Summary
Pattedyrceller som uttrykker bakteriell Bioluminescens genet kassett (
Abstract
Pattedyrcellelinje-basert in vitro analyser har vært mye brukt som alternativer til dyreforsøk for toksikologiske studier, men har blitt begrenset på grunn av de høye penge-og tidskostnader av parallell prøveopparbeidelse som er nødvendiggjort på grunn av den destruktive natur firefly luciferase-baserte screening metoder . Denne filmen beskriver anvendelse av autonomt bioluminescent pattedyrceller, som ikke krever den destruktive tilsetning av luciferin en substrat, slik som en billig og anvendelige metoden for overvåking av den cytotoksiske effekten av en forbindelse av interesse. Pattedyrceller stabilt uttrykker den fulle bakteriell bioluminescens (luxCDABEfrp) genet kassett autonomt produserer et optisk signal som topper ved 490 nm uten tillegg av en kostbar og muligens forstyrre luciferin substrat, eksitasjon av en ekstern energikilde, eller ødeleggelse av prøven som er tradisjonelt utføres i løpet av optisk imaging prosedyres. Denne uavhengighet av ytre stimulering legger byrde for å opprettholde bioluminescent reaksjon utelukkende på cellen, noe som betyr at det resulterende signal blir detektert bare i løpet av aktiv metabolisme. Denne egenskapen gjør lux-uttrykke cellelinje en utmerket kandidat for bruk som en biosentinel mot cytotoksiske effekter fordi endringer i selvlysende produksjon er tegn på negative effekter på cellevekst og metabolisme. På samme måte tillater den autonome natur og mangel på nødvendig prøven ødeleggelse gjentatt avbildning av den samme prøve i sanntid gjennom hele perioden av toksikanten eksponering, og kan bli utført på tvers av flere prøver ved hjelp av eksisterende utstyr avbildning på en automatisert måte.
Introduction
I USA, legemidler og andre produkter beregnet på konsum krever omfattende vurdering før de er godkjent for privat bruk av Food and Drug Administration. Den økonomiske byrden for å utføre denne testingen er plassert på en utbygger, som vesentlig øker kostnadene for nye sammensatte utvikling og derfor oversettes til en økt kostnad for forbrukerne. Mens tradisjonelt mye av dette screening har benyttet dyr fag til å opptre som fullmektig for menneskelige verter, har dette vist seg å være en stor økonomisk byrde, med en anslått $ 2.8 milliarder brukt årlig på ADME / Tox (adsorpsjon, distribusjon, metabolisme, utskillelse og giftighet ) screening alene 2 og montering bevis som tyder på at dyremodeller ikke med sikkerhet kan forutsi menneskelige toksikologiske reaksjoner tre. Derfor har in vitro human cellekultur-basert testing vunnet popularitet de siste to tiårene på grunn av sin relativt laveremåltid, høyere gjennomstrømning, og bedre representasjon av human biotilgjengelighet og toksikologi 4.. Gjeldende cellekultur-baserte toksisitet screeningsmetoder benytter ulike endepunkter, for eksempel ved måling av ATP-nivåer, screening aktiviteten av endogent tilgjengelige cytoplasmatiske enzymer, sondering integriteten til den cellulære membran, eller sporing av nivået av mitokondriell aktivitet, for å evaluere cellulær levedyktighet 5 , 6. Imidlertid, uavhengig av endepunkt valgt, alle disse metodene krever ødeleggelse av prøven før målinger kan bli tatt, således bare produsere data på en eneste gang punkt. Som et resultat av et stort antall prøver må man fremstilt og behandlet parallelt for grunnleggende kinetikk toksikologiske studier, igjen å legge til kostnaden og arbeidskraft som kreves for ny sammensatt utvikling. Alternativt analyser ved hjelp skilles luciferase som Gaussia 7 luciferase, Vargula luciferase 8, og Metridia luciferase 9har blitt utviklet som eliminerer behovet for cellelyse og krever en brøkdel av media for endepunktet måling, men disse fortsatt begrenset til prøvetaking ved forutbestemte tidspunkter og også kreve tilsetning av eksogene lys-aktiverende substrater.
