Summary
Zoogdierlijke cellen die het bacteriële bioluminescentie gencassette (
Abstract
Zoogdiercel gebaseerde in vitro assays zijn alom toegepast als alternatieven voor dierproeven voor toxicologische studies, maar zijn beperkt door de hoge monetaire en tijd kosten parallelle monstervoorbereiding die noodzakelijk vanwege het destructieve karakter van vuurvlieg luciferase gebaseerde screeningswerkwijzen . Deze video beschrijft het gebruik van autonoom bioluminescent zoogdiercellen, die niet van de destructieve toevoeging van luciferine substraat als een goedkope en gemakkelijke werkwijze voor het bewaken van de cytotoxische effecten van een verbinding van interesse. Zoogdiercellen stabiel tot expressie volledige bacteriële bioluminescentie (luxCDABEfrp) gencassette autonoom produceren van een optisch signaal dat pieken bij 490 nm zonder toevoeging van een dure en mogelijk storende luciferine substraat excitatie door een externe energiebron, of vernietiging van het monster die traditioneel uitgevoerd bij optische beeldopnames. Deze onafhankelijkheid van externe stimulatie legt de last voor het handhaven van de bioluminescente reactie op de enkele cel, hetgeen betekent dat het resulterende signaal alleen wordt gedetecteerd tijdens actieve stofwisseling. Deze eigenschap maakt het lux-expressie cellijn een uitstekende kandidaat voor gebruik als biosentinel tegen cytotoxische effecten omdat veranderingen in bioluminescent productie wijzen op negatieve effecten op celgroei en metabolisme. Ook de autonome karakter en het ontbreken van de vereiste monster vernietiging toelaat herhaalde beeldvorming van hetzelfde monster in real-time gedurende de periode van blootstelling toxisch en kan over meerdere monsters met behulp van bestaande beeldvormende apparatuur op een geautomatiseerde manier worden uitgevoerd.
Introduction
In de VS, geneesmiddelen en andere producten voor menselijke consumptie bestemde vereisen uitgebreide evaluatie voordat ze worden goedgekeurd voor gebruik door de consument door de Food and Drug Administration. De financiële last voor het uitvoeren van deze tests is bovenaan de ontwikkelaar 1, die de kosten van de nieuwe compound ontwikkeling en dus aanzienlijk meer vertaalt in een hogere kosten voor de consument. Terwijl traditioneel veel van deze screening heeft proefdieren gebruikt om te fungeren als proxy's voor de menselijke gastheren, heeft dit bewezen een grote financiële last te zijn, met een geschatte $ 2800000000 jaarlijks besteed aan ADME / Tox (adsorptie, distributie, metabolisme, excretie en toxiciteit ) screening alleen 2 en steeds meer bewijs suggereert dat diermodellen niet betrouwbaar kunnen voorspellen humaantoxicologische reacties 3. Daarom is in vitro humane celkweek-based testing heeft aan populariteit gewonnen in de afgelopen twee decennia vanwege de relatief lagerekosten, hogere doorvoer en betere vertegenwoordiging van menselijke biologische beschikbaarheid en toxicologie 4. Voor celcultuur-toxiciteitstests screeningmethoden verschillende eindpunten, zoals het meten van ATP, het screenen van de activiteit van endogeen beschikbaar cytoplasmatische enzymen, sonderen van de integriteit van het celmembraan, of het bijhouden van het niveau van mitochondriale activiteit, cellulaire viabiliteit 5 , 6. Ongeacht het gekozen eindpunt deze werkwijzen vereisen alle de vernietiging van het monster voor metingen kunnen worden verricht, zodat enige producerende data op een tijdstip. Als gevolg hiervan, grote aantallen monsters moeten worden voorbereid en behandeld in parallel voor basis toxicologische kinetiek studies, opnieuw toe te voegen aan de kosten en de arbeid die nodig is voor de nieuwe compound ontwikkeling. Als alternatief testen met behulp van luciferase uitgescheiden zoals Gaussia luciferase 7, Vargula luciferase 8, en Metridia luciferase 9ontwikkeld die de behoefte aan cellysis elimineren en vereisen een fractie van de media eindpunt meting, maar deze zijn nog steeds beperkt tot bemonstering op vooraf bepaalde punten en ook de toevoeging van exogene substraten activerende licht vereisen.
