Summary
As células de mamífero que expressam a cassete de gene de bioluminescência (
Abstract
Células de mamíferos com base em ensaios in vitro têm sido amplamente empregados como alternativas aos testes em animais para estudos toxicológicos, mas foram limitados devido aos altos custos monetários e de tempo de preparação da amostra paralela que sejam necessárias devido à natureza destrutiva do vaga-lume métodos de rastreio baseados luciferase . Este vídeo descreve a utilização de células de mamífero de forma autónoma bioluminescentes, que não requerem a adição de um substrato destrutiva luciferina, tal como um método barato e fácil para a monitorização dos efeitos citotóxicos de um composto de interesse. As células de mamíferos que expressem estavelmente a bioluminescência completo (luxCDABEfrp) cassete do gene autonomamente produzirem um sinal óptico que um pico a 490 nm, sem a adição de um substrato luciferina caro e, possivelmente interferindo, a excitação por uma fonte de energia exterior ou a destruição da amostra que é tradicionalmente realizado durante o procedimento de imagiologia ópticas. Esta independência de estimulação externa coloca o fardo para manter a reacção bioluminescente unicamente sobre a célula, o que significa que o sinal resultante é detectado apenas activo durante o metabolismo. Esta característica faz com que a linha de células de lux que expressam um excelente candidato para o uso como um biosentinel contra os efeitos citotóxicos por causa mudanças na produção bioluminescente são indicativos de efeitos negativos sobre o crescimento e metabolismo celular. Do mesmo modo, a natureza autónoma e falta de destruição da amostra requerida permite imagiologia repetida da mesma amostra em tempo real ao longo do período de exposição tóxico e pode ser realizada através de várias amostras utilizando o equipamento existente de imagem de uma forma automatizada.
Introduction
Em os EUA, farmacêuticos e outros produtos destinados ao consumo humano requer ampla avaliação antes de serem aprovadas para uso do consumidor pela Food and Drug Administration. Os encargos financeiros para executar este teste é colocada no revelador 1, o que aumenta substancialmente os custos de desenvolvimento de novos compostos e, portanto, se traduz num aumento de custos para os consumidores. Enquanto, tradicionalmente, grande parte desta seleção utilizou assuntos animais para atuar como proxies para hospedeiros humanos, este provou ser um grande ônus financeiro, com um valor estimado de 2,8 bilhões dólares gastos anualmente em ADME / Tox (absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade ) triagem sozinho 2 e evidências sugerindo que os modelos animais não é possível prever com segurança respostas toxicológicos humanos 3. Por conseguinte, os testes in vitro de células humanas à base de cultura ganhou popularidade nos últimos dois décadas devido à sua relativamente baixade custos, maior produtividade e melhor representação de biodisponibilidade humana e toxicologia 4. Baseados em métodos de rastreio de cultura celular correntes toxicidade empregar vários parâmetros, tais como a medição de níveis de ATP, o rastreio da actividade de enzimas citoplasmáticos endogenamente disponíveis, sondando a integridade da membrana celular, ou o seguimento do nível de actividade mitocondrial, para avaliar a viabilidade celular 5 , 6. No entanto, independentemente da extremidade escolhido, estes métodos requerem a destruição da amostra antes da medição pode ser feita, portanto, apenas a produção de dados num único ponto de tempo. Como resultado, um grande número de amostras têm de ser preparados e tratados em paralelo para estudos toxicológicos básicos cinética, mais uma vez aumentando o custo e o trabalho necessários para o desenvolvimento de novos compostos. Em alternativa, os ensaios de luciferase utilizando secretada como Gaussia luciferase 7, Vargula luciferase 8 e 9 Metridia luciferasetêm sido desenvolvidos, que eliminam a necessidade de lise celular e necessitam de uma fracção dos meios para a medição de ponto de extremidade, no entanto, estes ainda estão limitados a amostragem em pontos de tempo predeterminados e também requerer a adição de substratos exógenos de luz de activação.