For å unngå skade for nødvendig prøven ødeleggelse, så vel som for å eliminere kostnadene for substrater, har en human cellelinje blitt konstruert som uttrykker den fulle bakteriell bioluminescens (lux) genet kassett (luxCDABEfrp) for å tillate kontinuerlig overvåking av levende celler som ligner til fluorescerende fargestoff basert live-cell imaging, men uten de ekstra foton-aktiverende og mikroskopisk undersøkelse prosedyrer. Denne cellelinje er i stand til konstitutivt å produsere et optisk signal for et kontinuerlig og direkte deteksjon uten behov for ytre stimulering, slik at man unngår ødeleggelse av prøven. Mechanistically, bioluminescent signal genereres fra disse cellene føres når den luxAB-formet enzymet luciferase katalyserer oksydasjonen av en langkjedet fettsyre aldehyd (syntetisert og regenereres av luxCDE genprodukter ved hjelp av endogene substrater) i nærvær av redusert riboflavin fosfat (2 FMNH, som resirkuleres fra FMN av FRP gen produkt) og molekylært oksygen 10. Ekspresjon av den lux kassetten i vertscellen blir dermed mulig for lys å bli produsert og detektert uten cellulær ødeleggelse eller eksogent substrat tilsetningen. Likeledes sikrer samspill mellom de lux gener og endogent tilgjengelig FMN, og O 2 cosubstrates, og at kravet til vedlikehold av et miljø som kan støtte konvertering av FMN til FMNH 2, at den resulterende bioluminescent signalet kan bare oppdages ved å leve , metabolsk aktive celler.
Disse kravene har tidligere blitt utnyttet for å vise at lux-based bioluminescent utgang korrelerer sterkt med mobilnettet befolkningen størrelse 11 og at giftig stoff eksponering svekker autobioluminescent produksjon i et dose-respons-fashion 12. Her bruker vi en tidligere preget autobioluminescent humane embryonale nyre (HEK293) cellelinje 11 for å demonstrere den automatiserte toksikologisk screening av et antibiotikum av bleomycin familie med kjent DNA ødeleggende aktivitet som et representativt eksempel å validere bruk av autobioluminescent mammalieceller for toksisitet testing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Celleforberedelsen
- Gjenopprette en ampulle med bioluminescent HEK293 celler fra flytende nitrogen frosset lager og dyrke dem i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum, 0,01 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 x antibiotika-antimykotiske og 0,01 mM natrium-pyruvat i en T 75 vevskultur-kolbe ved 37 ° C og 5% CO2.
Merk: Mediene og supplerende komponenter vil variere basert på cellelinjer og derfor bør velges deretter. - Refresh medium hver 2-3 dager inntil nå ~ 80% samløpet.
Merk: Mengden av celler som kreves vil være basert på eksperimentell design. Ved behov kan flere celler fås ved ompodning. - Høste celler for testing.
- Fjern medium og vaske cellene med fosfatbufret saltvann (PBS) ved å forsiktig virvling av kolben og deretter kaste de brukte PBS.
- Legg trypsin og inkuber ved 37 ° C i 2 min,eller inntil cellene har løsnet fra kolben.
- Samle de løsnede celler i PBS og overføre dem til et rent sentrifugerør.
Bemerk: Dersom ikke-adherente cellelinjer benyttes, separate celler ved sentrifugering og vaskes en gang med PBS.
- Bestem det totale celletall ved hjelp av en hemacytometer eller annen Celletellingen system.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 xg i 5 min. Kast supernatanten og resuspender cellene i friske, prewarmed medium.
- Seed likt antall av celler i individuelle brønner på en ugjennomsiktig multi-brønn plate. I dette eksemplet er platen 5 x 10 5 celler i et 1 ml volum i hver brønn av en sort 24-brønners plate. Plate et like stort volum av medium i triplikate brønner for å virke som den negative kontroll.
Merk: Antall celler belagt i hver brønn er fleksibel og kan være optimalisert for enkelte eksperimenter. For hver cellelinje bioluminescent, eksperimentelt bestemme forholdet mellom celle nummer og bioluminescent utgang, samt den minimale påvisbare celletall før eventuelle giftighetstester. For å gjøre dette, måle bioluminescens over et bredt spekter av størrelser populasjonen (for eksempel 1 x oktober 3 til 1 x 10 celler 6) under standardiserte betingelser avbildning. - Unn celler med testing forbindelsen (e) som beskrevet nedenfor.
2. Kjemisk Forberedelser
- Klargjør den kjemiske som testes som en konsentrert lagerløsning. I dette eksempel bruke en 100 mg / ml stamløsning av et antibiotikum av bleomycin familien.
