Summary
Mammalian Zellen, die das bakterielle Biolumineszenz Genkassette (
Abstract
Säugetier-Zell-basierten in vitro-Assays wurden weithin als Alternativen zu Tierversuchen für toxikologische Studien eingesetzt wurden dann aber wegen der hohen Geld-und Zeit Kosten parallel Probenvorbereitung, die aufgrund der destruktiven Natur der Glühwürmchen-Luciferase-basierte Screening-Verfahren notwendig sind begrenzt . Dieses Video beschreibt die Verwendung von autonom Biolumineszenz Säugerzellen, die keine die destruktive Addition eines Luciferinsubstrat als kostengünstige und einfache Methode zur Überwachung der zytotoxischen Wirkung einer Verbindung von Interesse. Säugerzellen stabil exprimieren, die vollständige Bakterien Biolumineszenz (luxCDABEfrp) Genkassette autonom erzeugt ein optisches Signal, das Peaks bei 490 nm ohne Zusatz eines teuren und möglicherweise störende Luciferinsubstrat, Anregung durch eine externe Energiequelle oder Zerstörung der Probe, die traditionell durchgeführt während der optischen Bildgebungsverfahrens. Diese Unabhängigkeit von externer Stimulation stellt die Belastung für die Aufrechterhaltung der Biolumineszenz-Reaktion lediglich auf der Zelle, so dass das resultierende Signal nur während des aktiven Metabolismus detektiert. Diese Eigenschaft macht das lux-exprimierenden Zelllinie ein ausgezeichneter Kandidat für die Verwendung als biosentinel gegen zytotoxische Effekte, da Änderungen in Biolumineszenz Produktion anzeigt nachteilige Auswirkungen auf das Zellwachstum und den Stoffwechsel sind. Ebenso ermöglicht die autonome Natur und der Mangel an erforderlichen Probe Zerstörung wiederholte Abbildung der gleichen Probe in Echtzeit während der gesamten Giftstoff Belichtung und können über mehrere Proben in einem der vorhandenen bildgebende Geräte in einer automatisierten Weise durchgeführt werden.
Introduction
In den USA benötigen Arzneimittel und andere Produkte für den menschlichen Verzehr bestimmt sind umfangreiche Einschätzung, bevor sie für den Verbraucher von der Food and Drug Administration genehmigt werden. Die finanzielle Belastung für die Durchführung dieser Tests auf den Entwickler 1, das im Wesentlichen die Kosten für neue Verbindung Entwicklung und somit führt zu erhöhten Kosten für den Verbraucher gegeben. Während traditionell viel von dieser Screening tierischen Patienten genutzt hat, um als Stellvertreter für den menschlichen Gastgeber fungieren, hat sich diese zu einer großen finanziellen Belastung werden, mit einem geschätzten $ 2800000000 jährlich aufgewendet auf ADME / Tox (Adsorption, Verteilung, Stoffwechsel, Ausscheidung und Toxizität ) Screening allein 2 und Montage Hinweise darauf, dass Tiermodellen nicht verlässlich vorhersagen humantoxikologischen Antworten 3. Daher wurde in vitro menschliche Zellkultur-basierten Tests Popularität in den letzten zwei Jahrzehnten wegen seiner relativ niedrigen gewonnenKosten, höheren Durchsatz und eine bessere Darstellung von menschlichen Bioverfügbarkeit und Toxikologie 4. Aktuelle Zellkultur-basierte Screening-Methoden beschäftigen Toxizität verschiedenen Endpunkten, wie die Messung der ATP-Spiegel, das Screening der Aktivität von endogen verfügbar zytoplasmatischen Enzyme, die Erforschung der Integrität der Zellmembran, oder die Verfolgung der Ebene der mitochondrialen Aktivität, zu evaluieren zellulären Lebensfähigkeit 5 , 6. Unabhängig von dem Endpunkt gewählt alle diese Verfahren erfordern die Zerstörung der Probe vor der Messung entnommen werden, wodurch nur Erzeugen von Daten in einem einzigen Zeitpunkt. Als Folge müssen eine große Anzahl von Proben vorbereitet zu sein und behandelt parallel zur grundlegenden toxikologischen Studien Kinetik, erneute Zugabe zu den Kosten und Arbeit für neue Verbindung Entwicklung erforderlich. Alternativ Assays mit Luziferase wie Gaussia Luciferase 7, Vargula Luciferase 8 und 9 Metridia Luciferase abgesondertentwickelt worden, die die Beseitigung der Notwendigkeit zur Zelllyse und einen Bruchteil der Medien für die Endpunktbestimmung, werden diese jedoch noch Abtastung zu vorbestimmten Zeitpunkten beschränkt und erfordern die Zugabe von exogenen lichtaktivierenden Substraten.