Para evitar o detrimento da destruição da amostra requerida, bem como para eliminar o custo de substratos, uma linha celular humana foi modificado que expressa a bioluminescência completo (lux), cassete do gene (luxCDABEfrp) para permitir a monitorização contínua de células vivas que é semelhante para imagens de células vivas com base fluorescente-dye, mas sem os procedimentos adicionais de investigação photon-ativadores e microscópica. Esta linha celular é capaz de constitutivamente produzindo um sinal óptico para a detecção contínua, directa, sem a necessidade de estimulação externa, evitando assim a destruição da amostra. Mecanisticamente, o sinal bioluminescente gerado a partir destas células resultars quando a enzima luciferase luxAB formada catalisa a oxidação de um aldeído gordos de cadeia longa (sintetizado e regenerado pelos produtos do gene luxCDE utilizando os substratos endógenos), na presença de riboflavina fosfato reduzido (FMNH 2, que é reciclada a partir de FMN pelo gene frp produto) e oxigénio molecular 10. A expressão da cassete de lux na célula hospedeira, por conseguinte, permite que a luz seja produzida e detectada sem destruição celular ou adição de substrato exógeno. Da mesma forma, a interação entre os genes lux ea FMN disponível endogenamente, e O dois co-substratos, bem como a exigência de manutenção de um ambiente capaz de suportar a conversão de FMN para FMNH 2, garante que o sinal bioluminescente resultante só pode ser detectada de viver as células activas metabolicamente.
Estes requisitos foram anteriormente explorados para demonstrar que lux-bassaída bioluminescente ed correlaciona fortemente com o tamanho da população celular 11 e que a exposição composto tóxico prejudica a produção autobioluminescent de uma forma dose-resposta 12. Aqui usamos um autobioluminescent rim embrionário humano previamente caracterizadas (HEK293) 11 linha de células para demonstrar a triagem automatizada toxicológico de um antibiótico da família da bleomicina com ADN conhecida actividade prejudicial como um exemplo representativo, para validar a aplicação de células de mamífero autobioluminescent para os ensaios de toxicidade.
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Protocol
1. Preparação celular
- Recuperar um frasco de bioluminescentes HEK293 de azoto estoque congelada líquido e fazê-los crescer em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 0,01 mM de aminoácidos não essenciais, 1 x antibiótico-antimicótico e 0,01 mM de piruvato de sódio num t 75 frascos de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO 2.
Nota: Os meios de comunicação e componentes complementares varia de acordo com linhas de células e, portanto, deve ser escolhido de acordo. - Atualizar média a cada 2-3 dias até atingir ~ 80% de confluência.
Nota: A quantidade de células necessárias irá basear-se no desenho experimental. Se necessário, mais as células podem ser obtidas por sub-culturas. - Células colheita para testes.
- Remover o meio e lava-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS), agitando suavemente o balão e, em seguida, descartando o gasto de PBS.
- Adicionar tripsina e incubar a 37 ° C durante 2 min,ou até que as células foram separadas do balão.
- Recolha das células isoladas com PBS e transferi-las para um tubo de centrífuga limpo.
Nota: Se as linhas de células não aderentes são usados, celas separadas por centrifugação e lave uma vez com PBS.
- Determinar a contagem total de células utilizando um hemacitómetro, ou outro sistema de contagem de células.
- Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em fresco, médio pré-aquecido.
- Sementes de igual número de células em poços individuais de uma placa multi-bem opaco. Neste exemplo, a placa 5 x 10 5 células em um mL de volume em cada poço de uma placa de 24 cavidades preta 1. Placa de um volume igual de meio em poços em triplicado para actuar como controlo negativo.
Nota: o número de células colocadas em cada poço, é flexível e pode ser optimizado para as experiências individuais. Para cada linha celular bioluminescente, determinar experimentalmente a relação entre o número de células e biolumiNESCent saída, bem como a célula mínima detectável contar antes de quaisquer testes de toxicidade. Para fazer isso, a bioluminescência medida através de uma vasta gama de tamanhos da população (por exemplo, 1 x outubro 3-01 x 10 6 culas) em condições padronizadas de imagem. - Tratar as células com o composto de teste (s), como descrito abaixo.
2. Preparação química
- Preparar o produto químico a ser testado como uma solução de reserva concentrada. Neste exemplo, o uso de 100 mg / ml de solução de um antibiótico da família da bleomicina.
Nota: Para minimizar os potenciais efeitos tóxicos à base de veículo, especialmente se um solvente orgânico é utilizado como um veículo para a adição de produtos químicos, recomenda-se que a concentração de Estoque ser de pelo menos 1000 vezes a concentração pós-aplicação desejada. - Adicionar o material químico preparado directamente para as células. Neste exemplo, a dose do antibiótico de interesse em concentrações finais de 100, 200, 300 e 400 ug / ml em triplicate poços. Adicione três poços de células não tratadas como controlos.
