Summary
Pattedyrceller udtrykker bakterielle bioluminescens genkassette (
Abstract
Mammalian cellebaserede in vitro assays er blevet bredt anvendt som alternativer til dyreforsøg for toksikologiske undersøgelser, men har været begrænset på grund af de høje monetære og tid omkostninger til parallelle prøveforberedelse, som er nødvendiggjort som følge af den destruktive karakter af ildflueluciferase-baserede screeningsmetoder . Denne video beskriver anvendelsen af autonomt bioluminescerende pattedyrceller, som ikke kræver den destruktive tilsætning af et luciferin substrat, som en billig og facile fremgangsmåde til overvågning af de cytotoksiske virkninger af en forbindelse af interesse. Pattedyrsceller stabilt udtrykker det fulde bakterielle bioluminescens (luxCDABEfrp) genkassette autonomt frembringe et optisk signal, som topper ved 490 nm uden tilsætning af et dyrt og potentielt interfererende luciferin substrat, magnetisering af en ekstern energikilde, eller destruktion af prøven, der er traditionelt udføres under optisk imagografiprocedurens. Denne uafhængighed af ekstern stimulation lægger byrden for at opretholde bioluminescensreaktion udelukkende på den celle, hvilket betyder, at den resulterende signal kun registreres under aktiv metabolisme. Denne egenskab gør lux-udtrykkende cellelinie en glimrende kandidat til anvendelse som et biosentinel mod cytotoksiske virkninger, fordi ændringer i bioluminescerende produktion er tegn på skadelige virkninger på cellulær vækst og metabolisme. Ligeledes den autonome karakter og mangel på nødvendige prøve ødelæggelse tillader gentagne billeddannelse af den samme prøve i realtid i hele giftstoffet eksponering og kan udføres på tværs af flere prøver ved anvendelse af eksisterende imaging udstyr på en automatiseret måde.
Introduction
I USA kræver lægemidler og andre produkter til konsum omfattende vurdering, før de er godkendt til privat brug af Food and Drug Administration. Den finansielle byrde for at udføre denne test er placeret på udvikleren 1, som i væsentlig grad forøger omkostningerne til nye sammensatte udvikling og derfor udslag i en øget omkostning for forbrugerne. Mens traditionelt meget af denne screening har udnyttet dyreindivider at fungere som stedfortrædere for menneskelige værter, har det vist sig at være en stor økonomisk byrde, med en anslået 2800 millioner dollars bruges årligt på ADME / Tox (adsorption, distribution, metabolisme, udskillelse, og giftighed ) screening alene 2 og montering tyder på, at dyremodeller ikke pålideligt kan forudsige humantoksikologiske reaktioner 3.. Derfor har in vitro human cellekultur-baseret testning vundet popularitet i de seneste to årtier på grund af dens relativt lavereomkostninger, højere gennemløb og bedre repræsentation af menneskelig biotilgængelighed og toksikologi 4.. Aktuelle celle kultur-baserede toksicitet screeningsmetoder anvender forskellige endepunkter, såsom målingen af ATP-niveauer, screening aktiviteten af endogent tilgængelige cytoplasmiske enzymer, sondering integritet af cellemembranen, eller sporing niveauet af mitokondrie aktivitet at vurdere cellulær levedygtighed 5 , 6.. Men uanset den valgte slutpunkt, disse metoder kræver alle destruktion af prøven før målinger kan foretages, således kun producerer data på et enkelt tidspunkt. Som et resultat, skal et stort antal prøver til at være forberedt og behandles parallelt for basale toksikologiske kinetiske undersøgelser, igen tilføje til omkostninger og arbejdskraft er nødvendig for nye stof udvikling. Alternativt assays under anvendelse udskilles luciferase såsom Gaussia luciferase 7, Vargula luciferase 8, og Metridia luciferase 9er blevet udviklet, at eliminere behovet for cellelyse og kræver en brøkdel af medierne til endepunktsmåling, dog er disse stadig begrænset til prøveudtagning på forudbestemte tidspunkter og også kræver tilsætning af exogene lys-aktiverende substrater.
