Summary
Las células de mamífero que expresan el casete del gen bioluminiscencia bacteriana (
Abstract
Células de mamíferos basado en ensayos in vitro han sido ampliamente empleada como alternativas a los ensayos con animales para los estudios toxicológicos, pero se han limitado debido a los altos costos monetarios y el tiempo de preparación de la muestra paralela que se hicieron necesaria debido a la naturaleza destructiva de los métodos de detección basados en luciferasa de luciérnaga . Este video describe la utilización de células de mamíferos bioluminiscentes forma autónoma, que no requiere la adición destructiva de un sustrato de luciferina, como un método económico y fácil para el seguimiento de los efectos citotóxicos de un compuesto de interés. Las células de mamífero que expresan establemente la bioluminiscencia bacteriana completo (luxCDABEfrp) casete del gen autónoma producen una señal óptica que picos a 490 nm sin la adición de un sustrato de luciferina caro y posiblemente interferir, de excitación por una fuente de energía externa, o la destrucción de la muestra que es tradicionalmente realizado durante el procedimiento de formación de imágenes ópticass. Esta independencia de la estimulación externa coloca la carga para el mantenimiento de la reacción bioluminiscente únicamente en la célula, lo que significa que la señal resultante sólo se detecta durante el metabolismo activo. Esta característica hace que la línea de células de lux que expresan un excelente candidato para el uso como un biosentinel contra los efectos citotóxicos debido a cambios en la producción bioluminiscente son indicativos de efectos adversos sobre el crecimiento celular y el metabolismo. Del mismo modo, el carácter autónomo y la falta de la destrucción de la muestra requerida permite formación de imágenes repetidas de la misma muestra, en tiempo real durante todo el período de exposición tóxica y se pueden realizar a través de múltiples muestras de imagen utilizando el equipo existente de forma automatizada.
Introduction
En los EE.UU., los productos farmacéuticos y otros productos destinados al consumo humano requieren una evaluación extensiva antes de que sean aprobados para su uso por el consumidor por la Administración de Alimentos y Drogas. La carga financiera para la realización de esta prueba se coloca en el desarrollador de 1, lo que aumenta sustancialmente el coste de desarrollo compuesto nuevo y por lo tanto, se traduce en un aumento de coste para los consumidores. Si bien tradicionalmente la mayor parte de este examen ha utilizado materias animales para actuar como representantes de los huéspedes humanos, esto ha demostrado ser una gran carga financiera, con un estimado de 2,8 mil millones dólares gastados anualmente en ADME / Tox (absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad ) seleccionar solo 2 y la creciente evidencia que sugiere que los modelos animales no pueden predecir con certeza las respuestas toxicológicas humanos 3. Por lo tanto, las pruebas basadas en el cultivo de células humanas in vitro se ha ganado popularidad en las últimas dos décadas debido a su relativamente bajacoste, mayor rendimiento y una mejor representación de la biodisponibilidad humana y toxicología 4. Los métodos de cribado de toxicidad basada en el cultivo de células actuales emplean diversos criterios de valoración, tales como la medición de los niveles de ATP, la detección de la actividad de las enzimas citoplasmáticas endógenamente disponibles, el sondeo de la integridad de la membrana celular, o el seguimiento del nivel de la actividad mitocondrial, para evaluar la viabilidad celular 5 , 6. Sin embargo, independientemente del punto final elegido, todos estos métodos requieren la destrucción de la muestra antes de las mediciones se pueden tomar, por tanto, sólo la producción de datos en un solo punto de tiempo. Como resultado de ello, un gran número de muestras tienen que ser preparados y tratados en paralelo para estudios básicos cinética toxicológicos, de nuevo añadiendo al coste y mano de obra requerida para el nuevo desarrollo compuesto. Alternativamente, los ensayos de luciferasa utilizando secretadas tales como luciferasa Gaussia 7, luciferasa de Vargula 8, 9 y Metridia luciferasase han desarrollado que elimina la necesidad de la lisis celular y requiere una fracción de los medios de comunicación para la medición de la variable, sin embargo, éstos están todavía se limita a muestreo en puntos de tiempo predeterminados y también requiere la adición de sustratos exógenos luz de activación.
