Summary
哺乳动物细胞表达生物发光细菌基因盒（
Abstract
已广泛采用哺乳动物细胞为基础的体外实验毒理学研究动物试验的替代品，但已经有限的，由于高金钱和时间成本的平行样品制备，必要由于破坏性的萤火虫荧光素酶的筛选方法， 。本视频介绍的利用自主生物发光的哺乳动物细胞中，不需要的萤光素基板破坏性此外，作为廉价且简便的方法监测感兴趣的化合物的细胞毒作用。哺乳动物细胞中稳定表达基因盒的完整细菌的生物发光（luxCDABEfrp）自主产生的光信号，而不增加一个昂贵的，并可能干扰的虫荧光素底物，由外部能量源，或破坏的示例是传统的激发峰在490nm处期间进行光学成像过程秒。这种独立于外界刺激保持仅在细胞的生物发光反应的负担，这意味着，所得到的信号在代谢活跃期间只检测到。这一特性使得该勒克斯 -表达细胞系生物发光生产变化的一个很好的候选人使用作为biosentinel对细胞毒素的作用，因为是表示对细胞生长和代谢的不利影响。同样地，自主性和缺乏所需的样本的破坏，允许重复毒物接触的整个期间内对同一样品进行实时成像，可以使用现有的成像设备，在多个样品以自动化的方式进行。
Introduction
在美国，药品和其他产品用于人类消费需要大量的评估，才供消费者使用的由美国食品和药物管理局批准。为执行此测试的财政负担被放置在显影剂1，大大提高了新化合物的开发成本，因此，转化为对消费者的成本增加。虽然传统的多筛查已利用受试动物作为代表人类宿主，这已被证明是大的财务负担，一个估计$ 2.8十亿每年用于ADME / Tox的（吸收，分布，代谢，排泄，和毒性）筛查，越来越多的证据表明，动物模型不能可靠地预测人类的毒性反应。因此， 在体外人体细胞培养为基础的测试已经获得了普及，在过去二十年来，由于其相对较低的成本，更高的吞吐量，更好地代表人类的生物利用度和毒理学4。电流细胞培养为基础的毒性筛选方法采用各种端点，如ATP水平的测量，提供细胞质内源性酶的活性筛选，探测细胞膜的完整性，或跟踪线粒体活性的水平，来评估细胞的活力5 ，6。但是，无论所选择的端点，这些方法都需要在试样破坏之前，都可以测量，因此只在一个单一的时间点产生数据。其结果是，大量的样品需要是平行的基本毒理动力学研究制备和处理，再次加入到所需的新化合物的开发成本和劳动力。另外，测定使用荧光素酶的分泌，如Gaussia荧光素酶7，8 Vargula荧光素酶和荧光素酶的Metridia 9已经开发了，不再需要进行细胞裂解，并需要一小部分的端点测量的介质，但是，这些仍然有限，以在预定的时间点取样，还需要加入外源的光活化基板。
为了避免损害所需样品的破坏，以及消除基板的成本，已设计的人细胞系表达的完整细菌的生物发光（ 勒克司 ）基因盒（luxCDABEfrp）使活细胞的连续监测是类似于基于荧光染料的活细胞成像，但没有额外的光子激活和微观调查程序的。该细胞系能够组成型生产为连续的，直接检测的光信号，而不需要外部的刺激，从而避免破坏样品。机械，这些细胞所产生的生物发光信号，导致s时的发光酶形成的荧光素酶催化氧化的长链脂肪酸的醛（的的基因产物luxCDE使用内源性物质的合成和再生）的存在下还原核黄素磷酸（FMNH 2，这是由玻璃钢基因从FMN再循环产品）和分子氧10。 勒克斯磁带盒在宿主细胞中表达，因此，使光被制造，以及细胞破坏或外源性底物除了没有检测到。同样地，将所得的生物发光信号之间的相互作用的勒克司的基因和内源性提供FMN，和O 2 cosubstrates的，维护的环境中，可以支持的转换的FMN FMNH 2的要求，确保只能检测从活，代谢活跃的细胞。
这些要求先前已被利用来证明LUX-BASED生物发光输出密切相关蜂窝人口规模11和有毒的化合物暴露损害autobioluminescent的生产在时尚的剂量-反应12。这里，我们使用一个以前的特点autobioluminescent的人类胚胎肾（HEK293）细胞系11演示自动化毒理学的筛选与已知的DNA损伤活性作为一个代表性的例子来验证的应用的autobioluminescent哺乳动物细胞毒性试验的博莱霉素族抗生素。
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Protocol
1。细胞的制备