For at undgå skade for nødvendige prøve ødelæggelse samt at undgå omkostningerne til substrater, har en human cellelinie blevet manipuleret der udtrykker fuld bakterielle bioluminescens (lux)-gen kassette (luxCDABEfrp) for at muliggøre kontinuerlig overvågning af levende celler, der ligner for fluorescerende-dye-baseret live-cell imaging, men uden de ekstra foton-aktiverende og mikroskopiske undersøgelsesprocedurer. Denne cellelinie er i stand til konstitutivt at producere et optisk signal til kontinuerlig, direkte påvisning uden behov for ekstern stimulering, hvorved man undgår ødelæggelse af prøven. Mekanistisk bioluminescerende signal, der genereres fra disse celler resulteres, når luxAB dannede luciferaseenzymet katalyserer oxidationen af en lang kæde fedtsyrer aldehyd (syntetiseret og regenereres ved luxCDE genprodukter anvender endogene substrater) i nærværelse af reduceret riboflavinphosphat (FMNH 2, som recirkuleres fra FMN ved FRP-genet produkt) og molekylært oxygen 10. Ekspression af lux kassetten i værtscellen gør det derfor muligt let at blive produceret og detekteres uden cellulær destruktion eller exogen substrat tilsætning. Tilsvarende samspillet mellem de lux gener og endogent tilgængelige FMN, og O 2 cosubstrater, og kravet om opretholdelse af et miljø, der kan understøtte omdannelsen af FMN til FMNH 2, sikrer, at den resulterende bioluminiscerende signal kun kan opdages fra levende , metabolsk aktive celler.
Disse krav er tidligere blevet udnyttet til at påvise, at lux-based bioluminescerende output korrelerer stærkt med cellulære befolkningens størrelse 11, og at toksisk forbindelse eksponering svækker autobioluminescent produktion på en dosis-respons fashion 12. Her bruger vi en hidtil karakteriseret autobioluminescent humane embryonale nyre (HEK293) cellelinje 11 at demonstrere automatiserede toksikologiske screening af et antibiotikum af bleomycin familie med kendte DNA-ødelæggende aktivitet som et repræsentativt eksempel at validere anvendelsen af autobioluminescent pattedyrceller til toksicitetstestning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Cell Preparation
- Inddrive et hætteglas med selvlysende HEK293 celler fra flydende nitrogen frosset lager og dyrke dem i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 0.01 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1x antibiotikum-antimykotikum og 0,01 mM natriumpyruvat i en T 75 vævsdyrkningskolbe ved 37 ° C og 5% CO2.
Note: Medierne og supplerende komponenter vil variere baseret på cellelinjer, og derfor bør vælges i overensstemmelse hermed. - Refresh medium hver 2-3 dage, indtil man kommer ~ 80% sammenløbet.
Bemærk: Mængden af krævede celler vil blive baseret på det eksperimentelle design. Hvis det er nødvendigt, kan flere celler opnås ved subkultur. - Harvest celler til test.
- Fjern mediet og vaskes cellerne med phosphatpufret saltvand (PBS) ved forsigtig omrystning af kolben og derefter kassere den brugte PBS.
- Tilføj trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 2 minutter,eller indtil cellerne er frigjort fra kolben.
- Saml de løsnede celler i PBS og overføre dem til et rent centrifugerør.
Bemærk: Hvis adhærerende cellelinier anvendes, separate celler ved centrifugering og vaskes en gang med PBS.
- Bestem den totale celletælling ved hjælp af et hæmacytometer eller anden celletælling system.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 300 xg i 5 min. Supernatanten fjernes, og cellerne i frisk, forvarmet medium.
- Seed lige antal celler i individuelle brønde i en uigennemsigtig multi-brønds plade. I dette eksempel pladen 5 x 10 5 celler i et 1 ml volumen i hver brønd i en sort 24-brønds plade. Plade et tilsvarende volumen af medium i tredobbelte brønde til at fungere som den negative kontrol.
Bemærk: Antallet af celler udpladet i hver brønd er fleksibel og kan optimeres til de enkelte forsøg. For hver bioluminescerende cellelinie bestemme eksperimentelt forholdet mellem celleantal og bioluminescent udgang, samt den minimale påviselige celletal før toksicitetsproever. For at gøre dette, måle bioluminescens på tværs af en bred vifte af bestandsstørrelser (for eksempel 1 x Oktober 03-01 x 10 6 celler) under standardiserede billeddiagnostiske forhold. - Behandle celler med test forbindelse (r) som beskrevet nedenfor.
2.. Kemisk Forberedelse
- Forbered kemikalie der testes som en koncentreret stamopløsning. I dette eksempel bruger en 100 mg / ml stamopløsning af et antibiotikum af bleomycin familien.