Bemerk: For å minimalisere potensielle kjøretøy-baserte toksisk virkning, spesielt hvis et organisk løsningsmiddel anvendes som en bærer for kjemisk tillegg anbefales det at bestanden konsentrasjonen være minst 1.000 ganger den ønskede post-søknad konsentrasjon. - Tilsett fremstilte kjemisk lager direkte til cellene. I dette eksemplet er den dose antibiotikum av interesse ved sluttkonsentrasjoner på 100, 200, 300 og 400 pg / ml i triplicate brønner. La tre brønner av celler ubehandlede som kontroller.
Bemerk: Den endelige konsentrasjonen av target kjemisk skal velges basert på spesifikke eksperimentelle mål. Et bredt spekter av konsentrasjoner er vanligvis testet for å oppnå en fullstendig spektrum av de toksiske effekter.
3. Bildebehandling og dataanalyse
- Umiddelbart etter kjemisk tillegg legger platen i bildebehandling kammer av egnet virkemiddel for bildeopptak og Bioluminescens måling.
- Mål bioluminescens hver 15 min over en 24 timers periode ved hjelp av en 10 min integrasjonstiden for hver avlesning.
Merk: Integrasjonen tiden som brukes i dette eksempelet er på en per-plate basis og kan justeres for måling på en per-brønn basis ved hjelp av andre luminometers av valget. Integrasjonen tid kan også bli justert basert på den valgte bioluminescent cellelinje. Fordi Bioluminescens er produsert selvstendig uten celle ødeleggelse eller en annen ekstern stimulering, leseninger kan tas når som helst ønsket tidspunkt å oppfylle spesifikke eksperimentelle mål. - Kvantifisere bioluminescent intensitet fra hver brønn ved å identifisere et område av interesse ved hjelp av kompatibel programvare. Vise lyseffekten enten som den totale fluks (fotoner / sekund) eller den gjennomsnittlige utstråling (fotoner / sekund / cm 2 / steridian) av hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble dynamikken i autobioluminescent HEK293 celler måles kontinuerlig over en 24 timers periode i respons til antibiotikum eksponering (figur 1). De toksiske effektene av dette antibiotikum, som er et medlem av familien bleomycin kjent for å drepe levende celler ved å binde til DNA og spalte 13, ble demonstrert gjennom en nedgang i bioluminescent produksjon sammenlignet med ubehandlede celler, som kan være direkte visualisert gjennom PseudoColor bildene (Figur 2). Den autobioluminescent naturen av disse celler, som tillot den gjentatte parallell screening av prøver ved forskjellige behandlingsforhold, tillater for sammenligning av forskjellig konsentrasjon på et gitt tidspunkt for enkel dose-respons-analyse. For eksempel, bioluminescens produsert fra celler etter 15 timer, 18 timer og 20 timer fra behandlingen ble plottet mot kjemiske konsentrasjoner i figur 3, som viser at økende antibiotikabehandling resulted i reduksjon av bioluminescent produksjon i et dose-respons måte.
Figur 1. Kontinuerlig sporing av bioluminiserende dynamikk i respons til kjemisk eksponering. Konstitutivt bioluminescent HEK293-celler ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av et antibiotikum av bleomycin familien. Bioluminescent produksjonen ble overvåket over en 24 timers periode med eksponering (representative data for tekniske triplicates på én plate, gjennomsnitt ± standard avvik) (opptrykk fra 14).
Figur 2. PseudoColor bilder av behandlede celler.
Figur 3. Dose-respons av kjemisk eksponering. Den selvlysende effekt etter 15 timer, 18 timer og 20 timers eksponering viste at økende antibiotikabehandling resulterte i reduksjon av lys produksjon i et dose-respons måte (representative data for tekniske triplicates på én plate, gjennomsnitt ± standard avvik). R 2 er det beregnet for lineær regresjon.