Ten nadele van vereiste monster vernietiging en de kosten van substraten elimineren vermijden is een humane cellijn gemanipuleerd dat drukt de volledige bacteriële bioluminescentie (lux) gen cassette (luxCDABEfrp) om voor continue bewaking van levende cellen die vergelijkbaar aan fluorescente kleurstof-gebaseerde live cell imaging, maar zonder de extra foton-activerende en microscopisch onderzoek procedures. Deze cellijn kan constitutief produceren van een optisch signaal voor continue, directe detectie zonder de noodzaak van externe stimulatie, waardoor vernietiging van het monster te voorkomen. Mechanistisch, de lichtgevende signaal gegenereerd uit deze cellen leidens wanneer de luxAB gevormde luciferase-enzym katalyseert de oxidatie van een langketenige aldehyde (gesynthetiseerd en geregenereerd door de luxCDE genproducten met endogene substraten) in de aanwezigheid van verlaagde riboflavine fosfaat (FMNH 2, die gerecycleerd uit FMN de frp gen product) en moleculaire zuurstof 10. Expressie van de lux-cassette in de gastheercel kan ook licht te produceren en gedetecteerd zonder cellulaire vernietiging of exogeen substraatadditie. Ook de interactie tussen de lux genen en endogeen beschikbare FMN en O2 cosubstrates, en het vereiste van behoud van een omgeving die de omzetting van FMN tot FMNH 2 kan ondersteunen, zodat de resulterende bioluminescente signaal alleen worden waargenomen levende , metabool actieve cellen.
Deze eisen zijn eerder misbruikt om aan te tonen dat de lux-based bioluminescerende uitgang sterk correleert met cellulaire bevolking maat 11 en dat toxische verbinding blootstelling schaadt autobioluminescent productie in een dosis-response mode 12. Hier gebruiken we een eerder gekarakteriseerde autobioluminescent menselijke embryonale niercellen (HEK293) cellijn 11 de automatische toxicologische screening van antibiotica van de bleomycine familie met bekende DNA beschadigende activiteit als een representatief voorbeeld van de toepassing van autobioluminescent zoogdiercellen toxiciteit valideren tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Preparation
- Haal een flacon bioluminescent HEK293 cellen van vloeibare stikstof ingevroren voorraad en ze groeien in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 0,01 mM niet-essentiële aminozuren, 1x antibioticum-antimycoticum en 0,01 mM natrium pyruvaat in een T 75 weefselkweek kolf bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: De media en de aanvullende componenten zullen variëren op basis van cellijnen en moet daarom dienovereenkomstig worden gekozen. - Vernieuwen medium om de 2-3 dagen tot verstrekkende ~ 80% confluentie.
Opmerking: De hoeveelheid cellen vereist zijn op basis van het experimentele design. Indien nodig, kan meer cellen worden verkregen door een subcultuur. - Oogst cellen te testen.
- Verwijder het medium en was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) onder voorzichtig schudden de kolf en vervolgens ontdoen van de uitgegeven PBS.
- Voeg trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 min,of totdat de cellen losgemaakt van de fles.
- Verzamel de vrijstaande cellen in PBS en breng ze in een schone centrifugebuis.
Opmerking: Als hechtende cellijnen worden gebruikt, afzonderlijke cellen door centrifugeren en eenmaal wassen met PBS.
- Bepaal het totale aantal cellen met behulp van een hemacytometer of andere mobiele telsysteem.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in verse, voorverwarmde medium.
- Zaad gelijke aantallen cellen in afzonderlijke putjes van een ondoorzichtige multi-well plaat. In dit voorbeeld plaat 5 x 10 5 cellen in een volume van 1 ml in elk putje van een zwarte 24-wells plaat. Plaat een gelijk volume medium in drievoudige putjes te treden als de negatieve controle.
Opmerking: Het aantal cellen uitgeplaat in elk putje is flexibel en kan worden geoptimaliseerd voor afzonderlijke experimenten. Voor elke bioluminescerende cellijn, experimenteel de verhouding tussen het aantal cellen en biolumi bepalennescent uitgang, alsmede de minimale detecteerbare celtelling vóór het toxiciteitstests. Om deze, maatregel bioluminescentie doen over een breed scala van maten bevolking (bijvoorbeeld 1 x 03-01 oktober x 10 6 cellen) onder gestandaardiseerde condities beeldvorming. - Behandel cellen met testen verbinding (en) zoals hieronder beschreven.
2. Chemische Voorbereiding
- Bereid de geteste chemische verbinding als een geconcentreerde stockoplossing. In dit voorbeeld gebruikt een 100 mg / ml voorraadoplossing van antibiotica van de bleomycine familie.
