所望の株のピペット20μlグリセロールストック(表2)(対象遺伝子を含む)をYEBに入す。このアッセイですべての アグロバクテリウム 株の培養を同時に開始する。28°Cで1~2日間、200rpm程度のOD600 に1~2日間振盪して細胞をインキュベートします。
- 各 アグロバクテリウム 株の約300 μlのピペットをLB固体寒天培地プレートに広げ、適切な抗生物質を添加し、28°Cで細胞を1〜2日間培養します。
- 感染 症：
スパチュラを使用して、プレートに アグロバクテリウム 培養物を採取します。スパチュラの アグロバクテリウム 培養で木製のつまようじを浸し、葉を突き刺して大量の細菌を接種する。各株に対して少なくとも3つの植物を接種する。トリプライズとして機能する植物ごとに3つの葉を使用してください。各葉に、各株のための複数の接種部位を作る。 - 採点：
接種後約2週間で、巨視的な反応をスコア付けする(図3)。ハイスループット画面の場合は、接種場所ごとに定性的応答(はい/いいえ)を記録します。次に、応答サイトの割合を計算し、コントロールと比較します。
Representative Results
図1は、ジャガイモとN.ベンタミアナにおける7種類のエフェクター(E1-E7)を有するアグロインフィルトレーションの代表的な実験を示す。浸潤した約3日後に浸潤した葉パネルに細胞死が現れる。細胞死表現型の程度は、コントロールと比較する必要があります。 pBINplus-R3aおよびpK7WG2-AVR3aを含むAGL1(pVirG)23の混合物を陽性対照24,25として使用し 、AGL1(pVirG)を 陰性対照として使用した。図1Aおよび1Bは、それぞれ、アグロインフィルトレーションに非常に適したジャガイモ遺伝子型MaR8(マステンブロークR8)26およびN.ベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションの良い例を示す。葉パネルにコンフルエント細胞死は陽性対照で浸潤し、負のコントロールまたはpBINplus-R3aで細胞死反応は起こらない。MaR8では、AVR3a(E2)とAVR4(E3)の2つのエフェクターが細胞死を誘発し、他のエフェクター(E1およびE4-E7)は、N.ベンタミアナでは、どの試験されたエフェクタも細胞死応答を誘発しない。図1Cおよび1Dは、野生のジャガイモソラナムベルトオーティ483-1およびソラナム・リチェイ210-5におけるアグロインフィルトレーションの例を示しており、これは農浸浸法に適していない。S. berthaultii 483-1 では、葉の組織は、陰性コントロールおよびテストされたすべてのエフェクターに対する非特異的壊死を示す。S.レチェイ210-5では、浸潤した葉パネルは、陽性対照に対する非常に弱い細胞死応答を示す。
図2 は、アグロインフィルトレート されたアグロバクテリウムに対する応答を定量化するために使用できるスコア付けスケールの範囲を示しています。細胞死の割合は0-100%のスケールで描かれています。観察された表型は、マクロ的に目に見えない症状(0%)から、クロロシスを示す中間応答の範囲を通じておよび細胞死のレベルを増加させ、コンフルエント細胞死(100%)まで及ぶ。
図3 は、ジャガイモ中のPVXアグロ感染後の代表的な実験を示す。通常、拡大細胞死は、歯摘み接種の約2週間後に部位で見つけることができます。両図パネルに示すように、pGR106-CRN2(エフェクタークリンクラーCrn2を用いた陽性対照)を接種した歯ピックを接種した部位に細胞死の拡大が存在する、 これはP.出没遺伝子27から一般的な細胞死誘導遺伝子である。傷に対する軽微な応答とは別に、pGR106空(陰性対照)で接種された歯ピックの部位では、細胞死の拡大は記載されていない。 図3Aにおいて、ジャガイモの遺伝子型MaR3(マステンブロークR3)を表す、2つのpGR106-エフェクター(E1およびE2)は細胞死を誘発しなかった。 図3Bでは、野生の ソラナム・ワンカバンベンゼ 354-1におけるエフェクタースクリーニングの陽性結果が提示されている。細胞死応答は2つのpGR106エフェクター(E1-E3、エリシチンを表す)28に観察された。
図 1.ジャガイモおよびN.ベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションの例。植物は(A)ジャガイモの遺伝子型MaR8(マステンブロークR8)、(B)Nを含む。 ベンタミナ、 (C)ソラナム・ベルサーティ483-1 および(D)ソラナム・レヘイ210-5に、pBINplus-R3aおよびpK7WG2-AVR3a(陽性対照)を含むアグロバクテリウム株AGL1(pVirG)23の混合物で浸潤した、 7つのエフェクター(E1-E7)。ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 2.農浸潤応答の定量化写真は、0%(症状なし)から100%(コンフルエント細胞死)までの細胞死の代表的なスコアリングスケールを示しています。中間応答は、クロロシスなどの弱い応答から細胞死のレベルの増加まで多岐に及ぶ。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 3.ジャガイモ中のPVXの農業感染の例。ジャガイモの遺伝子型MaR3(マステンブロークR3)(A)およびソラナム・ワンカバンベンゼ354-1(B)pGR106-CRN2(陽性対照)、pGR106空(陰性対照)およびpGR106-E1-2(エフェクター)、またはpGR106-E1-E13ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