Um den Nachteil der erforderlichen Probe Zerstörung sowie die Kosten für die Beseitigung Substrate zu vermeiden, wurde eine menschliche Zelllinie entwickelt, dass drückt die volle bakterielle Biolumineszenz (lux) Gen-Kassette (luxCDABEfrp), die für die kontinuierliche Überwachung von lebenden Zellen, die ähnlich ist zu ermöglichen fluoreszierende Farbstoff-basierte Live Cell Imaging, aber ohne die zusätzlichen Photon-aktivierenden und mikroskopische Untersuchungsverfahren. Diese Zelllinie kann konstitutiv Erzeugen eines optischen Signals zur kontinuierlichen, direkten Nachweis ohne äußere Stimulation, wodurch die Zerstörung der Probe. Mechanistisch führen die Biolumineszenz-Signal aus diesen Zellen erzeugts, wenn die luxAB gebildete Enzym Luciferase katalysiert die Oxidation einer langkettigen Fettsäure Aldehyd (synthetisiert und von den luxCDE Genprodukte mit endogenen Substraten regeneriert) in Gegenwart von reduziertem Riboflavinphosphat (FMNH 2, die von FMN durch die FRP-Gens zurückgeführt Produkt) und molekularem Sauerstoff 10. Expression des lux-Kassette in der Wirtszelle ermöglicht somit Licht erzeugt und detektiert werden, ohne Zellzerstörung oder exogene Substratzugabe. Ebenso stellt die Interaktion zwischen den Genen und der lux endogen verfügbar FMN und O 2 Cosubstrate, und der Forderung nach Aufrechterhaltung einer Umgebung, die die Umwandlung von FMN zu FMNH 2 unterstützen kann, dass die resultierende Biolumineszenz-Signal kann nur von lebenden nachgewiesen werden , metabolisch aktiven Zellen.
Diese Anforderungen wurden bisher ausgenutzt werden, um die lux-bas demonstrierened bioluminescent Ausgang korreliert stark mit zellulären Bevölkerung Größe 11 und dieser toxischen Verbindung Exposition beeinträchtigt autobioluminescent Produktion in einer Dosis-Wirkungs-weise 12. Wir verwenden hier eine bisher dadurch autobioluminescent humane embryonale Nierenzellen (HEK293)-Zelle 11 an die automatisierte toxikologischen Screening eines Antibiotikums aus der Bleomycin Familie mit bekannten DNA-schädigenden Aktivität als ein repräsentatives Beispiel der Anwendung von autobioluminescent Säugetierzellen zur Toxizität validieren demonstrieren.
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Protocol
1. Zellpräparation
- Recover ein Fläschchen bioluminescent HEK293 Zellen aus flüssigem Stickstoff gefroren Lager und wachsen sie in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum, 0,01 mM nicht essentiellen Aminosäuren, 1x Antibiotikum-Antimykotikum und 0,01 mM Natriumpyruvat in einem T 75 Zellkulturflasche bei 37 ° C und 5% CO 2.
Hinweis: Die Medien und ergänzende Komponenten auf Zelllinien variieren und sollte daher entsprechend gewählt werden. - Aktualisieren Medium alle 2-3 Tage bis zum Erreichen ~ 80% Konfluenz.
Hinweis: Die Anzahl der Zellen benötigt wird auf dem experimentellen Design basieren. Bei Bedarf können weitere Zellen durch Subkultivierung erhalten werden. - Ernten Sie die Zellen für die Prüfung.
- Entfernen Sie das Medium und die Zellen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch vorsichtiges Schwenken des Kolbens und dann Verwerfen des PBS verbracht.
- In Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 2 min,oder bis die Zellen vom Kolben abgelöst.