Bemærk: For at minimere potentielle køretøj-baserede toksiske effekter, især hvis et organisk opløsningsmiddel anvendes som et middel til kemisk Desuden anbefales det, at bestanden koncentrationen være mindst 1.000 gange den ønskede påføring efter koncentration. - Tilsæt den forberedte kemisk lager direkte til cellerne. I dette eksempel dosis antibiotikum af interesse ved slutkoncentrationer på 100, 200, 300 og 400 ug / ml i triplicate brønde. Efterlad tre brønde af celler ubehandlede som kontroller.
Note: Den endelige koncentration af målet kemikalie bør vælges baseret på specifikke eksperimentelle mål. En bred vifte af koncentrationer normalt testet for at opnå et fuldt spektrum af de toksiske virkninger.
3.. Imaging og Data Analysis
- Umiddelbart efter kemisk desuden placere pladen i imaging kammer egnet instrument til billedet erhvervelse og bioluminescence måling.
- Foranstaltning bioluminescens hver 15 min i løbet af en 24 timers periode ved hjælp af en 10 min integrationstiden for hver aflæsning.
Bemærk: Integrationen tid, der anvendes i dette eksempel er på en per-plade basis og kan justeres til måling på en per-godt grundlag ved hjælp af andre luminometre af valg. Integrationen tid kan også justeres baseret på den valgte bioluminiscerende cellelinje. Fordi bioluminescence produceres selvstændigt uden celledestruktion eller en ekstern stimulation, læseheder kan tages på ethvert ønsket tidspunkt til at opfylde særlige eksperimentelle mål. - Kvantificerer bioluminescerende intensitet fra hver brønd ved at identificere et område af interesse ved hjælp kompatibel software. Vise lyseffekten enten som det samlede flux (fotoner / sekund), eller den gennemsnitlige radians (fotoner / sekund / cm 2 / steridian) for hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse blev dynamikken i autobioluminescent HEK293 celler overvåges kontinuerligt over en 24 timers periode som reaktion på antibiotika eksponering (figur 1). De toksiske virkninger af dette antibiotikum, som er et medlem af bleomycin familien kendt for at dræbe levende celler ved at binde til og spaltning af DNA 13 blev påvist via en nedsættelse bioluminescerende produktion i forhold til ubehandlede celler, der kan være direkte visualiseres gennem pseudo billeder (Figur 2). Den autobioluminescent karakter af disse celler, som tillod gentagne parallelle screening af prøver under varierende behandlingsbetingelser, tilladt for sammenligning af forskellige koncentrationer på ethvert givet tidspunkt for nem dosis-respons analyse. For eksempel producerede bioluminescens fra celler efter 15 timer, 18 timer og 20 timer af behandlingen blev plottet mod kemiske koncentrationer i figur 3, viser, at stigende antibiotisk behandling resulTed i en reduktion af bioluminescerende produktion i en dosis-respons måde.
Figur 1. Løbende overvågning af bioluminescerende dynamikken i respons på kemisk eksponering. Konstitutivt bioluminescerende HEK293 celler blev udsat for forskellige koncentrationer af et antibiotikum af bleomycin familien. Bioluminescerende produktion blev fulgt over en 24 timers periode med eksponering (repræsentative data for tekniske tre eksemplarer på én plade, middelværdi ± standardafvigelse) (genoptryk fra 14).
Figur 2. Pseudo billeder af behandlede celler.
Figur 3. Dosis-respons kemisk eksponering. Bioluminescerende produktion efter 15 timer, 18 timer og 20 timer for eksponering viste, at øget antibiotisk behandling resulterede i en reduktion af lys produktion på en dosis-respons måde (repræsentative data for tekniske tre eksemplarer på én plade, middelværdi ± standardafvigelse). R2 er beregnet til lineær regression.