- 小瓶从液体氮冷冻库存的生物发光的HEK293细胞的恢复和增长的Dulbecco改进的鹰的培养基（DMEM）中添加10％胎牛血清，0.01 mM的不必要的氨基酸，1X抗生素，抗真菌剂，和0.01 mM的钠丙酮酸用T在75组织培养烧瓶中，在37℃和5％CO 2。
注意：媒体及补充元件会根据细胞系，并因此，应该相应地选择。 - 刷新中期每2-3天，直到达到约80％汇合。
注：所需的细胞的量，将根据实验设计。如果需要，可以通过以下方式获得更多的细胞的传代培养。 - 收获细胞进行测试。
- 移除介质洗涤细胞，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻摇动烧瓶中，然后弃去使用了PBS。
- 加入胰蛋白酶在37℃孵育2分钟，或直至细胞从烧瓶中脱离。
- 收集在PBS分离的细胞，并将它们传送到一个干净的离心管。
注意：如果用于非贴壁细胞系，通过离心分离细胞，并用PBS洗一次。
- 确定总的细胞计数，使用血细胞计数器或其他细胞计数系统。
- 离心细胞悬浮液在300×g离心5分钟。弃上清，悬浮细胞在新鲜，预热介质。
- 种子细胞成单独的一个不透明的多孔板的孔中的数目相等。在这个例子中，板5×10 5细胞在1ml体积成一个黑色24孔培养板的各孔中。板等体积的培养基中一式三份井作为阴性对照。
注意：接种于各孔中的细胞数目是灵活的，可优化的个别实验。对于每个生物发光的细胞系，实验确定细胞数和biolumi之间的关系消逝的输出，以及最小可检测细胞计数之前的任何毒性试验。要做到这一点，在很宽的范围的人口规模（例如，1×10 3〜1×10 6个细胞）在标准化的成像条件下测量生物发光。 - 处理细胞与测试化合物（次）（如下文所述）。
2。化学制剂
- 准备作为浓缩原液被测试的化学品。在这个例子中，使用一个100毫克/毫升贮备液的博莱霉素族抗生素。
注意：为了尽量减少基于车辆的潜在毒性作用，尤其是当使用有机溶剂的化学除了作为车辆，它是建议的库存浓度所需的应用程序后的浓度至少为1,000倍。 - 加入准备好的化学股票直接的细胞。在这个例子中，剂量抗生素的利息，终浓度分别为100，200，300，和400微克/毫升的三折扇井。保留三口井的未经处理的细胞作为对照。
注意：应选择的目标化学品的最终浓度，根据具体的实验目标。广泛的浓度通常是测试，获得全方位的毒副作用。
3。成像和数据分析
- 紧随化学此外，适当的仪表板在成像室，图像采集和生物发光测量。
- 每隔15分钟测量生物发光在24小时内用10分钟积分时间为每个阅读。
注意：在这个例子中使用的积分时间是在每个板的基础上，可以调整用于测量每个孔的基础上使用等光度计给出。也可以调整积分时间可以根据所选择的生物发光细胞系。由于生物发光自主生产的无细胞的破坏或任何外部的刺激，阅读的INGS可以采取任何所需的时间点，以达到具体的实验目标。 - 定量的生物发光强度从每口井通过吞吐量的区域感兴趣的使用兼容的软件。无论是作为显示输出的光的总光通量（光子/秒）或每个样品的平均辐射（光子/秒/厘米2 / steridian）。
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Representative Results
在这项研究中，的动态autobioluminescent HEK293细胞抗生素暴露（ 图1），在24小时内连续监测。这种抗生素的毒性作用，这是一种已知的杀死活细胞通过结合和裂解DNA 13的博莱霉素家族的成员，与未经处理的细胞相比，通过减少在生物发光生产，它可以直接通过伪彩色图像可视化进行了论证（ 图2）。这些细胞中，在不同的处理条件下，允许样品的反复平行筛选的的性质autobioluminescent的不同浓度进行比较允许在任何给定的时间点，方便的剂量 - 反应分析。例如，从细胞中产生的生物发光后15小时，18小时，20小时的处理，绘制在图3中示出，增加抗生素治疗雷苏尔的对化学物的浓度的中，生物发光的减少生产中的剂量 - 反应方式。
图1。暴露于不同浓度的博莱霉素族抗生素的生物发光动力学响应 HEK293细胞组成型生物发光， 化学品接触。连续跟踪 。生物发光的产量在24小时内曝光（技术一式三份代表性的数据在一个平板上，平均值±标准误差）（转载自14）监控。
图2。伪彩色图像处理的细胞。
图3。生物发光输出后15小时，18小时和20小时的暴露的剂量-反应的化学品接触。表明增加抗生素治疗中的剂量-反应方式的光生产的减少（由于技术上的一式三份的有代表性的数据，在一个平板上，平均值±标准误差）。 R 2值进行线性回归计算。
