Summary
Млекопитающих, клетки, экспрессирующие кассеты бактериальный ген биолюминесценции (
Abstract
Млекопитающих клеточной основанный в анализах пробирке были широко использованы в качестве альтернативы тестированию на животных для токсикологических исследований, но были ограничены из-за высоких затратах времени и денег параллельных пробоподготовки, которые необходимым из-за деструктивный характер люциферазы светлячка основе методы скрининга . Это видео описывает использование автономно биолюминесцентного клетки млекопитающих, которые не требуют разрушительной добавлением субстрата люциферин, как недорогой и легкий способ мониторинга цитотоксические эффекты соединение, представляющее интерес. Клетки млекопитающих, стабильно экспрессирующих полный бактериальный биолюминесценции (luxCDABEfrp) генной кассеты, автономно производить оптический сигнал, что пики при 490 нм без добавления дорогих и, возможно мешающего люциферин подложки, возбуждение от внешнего источника энергии или разрушение образца, который традиционно выполняется во время процедуры оптических изображенийс. Эта независимость от внешней стимуляции возлагает для поддержания биолюминесцентного реакции только на клетки, а это означает, что результирующий сигнал обнаруживается только во время активного метаболизма. Эта характеристика делает люкс-клеточной линии, экспрессирующей превосходным кандидатом для использования в качестве biosentinel против цитотоксических эффектов из-за изменений в биолюминесцентного производства свидетельствуют о неблагоприятное воздействие на клеточный рост и метаболизм. Кроме того, автономный характер и отсутствие необходимых разрушения образца позволяет повторять изображений одного и того же образца в режиме реального времени на протяжении всего периода воздействия токсических веществ и может быть выполнена в нескольких образцах с использованием существующего оборудования изображений в автоматическом режиме.
Introduction
В США, фармацевтических препаратов и других продуктов, предназначенных для потребления человеком, требуют обширных оценки до их утверждения для использования потребителем по контролю за продуктами и лекарствами. Финансовое бремя для выполнения этого тестирования находится на 1 разработчика, что существенно увеличивает стоимость разработки новых соединений и, следовательно, приводит к увеличению стоимости для потребителей. Хотя традиционно большая часть этого скрининга использовали животных, когда их действовать в качестве прокси для человека хозяев, это оказалась большая финансовая нагрузка, по оценкам, 2,8 миллиарда долларов ежегодно тратятся на ADME / Токе (адсорбция, распределение, метаболизм, экскреция и токсичность ) скрининг Alone 2 и монтаж доказательств того, что животные модели не могут достоверно предсказать человека токсикологических ответов 3. Таким образом, в пробирке клетки человека культуры на основе тестирования приобрел популярность в течение последних двух десятилетий из-за его относительно низкуюстоимость, более высокую пропускную способность, и лучшего представления человека биодоступность и токсикологии 4. Текущий клеточной культуре методов, основанных на токсичность скрининга используют различные конечные точки, такие, как измерение уровней АТФ, скрининг активности эндогенной доступны цитоплазматические ферменты, зондирование целостность клеточной мембраны, или отслеживание уровня активности митохондрий для оценки жизнеспособности клеток пять , 6. Однако, независимо от конечной точки выбраны, эти методы требуют разрушения образца до измерения могут быть приняты, при этом производит только данные в одной точке времени. В результате большое количество образцов должны быть подготовлены и обрабатывают параллельно для основных токсикологических исследований кинетики, опять же к увеличению стоимости труда и необходимых для развития нового соединения. Кроме того, анализов с помощью секретируемых люциферазы, такие как Gaussia люциферазы 7, Vargula люциферазы 8 и 9 Метридиумы люциферазыБыли разработаны, что устраняет необходимость лизиса клеток и требуют фракцию носителя для конечной точки измерения, однако, они все еще ограничено выборки в заданных точках времени, а также требует добавления экзогенного свет активирующий субстратов.