- Sammeln Sie die abgelösten Zellen in PBS und übertragen sie in ein sauberes Zentrifugenröhrchen.
Hinweis: Wenn nonadherent Zelllinien, separate Zellen durch Zentrifugation verwendet und einmal mit PBS waschen.
- Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämazytometer oder andere Zelle Zählsystem.
- Zentrifuge die Zellsuspension bei 300 xg für 5 min. Überstand verwerfen und die Zellen in frischem, vorgewärmten Medium.
- Seed gleiche Anzahl von Zellen in einzelnen Vertiefungen einer opaken Multi-Well-Platte. In diesem Beispiel Platte 5 x 10 5 Zellen in einem Volumen von 1 ml pro Vertiefung in eine schwarze 24-Well-Platte. Platte ein gleiches Volumen des Mediums in drei Vertiefungen, die als negative Kontrolle dienen.
Hinweis: Die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung beschichtet ist flexibel und kann bei einzelnen Versuchen optimiert werden. Für jede Zelllinie Biolumineszenz, experimentell die Beziehung zwischen Zellzahl und bioluminescent Ausgang, sowie die minimal nachweisbare Zelle vor allen Prüfungen der Toxizität zählen. Um diese, messen Biolumineszenz in einem breiten Spektrum von Bevölkerung Größen (z. B. 1 × 10 3 bis 1 x 10 6 Zellen) tun unter standardisierten Bedingungen Bildgebung. - Gönnen Zellen mit Tests Verbindung (en), wie unten beschrieben.
2. Chemische Vorbereitung
- Bereiten Sie die Chemikalie als konzentrierte Stammlösung getestet. In diesem Beispiel verwenden Sie eine 100 mg / ml Stammlösung eines Antibiotikums der Bleomycin Familie.
Hinweis: Um potenzielle Fahrzeug basierte toxischen Effekte zu minimieren, vor allem, wenn ein organisches Lösungsmittel als Vehikel für chemische Zusatz verwendet wird, empfiehlt es sich, dass die Aktie Konzentration mindestens 1.000 Mal die gewünschte Anwendung post-Konzentration sein. - In den vorbereiteten chemischen Aktien direkt zu den Zellen. In diesem Beispiel Dosis des Antibiotikums von Interesse in Endkonzentrationen von 100, 200, 300 und 400 pg / ml in triverkomplizieren Brunnen. Lassen Sie drei Brunnen von Zellen unbehandelt als Kontrollen.
Hinweis: Die Endkonzentration des Zielchemikalie sollte auf spezielle experimentelle Ziele ausgewählt werden. Eine breite Palette von Konzentrationen getestet, um normalerweise das volle Spektrum der toxischen Effekte zu erzielen.
3. Imaging und Data Analysis
- Unmittelbar nach Anlagerung wird die Platte in der Imaging-Kammer geeignete Instrument für die Bildaufnahme und Biolumineszenz-Messung.
- Measure Biolumineszenz alle 15 min über einen Zeitraum von 24 Std. mit einem 10 min Integrationszeit für jede Lesung.
Hinweis: Die Integrationszeit in diesem Beispiel verwendet wird, ist auf einer Pro-Platte zur Verfügung und können für die Messung auf einer pro-und Basis mit anderen Luminometer der Wahl eingestellt werden. Die Integrationszeit kann auch basierend auf der gewählten Biolumineszenz-Zelllinie eingestellt werden. Weil Biolumineszenz autonom ohne Zell-Zerstörung oder externe Stimulation erzeugt, gelesengen kann an jeder beliebigen Zeitpunkt gemacht werden, um bestimmte Ziele zu erfüllen experimentellen. - Quantifizierung der Biolumineszenz Intensität aus jeder Vertiefung durch die Identifizierung eines Bereichs von Interesse mit kompatibler Software. Anzeige der Lichtleistung entweder als Gesamtfluß (Photonen / Sekunde) oder der durchschnittlichen Strahlung (Photonen / Sekunde / cm 2 / steridian) jeder Probe.