Tabell 1.. Representative sammenligning avvist toksisitet skjermen ved hjelp av enten autobioluminescent (lux-baserte) menneskeceller eller en tradisjonell ildflue luciferase (luc)-baserte analysen i en 96-brønners plate format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden demonstrerer bruken av autonomt bioluminescent pattedyrceller som en in vitro-cytotoksisitet screening-analyse som tillater levende celler som skal overvåkes kontinuerlig over deres levetid. Denne protokollen er fleksibel og kan endres for å imøtekomme spesifikke eksperimentelle forhold som kreves. For eksempel presenteres eksperimentet her er egnet for sporing av akutte toksiske effekter, men kan tilpasses til å vurdere langsomt-virkende eller langsiktige effekter ved gjentatte ganger avbildning ved høgare tidsintervaller (dvs. hver 24. time) og opprettholde cellene under standard inkuberingsbetingelser mellom avlesninger. I tillegg kan integreringstiden bli justert basert på bioluminescent cellelinje. En innledende forsøk for bildebehandling med ulike integrasjon ganger kan utføres for å fastslå den optimale lesing vinduet. 10 min integrasjon brukt i dette eksemplet ble valgt å markere den dynamiske rekkevidden til bioluminescent produksjon på tvers av alle treatment forhold, men en kortere leseramme kan anvendes, avhengig av anvendelsen. Tilsvarende, mens et 24-brønns plate blir brukt for demonstrasjon i dette eksemplet, 96 - kan, eller 384-brønners plater erstattes av høyere gjennomstrømning. Selv om de representative resultater er vist her demonstrere tekniske triplicates på en enkelt plate, er det viktig å merke seg at uavhengige analyser på forskjellige plater bør utføres for å etablere statistisk signifikans mellom behandlingsnivåer ved testing av en forbindelse av interesse. Videre, fordi denne analysen kan tilpasses for bruk i en rekke instrumenter med varierende deteksjon følsomheter, er det anbefalt at akseptabelt signal-til-støy-og signal-til-bakgrunn forholdstall bør bestemmes i hvert enkelt per-instrument basis.
Det ble tidligere bestemt at den minimale påvisbare celle nummer i en 24-brønners plate var ca 1,5 x 10 4 celler under bildebehandling forholdene beskrevet her 15.Det er imidlertid viktig å merke seg at det minimale antall celler som kreves for pålitelig deteksjon varierer med godt størrelse, og at bruk av mindre brønner reduserer antall celler som kreves for påvisning ved å øke antallet av bioluminiserende celler per arealenhet. Derfor er det sterkt anbefalt at forholdet mellom bioluminescent produksjon og bestandsstørrelse fastsettes under ønsket bildebehandling forhold før screening. I tillegg kan et fotomultiplikatorrør-basert plateavleseren også brukes for datainnsamling i stedet for IVIS Lumina avbildningssystem, men på bekostning av å skaffe PseudoColor bilder. Uavhengig av hvilken avbildning instrument anvendes, bør en ugjennomsiktig plate brukes for å minimalisere tap av signalstyrke og / eller bioluminescent forurensning av tilstøtende brønner på grunn av fotoner traversering plate.
Sammenlignet med andre vanlig ansatt cellekultur-baserte tilnærminger, tilbyr denne metoden den fordelen at datainnsamlingen kan være performed i en fullstendig automatisert måte da behovet for prøven ødeleggelse eller substrat tillegg elimineres. Det gir også mulighet for kontinuerlig sporing av dynamiske effekter på den samme cellen befolkningen over en lengre periode for eksponering, som gir en forbedret oppløsning på toksikologiske kinetikk uten samtidig økning i penger eller tid kostnader som er krevd ved bruk cellelysis-krever metoder ( tabell 1). Det er imidlertid en viktig begrensning av denne metode som celletype-spesifikk test vil kreve stabil transfeksjon av lux-kassetten i hver celletype av interesse for å generere et autobioluminescent fenotype for screening. Selv om dette behov først utføres når ettersom cellene kan deretter bli lagret i flytende nitrogen for senere bruk, er transfeksjon prosedyre en potensielt tidkrevende oppgave.
Til tross for denne forutsetningen, skissert protokollen her er enkel og billig, krevers minimal hands-on arbeid fra laboratoriet personell, krever ingen ekstra reagenser, og genererer data som kan brukes direkte for toksikologisk fortolkning. Av disse grunner, konkluderer vi med at autobioluminescent pattedyrcellelinjer kan anvendes som et high-throughput analysen for hurtig innledende screening av et stort antall kandidater for å velge forbindelser som krever mer detaljert nedstrøms evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DM Close, SA Ripp, og GS Sayler er grunnleggere og eiere av 490 Biotech, Inc.
Acknowledgments
Disse forskningsinnsats ble støttet av National Science Foundation Division of Chemical, bioteknologi, miljø og transport (cbet) Systems henhold prisen tall cbet-0853780 og cbet-1159344 og National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) henhold award nummer 1R43ES022567-01, og National Cancer Institute, Cancer Imaging Program under award nummer CA127745-01. Den IVIS Lumina instrument som brukes i dette arbeidet ble hentet fra US Army Defense University Research Instrumentation Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