Tabel 1.. Repræsentant sammenligning afdemonstreret toksicitet skærmen ved hjælp enten autobioluminescent (lux-baseret) humane celler eller en traditionel ildflueluciferase (luc)-baseret assay i en 96-brønds plade format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode demonstrerer brugen af autonomt bioluminescerende pattedyrceller som en in vitro cytotoksicitet screeningsassay, der tillader levende celler, der skal overvåges kontinuerligt i løbet af deres levetid. Denne protokol er fleksibel og kan modificeres til at rumme særlige eksperimentelle betingelser som krævet. For eksempel præsenterede eksperimentet her er egnet til sporing akutte toksiske effekter, men kan tilpasses til at vurdere langsomt virkende eller langtidsvirkninger ved gentagne billeddannelse ved forhøjede tidsintervaller (dvs. hver 24 timer) og opretholdelse af cellerne under standardbetingelser inkubationsbetingelser mellem aflæsninger. Desuden kan integration tid justeres på basis af den bioluminescerende cellelinie. En indledende eksperiment af billeddannelse med forskellige integrationstider kan udføres for at bestemme den optimale læsning vinduet. 10 min integration anvendt i dette eksempel blev valgt for at fremhæve det dynamiske område af bioluminescerende produktion på tværs af alle treatment forhold, men en kortere læseramme kan anvendes afhængigt af anvendelsen. Ligeledes, mens en 24-brøndplade anvendes til demonstration i dette eksempel, 96 - kan eller 384-brønds plader erstattes højere gennemløb applikationer. Selvom de repræsentative resultater vist her demonstrere tekniske triplikater på en enkelt plade, er det vigtigt at bemærke, at uafhængige assays på forskellige plader skal udføres for at etablere statistisk signifikans mellem behandlingsgrupper niveauer ved test af en forbindelse af interesse. Endvidere, fordi denne analyse kan tilpasses til brug i en bred vifte af instrumenter med varierende afsløring følsomheder, anbefales det, at acceptable signal-støj-og signal-baggrund nøgletal bør fastlægges på en per-instrument basis.
Det blev tidligere fastslået, at den minimale påviselige celle nummer i en 24-brønds plade var cirka 1,5 x 10 4 celler under de billeddannende beskrevne betingelser her 15.Men det er vigtigt at bemærke, at det minimale antal celler, der kræves for pålidelig detektering varierer med godt størrelse, og at anvendelsen af mindre brønde reducerer antallet af celler, der kræves til påvisning ved at øge antallet af bioluminescerende celler per arealenhed. Derfor anbefales det kraftigt, at forholdet mellem bioluminiscerende output og befolkningens størrelse bestemmes under de ønskede billeddiagnostiske betingelser forud for screening. Desuden kan et fotomultiplikatorrør-baserede pladelæser også anvendes til dataopsamling i stedet for IVIS Lumina billedbehandlingssystem, men på bekostning af opnåelse pseudo billeder. Uanset hvilken billeddannelse anvendte instrument, en uigennemsigtig plade anvendes til at minimere signaltab og / eller bioluminescerende kontaminering af tilstødende brønde grund fotoner gennemkører pladen.
Sammenlignet med andre almindeligt anvendte cellekultur tilgange giver denne metode den fordel, at datafangst kan performed i en fuldt automatiseret vis, da behovet for prøven destruktion eller substrat tilsætning elimineres. Det giver også mulighed for løbende overvågning af dynamiske effekter på den samme celle population over en længere periode for udsættelse, hvilket giver en forbedret opløsning på toksikologiske kinetik uden den samtidige stigning i monetære eller tid omkostninger, der er nødvendiggjort ved brug cellelysering-kræver metoder ( Tabel 1). Men en vigtig begrænsning ved denne metode er, at celletype-specifik test vil kræve stabil transfektion af lux kassetten i hver celletype af interesse med henblik på at generere en autobioluminescent fænotype til screening. Selvom dette behov kun udføres én gang, da cellerne efterfølgende kan opbevares i flydende nitrogen til fremtidig brug, transfektion procedure er et potentielt tidskrævende indsats.
På trods af denne forudsætning, skitserede protokollen her er enkel og billig, krævers minimal hands-on arbejde fra laboratoriepersonale, ikke kræver nogen yderligere reagenser, og genererer data, som kan anvendes direkte til toksikologisk fortolkning. Af disse grunde, konkluderer vi, autobioluminescent mammale cellelinier kan anvendes som en high-throughput assay for hurtig indledende screening af et stort antal kandidater til at vælge forbindelser, der kræver mere detaljeret nedstrøms evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DM Close, SA Ripp og GS Sayler er stiftere og ejere af 490 BioTech, Inc.
Acknowledgments
Denne forskningsindsats er blevet støttet af National Science Foundation Division of Chemical, Bioengineering, Miljø og Transport (CBET) Systemer under award numre CBET-0.853.780 og CBET-1.159.344 og National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) under award nummer 1R43ES022567-01, og National Cancer Institute, Cancer Imaging Program under award nummer CA127745-01. Den IVIS Lumina instrument i dette arbejde er indhentet fra den amerikanske hær Defense University Research Instrumentering Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