Opmerking: Om potentiële voertuig gebaseerde toxische effecten te minimaliseren, vooral wanneer een organisch oplosmiddel wordt gebruikt als middel voor chemische Bovendien wordt aanbevolen dat de voorraad concentratie ten minste 1000 maal de gewenste concentratie na toepassing. - Voeg de bereide chemische stock direct aan de cellen. In dit voorbeeld de dosis antibioticum plaats in eindconcentraties van 100, 200, 300 en 400 ug / ml in trigeplooid putten. Vertrekken drie putten van cellen onbehandeld als controles.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van de doelwit chemische moet worden afgestemd op specifieke experimentele doelen. Een breed scala aan concentraties getest normaliter een volledig spectrum van de toxische effecten te verkrijgen.
3. Imaging en data-analyse
- Onmiddellijk na chemische toevoeging, plaats de plaat in de beeldvorming kamer van geschikte instrument voor het verwerven en bioluminescentie meting.
- Maatregel bioluminescentie elke 15 min over een 24-uurs periode met behulp van een 10 min integratietijd voor elke meting.
Opmerking: De integratietijd in dit voorbeeld op een per-plaat basis en kan worden aangepast voor meting op een per-well basis met andere luminometers keuze. De integratietijd kan ook worden aangepast op basis van de gekozen bioluminescentie cellijn. Omdat bioluminescentie wordt autonoom geproduceerd zonder cel vernietiging of elke externe stimulatie, leesgen kan op elk gewenst tijdstip worden genomen om proefondervindelijke doelstellingen. - Kwantificeren van de lichtgevende intensiteit van elk putje door het identificeren van een regio van belang met compatibele software. Weer de lichtopbrengst hetzij als de totale flux (fotonen / seconde) of de gemiddelde straling (fotonen / seconde / cm 2 / steridian) van elk monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werden de dynamiek van autobioluminescent HEK293 cellen continu gevolgd gedurende een 24 uurs periode in reactie op antibiotica blootstelling (Figuur 1). De toxische effecten van deze antibiotica, die een lid van de familie bleomycine bekend om levende cellen te doden door binding aan en splitsen van DNA 13 werden aangetoond door een daling van bioluminescent productie in vergelijking met onbehandelde cellen, die direct gevisualiseerd kunnen worden door de pseudocolor afbeeldingen (Figuur 2). De autobioluminescent aard van deze cellen, die het herhaalde parallelle screening van monsters onder verschillende behandelingsomstandigheden toegestaan termijn voor vergelijking van verschillende concentraties op een bepaald tijdstip voor eenvoudige dosis-respons-analyse. Bijvoorbeeld, bioluminescentie uit cellen na 15 uur, 18 uur en 20 uur behandeling werd uitgezet tegen chemische concentraties in figuur 3, waaruit blijkt dat het verhogen van antibiotische behandeling resulted in de vermindering van bioluminescentie productie in een dosis-response manier.
Figuur 1. Continu volgen van bioluminescentie dynamiek in reactie op blootstelling aan chemische stoffen. Constitutief bioluminescerend HEK293 cellen werden blootgesteld aan verschillende concentraties van een antibioticum van de bleomycine familie. Bioluminescent productie werd gevolgd gedurende een uur periode van blootstelling 24 (representatieve gegevens voor technische triplo op een plaat, gemiddelde ± standaard fout) (herdruk van 14).
Figuur 2. Pseudocolor beelden van behandelde cellen.
Figuur 3. Dosis-respons van chemische belichting. Het bioluminescente uitgave na 15 uur, 18 uur en 20 uur blootstelling bleek dat verhoging antibiotische behandeling resulteerde in de vermindering van lichtproductie in een dosis-respons wijze (representatieve gegevens voor technische drievoud op plaat, gemiddelde ± standaard fout). R2 wordt berekend voor lineaire regressie.