表 1.YEB培地
| 1 L | 蒸留されたH2O |
| 5 g | 蔗糖 |
| 5 g | 牛肉エキス |
| 5 g | 細菌学的ペプトン |
| 1 g | 酵母エキス |
| 2ml | MgSO4 (1 M) |
表 2.アグロインフィルトレーションおよびPVXアグロパチンス感染に使用されるベクターおよび株。複数のバイナリベクトルを使用できます。以下のリストのベクターは、候補遺伝子の高い発現を可能にし、私たちの手の中でうまくいった。我々は、N.ベンタミアナでアグロバクテリウム株GV3101(pMP90)29を使用することを好み、ヘルパープラスミドpVirG(pBBR1MCS-5.virGN54D)23ジャガイモ31に適したAGL130を見つける。追加の株は、N.ベンタミアナを含む様々なモデル植物上の他のグループで分析されているが、ジャガイモ32ではない。
GW: ゲートウェイバージョン36
表 3.MMA培地。
pH を 5.6 に調整します。
Discussion
農浸潤や農菌のような一過性のアッセイは、現代の分子植物病理研究に不可欠な効率的な方法です。いくつかの制限にもかかわらず、これらの方法は、プラントにおける効率的で堅牢な高スループット機能分析の需要を満たしています。
このアグロインフィルトレーションシステムは、植物種の範囲で広く使用されている機能アッセイである。アグロインフィルトレーションは、相互作用タンパク質の同時発現を伴う同じ細胞へのいくつかの遺伝子の送達を促進する。これは、R−AVR関係を再現する場合に、一致するR遺伝子を発現する株を有するAvr遺伝子を発現するアグロバクテリウム株をコインフィルトすることにより有利である。また、既知のR-AVR対に対して、そのようなコインフィルトは正の制御として使用することができる。このような制御を含む重要なのは、一部の植物遺伝子型において、応答を検出するための閾値を下回る変換効率が得られるためである。陰性コントロールを含む、例えば遺伝子挿入を伴わないベクターを含むアグロバクテリウム株は、ある種の植物遺伝子型がアグロバクテリウムに対する非特異的防御応答を上げるかどうかを判断することも不可欠である。この特徴は、ジャガイモの胚芽の特定の頻度で発生し、すべてのソラナム種は、このアグロバクテリウムベースの発現系に適しているわけではありません。一般的に、アグロインフィルトロートアッセイは、N.ベンタミアナおよびほとんどのジャガイモ遺伝子型で非常にうまく機能します。エフェクロミクスに加えて、遺伝子導入からのタンパク質の産生や植物細胞における共焦点顕微鏡によるタンパク質の局在化など、農浸浸法に関する様々な潜在的な用途があります。
PVXの農業感染は非常に敏感なスクリーニングシステムであり、典型的にはハイスループットのスクリーニングのためにより適している。 アグロバクテリウム は現在、局所的にしか存在しないため、PVXウイルスがトランスジーンのさらなる広がりを引き継ぐので、この細菌に対する非特異的な反応は今やあまり不安ではない。しかし、植物はPVXに対して耐性があり、または極度の抵抗性(ER)応答を取り付け、その場合は農菌感染法は適さない。PVXの農業感染方法のもう一つの制限は、目的の遺伝子の挿入サイズである。観察された表現型の応答は、創傷を取り巻く激しい黒壊死から接種場所付近のかすかな壊死までさまざまである。 N.ベンタミナ 種と ソラナム 種の両方で、PVXの農業感染は、農浸浸よりも敏感であると認識されている。
多様な試験された植物遺伝子型の遺伝的背景には、いくつかの制限がある(上記参照)ことを考慮に入れ、我々は一般的にPVXの農業感染および農浸濾過によって同様の結論を得る。これらの結果は、タンパク質浸潤29 およびELISA3などの他のアッセイで得られるのと同様にも同等である。両システムの長所と限界を考慮して、両方法を使用して互いを補完するか、独立した結果を確認することをお勧めします。
Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、ワーゲニンゲン大学基金(WUF)、中国大学院生奨学金協議会プログラム、NWO-VIDI助成金12378によって部分的に支援されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
| Incubator | Infors HT | Multitron II | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |
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