比较表1中。代表表现出毒性的屏幕上使用要么autobioluminescent（ 勒克斯 ）的人类细胞或传统的萤火虫荧光素酶（luc的 ）为基础的检测中的96 -孔板的格式。
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Discussion
这种方法演示了如何使用自主生物发光的哺乳动物细胞， 在体外细胞毒性筛选试验，使活细胞进行连续监测，对他们的一生。此协议是灵活的，并且可以被修改，以满足特定的实验条件下，根据需要。例如，这里提出的实验适合用于跟踪急性毒性作用，但可适应评估通过反复成像在增加的时间间隔（ 例如每24个小时），并维持在标准培养条件下的细胞之间的缓慢作用的或长期的影响读数。此外，基于生物发光的细胞系，可以调整积分时间。可以执行不同的积分时间成像的初步实验，以确定最佳的读出窗。此示例中使用的10分钟集成选择突出显示的动态范围，在所有疗程生物发光生产吨的条件下，但是更短的读码框可以根据不同的应用应用。同样地，尽管在这个例子中，一个24孔培养板用于演示，96 - 或384 - 孔板可以被取代的更高的吞吐量的应用。虽然此处所示的有代表性的结果证明技术的单盘上的一式三份，重要的是要注意，独立检测在不同的平板上，建立治疗水平之间的统计学显着性测试时的化合物还应该执行。此外，因为此法可用于与不同的检测灵敏度在各种仪器适于建议应确定每一个仪表的基础上，可接受的信号与噪声和信号与背景的比值。
这里描述15根据成像条件的最小可检测在24孔板中的细胞数约为1.5×10 4细胞，这是预先确定的。然而，重要的是要注意，进行可靠的检测所需的最少数量的细胞的变化以及尺寸，并使用更小的井的数量减少检测所需的细胞，通过增加每单位面积的生物发光细胞的数量。因此，强烈建议，生物发光输出和人口规模之间的关系来确定所需的成像条件下筛选前。另外，光电倍增管件为主的板读数器也可以被用于数据采集的IVIS Lumina的成像系统代替，但在获得伪彩色图像的损害。不管所采用的成像仪，应使用一个不透明的板，以减少信号损失和/或由于光子穿过板的相邻井的生物发光的污染。
其他常用的细胞培养为基础的方法相比，这种方法的优点，数据采集可以performed的样品破坏或衬底此外，因为需要一个完全自动化的方式被消除。它还允许在相同的细胞群时的动态效果的连续跟踪时，在一个长时间的曝光，它提供了一个增强的分辨率的毒理动力学没有金钱或时间是必要的成本，同时增加使用细胞裂解要求的方法（ 表1）。然而，这种方法的一个重要的限制是该单元格中的特定类型的测试将要求勒克斯磁带盒的稳定转染成不同的细胞类型还为了产生一个autobioluminescent的表型进行筛选。虽然这仅需要执行一次，随后可以被存储，因为细胞在液氮中以供将来使用，在转染过程是一个可能很费时的努力。
尽管这个前提下，该协议概述这里是简单和廉价，需要Ş最小的手从实验室工作人员的工作，并不需要任何额外的试剂，生成的数据，可以直接用于毒理学解释。出于这些原因，我们得出结论，autobioluminescent的哺乳动物细胞系，可作为一种高通量检测快速的初步筛选大量的候选人选择的化合物，需要更详细的下游评价。
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Disclosures
490生物技术公司的创始人和所有者，SA瑞普DM关闭和GS Sayler
Acknowledgments
这些研究工作是由美国国家科学基金会科化工，生物工程，环保，交通（CBET）系统的奖号码下CBET-0853780 CBET-1159344和美国国立卫生研究院，美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS的支持）下奖号1R43ES022567-01，美国国家癌症研究所，癌症成像计划在奖号CA127745-01。从美国陆军国防大学研究仪器计划获得IVIS Lumina的仪器，用于这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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