Para evitar el detrimento de la destrucción de la muestra requerida, así como para eliminar el costo de sustratos, una línea celular humana ha sido diseñado que expresa la bioluminiscencia bacteriana completo (lux) casete del gen (luxCDABEfrp) para permitir la monitorización continua de células vivas que es similar de imágenes de células vivas fluorescente basado-dye, pero sin los procedimientos de investigación de fotones que activan y microscópicas adicionales. Esta línea celular es capaz de producir constitutivamente una señal óptica para la detección continua, directa y sin la necesidad de la estimulación externa, evitando así la destrucción de la muestra. Mecánicamente, la señal bioluminiscente generada a partir de estas células como resultados cuando la enzima luciferasa luxAB formado cataliza la oxidación de un aldehído graso de cadena larga (sintetizado y regenerado por los productos de los genes luxCDE usando sustratos endógenos) en presencia de la reducción de fosfato de riboflavina (FMNH 2, que se recicla desde FMN por el gen FRP producto) y oxígeno molecular 10. Por lo tanto, la expresión del casete de lux en la célula huésped permite que la luz a ser producido y detectado sin la destrucción celular o adición de sustrato exógeno. Del mismo modo, la interacción entre los genes lux y el FMN disponibles endógenamente, y O 2 co-sustratos, y los requisitos de mantenimiento de un entorno que puede apoyar la conversión de FMN a FMNH 2, asegura que la señal bioluminiscente resultante sólo puede ser detectado de vivir , las células metabólicamente activas.
Estos requisitos previamente han sido explotados para demostrar que lux-bassalida ed bioluminiscente se correlaciona fuertemente con tamaño de la población celular 11 y que la exposición compuesto tóxico perjudica la producción autobioluminescent de una manera dosis-respuesta 12. Aquí se utiliza un autobioluminescent de riñón embrionario humano previamente caracterizado (HEK293) línea celular 11 para demostrar la detección toxicológica automatizado de un antibiótico de la familia de la bleomicina con conocida actividad que daña el ADN como un ejemplo representativo para validar la solicitud de células de mamífero autobioluminescent para las pruebas de toxicidad.
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Protocol
1. Preparación de células
- Recuperar un vial de células bioluminiscentes HEK293 de nitrógeno líquido stock congelado y crecer en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino, mM de aminoácidos no esenciales 0,01, 1x antibiótico-antimicótico, y 0,01 mM de piruvato de sodio en un T 75 frasco de cultivo de tejidos a 37 º C y 5% de CO 2.
Nota: Los medios de comunicación y componentes complementarios pueden variar dependiendo de las líneas de células y por lo tanto deben ser elegidos en consecuencia. - Actualizar medio cada 2-3 días hasta alcanzar ~ 80% de confluencia.
Nota: La cantidad de células necesarias se basa en el diseño experimental. Si es necesario, más células pueden obtenerse a través de subcultivo. - Células de la cosecha para la prueba.
- Retirar el medio y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) girando suavemente el matraz y luego desechar el estado de PBS.
- Añadir tripsina e incubar a 37 ° C durante 2 min,o hasta que las células se separaron del matraz.
- Recoger las células desprendidas en PBS y transferirlos a un tubo de centrífuga limpio.
Nota: Si las líneas celulares adherentes se utilizan, las células separadas por centrifugación y se lavan una vez con PBS.
- Determinar el recuento total de células utilizando un hemocitómetro o de otro sistema de recuento de células.
- Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en medio fresco, precalentado.