Tabel 1. Representatieve vergelijking van deaangetoond screen toxiciteit behulp van autobioluminescent (lux-based) humane cellen of traditionele vuurvlieg luciferase (luc) gebaseerde bepaling in een 96-well plaat formaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze werkwijze toont het gebruik van autonoom bioluminescent zoogdiercellen als in vitro cytotoxiciteit screeningstest waarmee levende cellen continu worden gevolgd gedurende hun leven. Dit protocol is flexibel en kunnen worden aangepast aan specifieke experimentele omstandigheden geschikt als vereist. Bijvoorbeeld, de hier gepresenteerde experiment is geschikt voor het volgen van acute toxische effecten, maar kan worden aangepast aan traag of lange termijn effecten te evalueren door herhaaldelijk beeldvorming een verhoogd tijdsintervallen (bijvoorbeeld elke 24 uur) en het handhaven van de cellen onder standaard incubatiecondities tussen lezingen. Bovendien kan de integratietijd worden aangepast aan het bioluminescent cellijn. Een eerste experiment van beeldvorming met verschillende integratietijden kunnen worden uitgevoerd om de optimale venster lezen bepalen. De 10 min integratie in dit voorbeeld werd gekozen om het dynamisch bereik van bioluminescent productie in alle treatmen markerent voorwaarden kan een kortere leesraam worden toegepast afhankelijk van de toepassing. Evenzo, terwijl een 24-wells plaat wordt gebruikt voor demonstratie in dit voorbeeld, 96 - of 384-well platen kunnen vervangen applicaties met hogere doorvoer. Hoewel de representatieve resultaten hier demonstreren technische triplo op een plaat, is het belangrijk op te merken dat onafhankelijke assays op verschillende platen moeten worden uitgevoerd om de statistische significantie tussen behandeling te kunnen vaststellen wanneer het testen van een verbinding van belang. Bovendien, omdat deze test kan worden aangepast voor gebruik in een verscheidenheid van instrumenten met verschillende detectiegevoeligheden, wordt aanbevolen dat voldoende signaal-ruis en signaal-achtergrond-verhoudingen worden bepaald op een per-instrument basis.
Eerder is vastgesteld dat de minimale detecteerbare aantal cellen in een 24-wells plaat ongeveer 1,5 x 10 4 cellen onder beeldomstandigheden beschreven 15.Het is echter belangrijk op te merken dat het minimale aantal cellen nodig voor betrouwbare detectie varieert met goed formaat en het gebruik van kleinere putjes vermindert het aantal cellen nodig voor de detectie van het aantal van bioluminescent cellen per oppervlakte-eenheid. Daarom is het sterk aanbevolen dat de relatie tussen lichtgevende output en grootte van de populatie voorafgaand aan de screening worden vastgesteld onder de gewenste beeldvorming voorwaarden. Bovendien kan een fotomultiplicatorbuis-based plaatlezer ook voor gegevensverzameling in plaats van de IVIS Lumina beeldvormingssysteem, maar ten koste van het verkrijgen pseudocolor afbeeldingen. Ongeacht de beeldvorming gebruikte instrument moet een ondoorzichtige plaat worden gebruikt signaalverlies en / of bioluminescente besmetting van aangrenzende wells door fotonen doorkruisen van de plaat te minimaliseren.
Vergeleken met andere algemeen toegepaste celkweek benaderingen biedt deze werkwijze het voordeel dat de gegevensverwerving kan performed in een volledig geautomatiseerde manier omdat de noodzaak voor het monster vernietiging of substraat Daarnaast wordt geëlimineerd. Het staat ook voor het continu volgen van de dynamische effecten op dezelfde cel populatie over een langere periode van blootstelling, wat een verbeterde resolutie van toxicologische kinetiek biedt zonder de gelijktijdige toename van de monetaire of tijd kosten, dat is noodzakelijk bij het gebruik van cel-lysis-eisen methoden ( Tabel 1). Echter, een belangrijke beperking van deze werkwijze is dat celtype-specifieke testen zal de stabiele transfectie van de lux-cassette in elk celtype van belang om een autobioluminescent fenotype voor het screenen vereisen. Hoewel deze behoefte slechts een keer uitgevoerd omdat de cellen vervolgens in vloeibare stikstof worden opgeslagen voor toekomstig gebruik, de transfectie procedure is een potentieel tijdrovende inspanning.
Ondanks deze voorwaarde, het protocol dat hier geschetst wordt eenvoudig en goedkoop, vereisens minimale hands-on werk van laboratorium personeel, geen extra reagentia nodig, en genereert gegevens die direct kunnen worden gebruikt voor toxicologische interpretatie. Daarom concluderen wij dat autobioluminescent zoogdiercellijnen kan worden gebruikt als een high-throughput assay voor een snelle eerste screening van een groot aantal kandidaten verbindingen die meer gedetailleerde evaluatie vereist downstream selecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DM Close, SA Ripp, en GS Sayler zijn oprichters en eigenaren van 490 Biotech, Inc
Acknowledgments
Deze onderzoeksinspanningen werden gesteund door de National Science Foundation gebied Chemische, Biotechniek, Milieu en Vervoer (CBET) Systemen onder award nummers CBET-0853780 en CBET-1159344 en de National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) onder award nummer 1R43ES022567-01, en het National Cancer Institute, Cancer beeldvormingsprogramma onder award nummer CA127745-01. De IVIS Lumina instrument gebruikt in dit werk werd verkregen van het Amerikaanse leger Defense University Research Instrumentatie Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