Nota: A concentração final do produto químico alvo devem ser selecionados com base em objetivos experimentais específicos. Uma vasta gama de concentrações é normalmente testados para obter um espectro completo dos efeitos tóxicos.
3. Imagem e Análise de Dados
- Imediatamente após a adição de produtos químicos, coloque a placa na câmara de imagem do instrumento adequado para aquisição de imagem e medição da bioluminescência.
- Bioluminescência de medida a cada 15 minutos ao longo de um período de 24 horas utilizando um tempo de integração de 10 minutos para cada leitura.
Nota: O tempo de integração usado neste exemplo é em uma base por placa e pode ser ajustado para a medição sobre uma base por poço usando outros luminómetros de escolha. O tempo de integração também podem ser ajustados com base na linha celular escolhida bioluminescente. Porque bioluminescência é produzida de forma autônoma sem destruição celular ou qualquer estímulo externo, lermentos podem ser tomadas em qualquer ponto de tempo desejado para cumprir objetivos experimentais específicos. - Quantificar a intensidade bioluminescente de cada poço através da identificação de uma região de interesse usando software compatível. Mostrar a saída de luz, quer como o fluxo total (fotões / segundo) ou a radiância média (fotões / segundo / cm steridian 2 /) de cada amostra.
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Representative Results
Neste estudo, a dinâmica de autobioluminescent as células HEK293 foram continuamente monitorizados ao longo de um período de 24 horas em resposta à exposição a antibióticos (Figura 1). Os efeitos tóxicos deste antibiótico, que é um membro da família de bleomicina conhecido por matar células vivas por ligação e clivagem de ADN 13, foram demonstradas por meio de um decréscimo na produção de bioluminescente em comparação com células não tratadas, o que pode ser visualizado directamente através das imagens pseudocoloridas (Figura 2). A natureza autobioluminescent destas células, o que permitiu o rastreio paralelo repetida de amostras sob variadas condições de tratamento, permitiu a comparação de diferentes concentrações em qualquer ponto no tempo de análise dose-resposta fácil. Por exemplo, a bioluminescência produzido a partir de células após 15 h, 18 h, e 20 h de tratamento foi representada graficamente contra as concentrações químicas na Figura 3, que mostra que o aumento resul tratamento antibióticoted na redução da produção de bioluminescente de uma maneira dose-resposta.
Figura 1. Acompanhamento contínuo da dinâmica bioluminescentes em resposta a exposição a substâncias químicas. Constitutivamente bioluminescentes células HEK293 foram expostas a várias concentrações de um antibiótico da família da bleomicina. Produção bioluminescente foi monitorada durante um período de 24 horas de exposição (dados representativos para triplicatas técnicas sobre um prato, média ± erro padrão) (reimpressão de 14).
Figura 2. Imagens pseudo das células tratadas.
Figura 3. Dose-resposta de exposição química. Bioluminescente A saída após 15 h, 18 h, e 20 h de exposição demonstraram que o aumento tratamento antibiótico resultou na redução da produção de luz de uma forma dose-resposta (dados representativos dos triplicados técnicos sobre uma placa, significa ± erro padrão). Valor de R 2 é calculado para a regressão linear.
Tabela 1. Comparação representativas datela toxicidade demonstrada usando quer autobioluminescent células humanas (baseados lux) ou uma luciferase de pirilampo tradicional (luc) baseado num ensaio de formato de placa de 96 poços.