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Representative Results
In dieser Studie wurden die Dynamik autobioluminescent HEK293 Zellen kontinuierlich über einen Zeitraum von 24 Std. in Reaktion auf die Antibiotika Exposition (Abbildung 1) überwacht. Die toxischen Wirkungen dieses Antibiotikums, die ein Mitglied der Familie bekannt, Bleomycin lebenden Zellen durch Bindung an DNA und spalten 13 töten ist, wurden über eine Abnahme der Biolumineszenz-Produktion im Vergleich zu unbehandelten Zellen, die direkt visualisiert werden können durch die Pseudocolor Bilder gezeigt (Abbildung 2). Die autobioluminescent Natur dieser Zellen, die die wiederholte parallel Screening von Proben unter verschiedenen Behandlungsbedingungen erlaubt, zum Vergleich von verschiedenen Konzentrationen zu einem bestimmten Zeitpunkt für eine einfache Dosis-Wirkungs-Analyse erlaubt. Zum Beispiel, Biolumineszenz von Zellen nach 15 Stunden hergestellt, 18 h und 20 h wurde der Behandlung gegen chemische Konzentrationen in Abbildung 3 dargestellt, zeigt, dass die zunehmende Antibiotika-Behandlung Resulten bei der Reduktion von Biolumineszenz Produktion in einer Dosis-Wirkungs-Beziehung.
Abbildung 1. Kontinuierliche Verfolgung von Biolumineszenz Dynamik in Reaktion auf chemische Einflüsse. Konstitutiv Biolumineszenz HEK293-Zellen wurden in verschiedenen Konzentrationen eines Antibiotikums der Bleomycin Familie ausgesetzt. Bioluminescent Produktion wurde über einen Zeitraum von 24 Stunden Exposition (repräsentative Daten für die technische dreifach auf einer Platte, Mittelwert ± Standardabweichung) (Nachdruck von 14) überwacht.
Abbildung 2. Pseudofarben Bilder der behandelten Zellen.
Abbildung 3. Dosis-Wirkungs-chemischer Exposition. Die Biolumineszenz Ausgang nach 15 h, 18 h und 20 h Exposition zeigte, dass die zunehmende Antibiotika-Behandlung führte zu einer Reduktion der Lichterzeugung in einer Dosis-Wirkungs-Weise (repräsentative Daten zur technischen dreifach auf einer Platte, Mittelwert ± Standardabweichung). R 2-Wert für die lineare Regression berechnet.
Tabelle 1. Repräsentative Vergleich derToxizität nachgewiesen Bildschirm entweder mit autobioluminescent (lux-based) Humanzellen oder ein traditionelles Glühwürmchen-Luciferase (luc) basierende Assays in einem 96-Well-Platten-Format.
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Discussion
Dieses Verfahren zeigt die Verwendung von autonom Biolumineszenz Säugerzellen als ein in vitro-Zytotoxizität Screening-Assay, der lebende Zellen kontinuierlich über ihre Lebensdauer verfolgt werden kann. Dieses Protokoll ist flexibel und kann modifiziert werden, um spezielle experimentelle Bedingungen aufzunehmen, wie erforderlich. So stellte das Experiment hier eignet sich für die Verfolgung von akuten toxischen Wirkungen, kann aber angepasst träge oder langfristigen Auswirkungen durch wiederholtes Bildgebung bei erhöhten Zeitintervallen (dh alle 24 Stunden) und die Aufrechterhaltung der Zellen unter Standardbedingungen Inkubationsbedingungen zwischen beurteilen Lesungen. Darüber hinaus kann die Integrationszeit auf der Grundlage des Biolumineszenz-Zelllinie eingestellt werden. Ein Vorversuch der Bilderzeugung mit verschiedenen Integrationszeiten durchgeführt werden, um die optimale Lesefenster zu bestimmen. Die 10 min Integration in diesem Beispiel verwendet wurde gewählt, um den dynamischen Bereich des Biolumineszenz-Produktion in allen treatmen markierent Bedingungen ist jedoch eine kürzere Leserahmen angewendet abhängig von der Anwendung. In ähnlicher Weise während einer 24-Well-Platte für die Demonstration in diesem Beispiel verwendet wird, 96 - kann oder 384-Well-Platten für einen höheren Durchsatz Anwendungen ersetzt werden. Obwohl die Vertreter hier gezeigten Ergebnisse zeigen, technischen dreifach auf einer einzigen Platte, ist es wichtig, dass unabhängige Tests auf verschiedenen Platten beachten durchgeführt werden, um die statistische Signifikanz zwischen den Behandlungsgruppen Ebenen herzustellen, wenn die Prüfung einer Verbindung von Interesse sein. Darüber hinaus, weil dieser Assay für die Verwendung in einer Vielzahl von Instrumenten mit unterschiedlichen Nachweisempfindlichkeit angepasst werden kann, wird empfohlen, dass ein akzeptables Signal-zu-Rausch-und Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis auf einer Pro-Instrument Basis festzulegen.