Чтобы избежать ущерб необходимой разрушение образца, а также устранить затраты на подложках, линии клеток человека была разработана, который выражает полную бактериальной биолюминесценции (люкс) генной кассеты (luxCDABEfrp) для обеспечения непрерывного мониторинга живых клеток, который похож для флуоресцентных красителей на основе изображений живых клеток, но без дополнительных фотонов активирующих и микроскопические процедуры расследования. Эта клеточна лини способна конститутивно производства оптического сигнала для непрерывного прямого обнаружения без необходимости внешней стимуляции, что позволяет избежать разрушения образца. Механистически биолюминесцентного сигнала, генерируемого из этих клеток приводитх годов, когда luxAB сформированный люциферазы фермент катализирует окисление длинноцепочечных жирных альдегида (синтезированы и регенерируют luxCDE продуктов гена с использованием эндогенных субстратов) в присутствии пониженной рибофлавин фосфат (FMNH 2, который рециркулируют из FMN геном, FRP Продукт) и молекулярного кислорода 10. Экспрессия люкс кассеты в клетку-хозяина таким образом позволяет свету быть произведены и обнаружить без клеточной деструкции или экзогенный того подложки. Кроме того, взаимодействие между лк генов и эндогенно доступны FMN и O 2 cosubstrates, и потребность в поддержании среды, которая может поддерживать преобразование FMN в FMNH 2, гарантирует, что полученное биолюминесцентного сигнала могут быть обнаружены только у живых , метаболически активные клетки.
Эти требования были ранее использованы, чтобы продемонстрировать, что люкс-BasЭд биолюминесцентными выходе сильно коррелирует с сотовыми численности населения, что 11 и токсического воздействия соединений ухудшает autobioluminescent производства в доза-реакция моды 12. Здесь мы используем ранее характеризуется autobioluminescent эмбриональной почки человека (НЕК 293), клеточную линию 11 для демонстрации автоматизированной токсикологические скрининг антибиотика блеомицина семьи с известными ДНК повреждающим активность в качестве представительного примера для проверки применения autobioluminescent клетках млекопитающих для испытаний на токсичность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеток
- Восстановление флакон биолюминесцентного НЕК293 из жидкого азота замороженного и выращивают их в среде Игла, модифицированную по Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 0,01 мМ заменимых аминокислот, 1 антибиотикам противогрибковым и 0,01 мМ пирувата натрия в Т 75 культуре ткани колбы при 37 ° С и 5% СО 2.
Примечание: Средства массовой информации и дополнительные компоненты, зависит от клеточных линий и, следовательно, должны быть выбраны соответственно. - Обновить среды каждые 2-3 дня до достижения ~ 80% слияния.
Примечание: количество клеток необходимо будет основано на эксперимента. При необходимости более клетки могут быть получены путем пересева. - Урожай клетки для тестирования.
- Удалить среды и промыть клетки забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), осторожно закрученных колбу и затем отбрасывание отработанного PBS.
- Добавить трипсина и инкубировали при 37 ° С в течение 2 мин,или пока клетки не были отделены от колбы.
- Сбор отдельных клеток в PBS и передавать их в чистую пробирку центрифуги.
Примечание: Если не прилипшие клеточных линий используются отдельные клетки центрифугированием и промывают один раз PBS.
- Определение общего количества клеток с использованием гемацитометра или другой системы подсчета клетки.
- Центрифуга клеточной суспензии при 300 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в свежей, предварительно нагретой среде.
- Семенной равное число клеток в отдельные лунки из непрозрачного мульти-луночный планшет. В этом примере пластина 5 × 10 5 клеток в объеме 1 мл в каждую лунку черный 24-луночный планшет. Пластина равный объем среды в трех лунках в качестве отрицательного контроля.
Примечание: число клеток высевали в каждую лунку является гибким и может быть оптимизирована для отдельных экспериментов. Для каждого биолюминесцентными клеточной линии, экспериментально определить соотношение между числом клеток и bioluminescent выход, а также минимальный обнаруживаемый клетки считать до любых тестов на токсичность. Чтобы сделать это, мера биолюминесценции в широком диапазоне размеров популяции (например, 1 × 10 -3 до 1 × 10 6 клеток) в стандартных условиях изображений. - Лечение клетки с тестированием соединения (соединений), как описано ниже.
2. Химической подготовки
- Подготовьте химических проходит испытания в виде концентрированного раствора. В этом примере используют 100 мг / мл маточного раствора антибиотика блеомицина семьи.