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Discussion
Este método demonstra o uso de células de mamíferos bioluminescentes autonomamente como um ensaio de rastreio de citotoxicidade in vitro que permite que as células vivas de ser monitorada continuamente durante a sua vida. Este protocolo é flexível e pode ser modificado para acomodar condições experimentais específicas, conforme necessário. Por exemplo: a experiência aqui apresentada é apropriada para rastrear os efeitos tóxicos agudos, mas pode ser adaptado para avaliar efeitos de actuação lenta ou longa duração por imagiologia repetidamente em intervalos de tempo muito maior (isto é, cada 24 horas), e mantendo as células sob condições de incubação padrão entre leituras. Além disso, o tempo de integração pode ser ajustada com base na linha celular bioluminescente. Uma experiência preliminar da imagiologia com vários tempos de integração podem ser realizados para determinar a janela de leitura optimizada. A integração de 10 min usado neste exemplo foi escolhido para realçar a gama dinâmica da produção bioluminescente em todos tratamentcondições t, no entanto, um quadro de leitura mais curto pode ser aplicada, dependendo da aplicação. Da mesma forma, enquanto uma placa de 24 poços é usado para demonstração, neste exemplo, 96 - placas de 384-poços ou pode ser substituído para aplicações de transferência mais elevadas. Embora os resultados representativos apresentados aqui demonstram triplicados técnicos em um único prato, É importante notar que os ensaios independentes em placas de diferentes devem ser realizados para determinar a significância estatística entre os níveis de tratamento quando o teste de um composto de interesse. Além disso, porque este ensaio pode ser adaptado para utilização numa variedade de instrumentos com diferentes sensibilidades de detecção, é recomendável que a relação sinal-ruído e de sinal para fundo aceitáveis deve ser determinada numa base por instrumento.
Foi previamente determinado que o número de células mínima detectável em uma placa de 24 poços foi de aproximadamente 1,5 x 4 10 células, nas condições aqui descritas de imagem 15.No entanto, é importante notar que o número mínimo de células necessário para a detecção fiável varia com o tamanho do poço, e que o uso de poços menores reduz o número de células necessário para a detecção através do aumento do número de células por unidade de área bioluminescentes. Portanto, é altamente recomendável que a relação entre a saída bioluminescente e tamanho da população ser determinada nas condições de imagem desejados antes de triagem. Além disso, um leitor de placas à base de tubo fotomultiplicador, também podem ser utilizados para a aquisição de dados em vez do sistema de imagiologia IVIS Lumina, mas em detrimento da obtenção de imagens pseudocoloridas. Independentemente de o instrumento de imagem utilizada, uma placa opaca deve ser utilizado para minimizar a perda de sinal e / ou a contaminação bioluminescente de poços adjacentes devido a fotões que atravessam a placa.
Comparado com outras células geralmente empregues abordagens baseadas em cultura, este método oferece a vantagem de que a aquisição de dados pode ser performed de uma forma totalmente automatizada desde que a necessidade de destruição ou de adição do substrato da amostra é eliminada. Além disso, permite o acompanhamento contínuo dos efeitos dinâmicos sobre a mesma população de células ao longo de um período prolongado de exposição, o que proporciona uma melhor resolução da cinética toxicológicos sem o concomitante aumento nos custos monetários ou tempo que decorra ao utilizar a lise celular, que exigem métodos ( Tabela 1). No entanto, uma importante limitação deste método é que a célula de teste de tipo específico exigirá a transfecção estável da caixa lux em cada tipo de células de interesse, a fim de gerar um fenótipo autobioluminescent para triagem. Apesar de apenas ser realizada a essa necessidade, uma vez desde que as células podem subsequentemente ser armazenados em azoto líquido para uso futuro, o procedimento de transfecção é uma tarefa potencialmente demorado.
Apesar desta condição, o protocolo aqui descrito é simples e barato, requerems mínimo hands-on de trabalho do pessoal de laboratório, não necessita de quaisquer reagentes adicionais, e gera dados que podem ser usados diretamente para a interpretação toxicológico. Por estas razões, conclui-se que linhas celulares de mamíferos autobioluminescent pode ser utilizado como um ensaio de elevado débito para o rápido rastreio preliminar de um grande número de candidatos para seleccionar compostos que necessita de uma avaliação mais pormenorizada a jusante.
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Disclosures
DM Close, SA Ripp, e GS Sayler são fundadores e proprietários de 490 BioTech, Inc.
Acknowledgments
Estes esforços de pesquisa foram apoiadas pela Divisão de Ciência da Fundação Nacional de Química, Bioengenharia, ambiental e sistemas de transporte (CBET) sob os números prêmio Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental (NIEHS) CBET e CBET-0853780-1159344 e do National Institutes of Health, sob o número prêmio 1R43ES022567-01, e do Instituto Nacional do Câncer, do Programa de Imagem Câncer sob o número prêmio CA127745-01. O IVIS Lumina instrumento utilizado neste trabalho foi obtido a partir do Programa de Instrumentação Exército dos EUA Defense University Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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