Es wurde zuvor festgestellt, dass die minimale nachweisbare Zellzahl in einer 24-Well-Platte etwa 1,5 x 10 4 Zellen wurde unter den hier beschriebenen Bedingungen Imaging 15.Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die minimale Anzahl von Zellen zur sicheren Erkennung erforderlich mit gut variiert, und dass die Verwendung von kleineren Vertiefungen reduziert die Anzahl von Zellen für die Erfassung durch Erhöhung der Anzahl der Biolumineszenz-Zellen pro Flächeneinheit erforderlich. Daher ist es dringend empfohlen, dass die Beziehung zwischen Biolumineszenz-Ausgang und Größe der Bevölkerung unter den gewünschten Bedingungen Bildgebung bestimmt vor dem Screening werden. Darüber hinaus kann eine Photovervielfacherröhre auf Plattenlesegerät auch zur Datenerfassung anstelle des IVIS Lumina Abbildungssystem verwendet werden, jedoch zu Lasten der Gewinnung Pseudo Bildern. Unabhängig von der bildgebenden Instrument verwendet, sollte eine undurchsichtige Platte verwendet, um Signaldämpfung und / oder Biolumineszenz Kontamination benachbarter Vertiefungen durch Photonen Durchlaufen der Platte zu minimieren.
Im Vergleich zu anderen üblicherweise verwendeten Zellkultur-basierte Ansätze, bietet dieses Verfahren den Vorteil, dass die Datenerfassung können performe seind in einer vollständig automatisierten Weise, da die Notwendigkeit für Probe Zerstörung oder Substrat Zusätzlich entfällt. Es ermöglicht auch die kontinuierliche Verfolgung von dynamischen Effekten auf der gleichen Zelle Bevölkerung über einen längeren Zeitraum der Exposition, die eine erhöhte Auflösung der toxikologischen Kinetik bietet, ohne die gleichzeitige Zunahme der monetären Kosten, Zeit oder ist notwendig, wenn Sie Zell-Lyse-Verfahren erfordern ( Tabelle 1). Es ist eine wichtige Einschränkung dieses Verfahrens, dass Zelltyp-spezifische Tests wird die stabile Transfektion der lux Kassette in jeden Zelltyp von Interesse erforderlich, um eine autobioluminescent Phänotyp-Screening zu erzeugen. Obwohl dies nur einmal durchgeführt werden, da die Zellen anschließend in flüssigem Stickstoff für eine zukünftige Verwendung gelagert werden, ist das Verfahren der Transfektion eine möglicherweise zeitraubende Aufgabe.
Trotz dieser Voraussetzung, skizzierte das Protokoll hier ist einfach und kostengünstig, erforderns minimal praktische Arbeit von Laborpersonal, benötigt keine zusätzliche Reagenzien und erzeugt Daten, die direkt für toxikologische Interpretation verwendet werden. Aus diesen Gründen schließen wir, dass autobioluminescent Säugerzellen als Hochdurchsatz-Assay zur raschen vorläufigen Screening einer großen Anzahl von Kandidaten-Verbindungen, die detailliertere nachgeschalteten Auswerteelektronik erforderlich wählen können verwendet werden.
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Disclosures
DM Close, SA Ripp, und GS Sayler sind Gründer und Inhaber von 490 BioTech, Inc.
Acknowledgments
Diese Forschungsarbeiten wurden von der National Science Foundation Division of Chemical, Bioengineering, Umwelt und Transport (CBET) Systeme unter award Zahlen CBET-0853780 und CBET-1159344 und die National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) unterstützt unter Verleihungsnummer 1R43ES022567-01, und dem National Cancer Institute, Cancer Imaging Program unter Verleihungsnummer CA127745-01. Die Lumina IVIS Instrument in dieser Arbeit verwendet wurde, von der US Army Defense University Research Instrumentation Programm erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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