Примечание: Для минимизации потенциальных транспортного средства на основе токсические эффекты, особенно если органический растворитель используют в качестве средства для химической того, рекомендуется, чтобы исходной концентрации по меньшей мере в 1000 раз нужного после приложения концентрации. - Добавить подготовленную запас химических непосредственно к клеткам. В этом примере доза антибиотика интерес в конечной концентрации 100, 200, 300 и 400 мкг / мл в трискладчатый скважин. Оставьте трех скважин клеток необработанными в качестве контроля.
Примечание: Конечная концентрация целевой химический должны быть выбраны на основе конкретных экспериментальных целей. Широком диапазоне концентраций, как правило, испытания для получения полного спектра токсические эффекты.
3. Обработки изображений и анализа данных
- Сразу же после химической того, поместите пластину в визуализации палаты подходящим инструментом для получения изображения и измерения биолюминесценции.
- Измерение биолюминесценции каждые 15 минут в течение 24 часов периода использования 10 мин Время интегрирования для каждого чтения.
Примечание: время интегрирования использованы в этом примере, для каждой пластины основы и может быть отрегулирован для измерения для каждого а основе с использованием других люминометров выбора. Время интегрирования также может быть скорректирована в зависимости от выбранного биолюминесцентными клеточной линии. Потому биолюминесценции производится автономно без разрушения клеток или любой внешней стимуляции, читатьIngs может быть принято в любой желаемый момент времени для выполнения конкретных экспериментальных целей. - Количественная оценка интенсивности биолюминесценции из каждой лунки путем определения области интересов использовании совместимого программного обеспечения. Отображение светового потока либо в виде общего потока (фотонов / сек) или средний блеск (фотонов / сек / см 2 / steridian) каждого образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании, динамика autobioluminescent НЕК293 наблюдали непрерывно в течение периода 24 ч в ответ на воздействие антибиотиков (рис. 1). Токсическое действие этого антибиотика, который является членом семейства, известного блеомицин, чтобы убить живых клеток путем связывания с ДНК и расщепление 13, были продемонстрированы с помощью биолюминесцентного снижение производства по сравнению с необработанными клетками, которые могут быть непосредственно визуализировали посредством псевдо изображения (рис. 2). Autobioluminescent природа этих клеток, что позволило повторный скрининг параллельно образцов при различных условиях обработки, разрешено для сравнения различных концентраций в любой данный момент времени, для легкого доза-ответ анализа. Например, биолюминесценции получают из клеток после 15 ч, 18 ч и 20 ч обработки наносили на график против концентрации химического вещества на рисунке 3, показывает, что увеличение антибиотик РЕЗУЛЬТАТОВ лечениеTed в снижении биолюминесцентного производства в доза-ответ способом.
Рисунок 1. Непрерывное отслеживание биолюминесцентного динамика в ответ на воздействие химических веществ. Конститутивно биолюминесцентного НЕК293 клетки подвергали воздействию различных концентраций антибиотика блеомицина семьи. Биолюминесцентный производство контролировали в течение 24 часового периода воздействия (репрезентативные данные по техническим трижды на одной пластине, среднее ± стандартная ошибка) (перепечатка из 14).
Рисунок 2. Псевдоцвет изображений обработанных клеток.
Рисунок 3. Доза-ответ от химического воздействия. Биолюминесцентного выход через 15 ч, 18 ч и 20 ч экспозиции показали, что увеличение антибиотиков привело к уменьшению продукции легкой доза-отклик способом (репрезентативных данных по технической трех повторах на одной пластине, среднее ± стандартная ошибка). R 2 значение рассчитывается для линейной регрессии.
Таблица 1. Представитель сравнениевыраженной токсичности экране с использованием либо autobioluminescent (люкс основе) клетки человека или традиционный люциферазы светлячка (Luc) на основе анализа в 96-луночного планшета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод демонстрирует использование автономно биолюминесцентного клетках млекопитающих, как в пробирке цитотоксичность скрининга, который позволяет живых клеток в постоянно контролироваться в течение жизни. Этот протокол является гибкой и может быть модифицирована для конкретных условий эксперимента, как требуется. Так, например, эксперимента, представленные здесь, подходит для отслеживания острых токсических эффектов, но может быть адаптирован для оценки замедленного действия или долгосрочные эффекты путем многократного изображения повышенного интервалы времени (например, каждые 24 ч) и поддержании клеток в стандартных условиях инкубации между чтениях. Кроме того, время интегрирования может быть скорректирован на основе биолюминесцентными клеточной линии. Предварительный эксперимент с различными изображениями раз интеграция может быть выполнен, чтобы определить оптимальное окно чтения. 10 мин интеграции используемый в этом примере была выбрана, чтобы выделить динамический диапазон биолюминесцентного производства во всех ЛЕЧЕНИИт условиях, однако короче рамка считывания может быть применен в зависимости от применения. Аналогичным образом, в то время как 24-луночный планшет используется для демонстрации в этом примере 96 - или 384-луночных планшетах может быть заменен на более высокую производительность приложений. Несмотря на то, репрезентативные результаты, показанные здесь демонстрируют технический трех повторах на одной пластине, важно отметить, что независимых анализов на различные пластины должны быть выполнены, чтобы установить статистическую значимость между обработкой уровней при тестировании соединений, представляющих интерес. Кроме того, поскольку этот анализ может быть адаптирован для использования в различных инструментов с различной чувствительности обнаружения, рекомендуется, чтобы приемлемый сигнал-шум и сигнал-фону должен быть определен для каждого инструмента основе.
Ранее было установлено, что минимально обнаруживаемое количество клеток в 24-луночный планшет был приблизительно 1,5 × 10 4 клеток при визуализации условиях, описанных здесь 15.Однако, важно отметить, что минимальное число клеток, необходимых для надежного обнаружения варьируется в зависимости от размера скважины, и что использование меньшего скважины снижает количество клеток необходимы для обнаружения путем увеличения количества биолюминесцентного клеток на единицу площади. Поэтому настоятельно рекомендуется, что отношения между биолюминесцентными производства и численности населения определяется в соответствии желаемых условий изображений до скрининга. Кроме того, фотоэлектронный умножитель на основе планшет-ридере также могут быть использованы для получения данных вместо системы ИВИС Lumina изображений, но в ущерб получение псевдо изображений. Независимо от изображений инструмент работает, непрозрачной пластины должны быть использованы для минимизации потери сигнала и / или биолюминесцентного загрязнения соседних скважин за счет фотонов перемещения пластины.
По сравнению с другими обычно используемыми культуры клеток подходов, этот способ имеет то преимущество, что сбор данных может быть Performeг в полностью автоматическом режиме, так как необходимость разрушения образца или подложки того, устраняется. Она также обеспечивает непрерывное отслеживание динамических эффектов на той же клеточной популяции в течение длительного периода воздействия, которое обеспечивает улучшенное разрешение токсикологических кинетика без одновременного увеличения денежных или временных затрат, необходимость в которых при использовании лизиса клеток-требующий методов ( таблица 1). Однако важным недостатком этого способа является то, что клетки определенного типа тестирования потребует стабильной трансфекции кассеты люкс в каждого типа клеток интерес для того, чтобы генерировать autobioluminescent фенотип для скрининга. Хотя эта потребность быть выполнена только один раз, поскольку эти клетки могут быть затем хранили в жидком азоте для будущего использования, трансфекции процедура является потенциально трудоемкой работе.
Несмотря на это условие, протокол, изложенные здесь, является простым и недорогим, требующиес минимальной практической работы от персонала лаборатории, не требует никаких дополнительных реагентов и генерирует данные, которые могут быть использованы непосредственно для токсикологических интерпретации. По этим причинам заключаем, что autobioluminescent клеточных линий млекопитающих может быть использована как с высокой пропускной способностью анализа для быстрого предварительного скрининга большого количества кандидатов для выбора соединений, которые требуют более детального ниже оценки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Закрыть DM, SA Ripp и GS Sayler являются учредителями и владельцами 490 BioTech, Inc
Acknowledgments
Эти попытки исследователей были при поддержке Национального научного фонда отдела химической промышленности, биоинженерии, охране окружающей среды и транспорта (CBET) Системы под номерами награду CBET-0853780 и 1159344-CBET и Национальный институт здоровья, Национальный институт гигиены окружающей среды (NIEHS) под награду числа 1R43ES022567-01, а также Национального института рака, визуализации рака программы в рамках премии числа CA127745-01. Прибор ИВИС Lumina использованы в этой работе была получена из армии США университета обороны Инструменты программы исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