- Semillas igual número de células en pocillos individuales de una placa de múltiples pocillos opaca. En este ejemplo, la placa de 5 x 10 5 células en un volumen de 1 ml en cada pocillo de una placa de 24 pocillos negro. Placa de un volumen igual de medio en pocillos por triplicado para actuar como el control negativo.
Nota: El número de células sembradas en cada pocillo es flexible y puede ser optimizado para los experimentos individuales. Para cada línea celular bioluminiscente, determinar experimentalmente la relación entre el número de células y biolumiNESCent de salida, así como la célula mínima detectable cuentan antes de ningún ensayo de toxicidad. Para ello, la medida de bioluminiscencia en una amplia gama de tamaños de población (por ejemplo, 1 x 10 03 al 1 x 10 6 células) en condiciones de formación de imágenes estandarizadas. - Tratar las células con el compuesto de ensayo (s) según se describe a continuación.
2. Preparación química
- Preparar la sustancia estudiada como una solución madre concentrada. En este ejemplo, utilizar una 100 mg / ml de solución madre de un antibiótico de la familia de la bleomicina.
Nota: Para reducir al mínimo los posibles efectos tóxicos vehículo a base de, especialmente si un disolvente orgánico se utiliza como un vehículo para la adición de productos químicos, se recomienda que la concentración de solución madre sea de al menos 1000 veces la concentración después de la aplicación deseada. - Añadir el caldo de química preparada directamente a las células. En este ejemplo, la dosis del antibiótico de interés a concentraciones finales de 100, 200, 300, y 400 mg / ml en triplicar pozos. Agregar tres pocillos de células no tratadas como controles.
Nota: La concentración final de la sustancia química objetivo se debe seleccionar sobre la base de los objetivos experimentales específicas. Una amplia gama de concentraciones se prueba normalmente para obtener un espectro completo de los efectos tóxicos.
3. Imágenes y Análisis de Datos
- Inmediatamente después de la adición de productos químicos, coloque la placa en la cámara de imágenes de instrumento adecuado para la adquisición de imágenes y la medición de bioluminiscencia.
- Medida bioluminiscencia cada 15 minutos durante un período de 24 horas con un tiempo de 10 min de integración para cada lectura.
Nota: El tiempo de integración utilizado en este ejemplo es en una base por placa y se puede ajustar para la medición en una base por pocillos usando otros luminómetros de elección. El tiempo de integración también se puede ajustar sobre la base de la línea de células bioluminiscente elegido. Debido a que la bioluminiscencia se produce autónomamente sin la destrucción de células o ninguna estimulación externa, leernes se pueden tomar en cualquier punto en el tiempo que desee para cumplir con los objetivos experimentales específicas. - Cuantificar la intensidad bioluminiscente de cada pocillo mediante la identificación de una región de interés utilizando software compatible. Muestra la salida de luz, ya sea como el flujo total (fotones / segundo) o la luminosidad media (fotones / segundo / cm steridian 2 /) de cada muestra.
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Representative Results
En este estudio, la dinámica de las células HEK293 autobioluminescent se monitorizaron continuamente durante un período de 24 horas en respuesta a la exposición a antibióticos (Figura 1). Los efectos tóxicos de este antibiótico, que es un miembro de la familia bleomicina sabido para matar a las células vivas mediante la unión a, y escisión de ADN 13, se demostraron a través de una disminución en la producción bioluminiscente en comparación con las células no tratadas, que puede ser visualizado directamente a través de las imágenes pseudocolor (Figura 2). La naturaleza autobioluminescent de estas células, lo que permitió la proyección paralela repetida de las muestras bajo diferentes condiciones de tratamiento, permitió la comparación de diferentes concentraciones en cualquier punto del tiempo dado para facilitar el análisis de dosis-respuesta. Por ejemplo, la bioluminiscencia producida a partir de las células después de 15 h, 18 h, y 20 h de tratamiento se representó frente a las concentraciones químicas en la Figura 3, que muestra que el aumento de Resul tratamiento antibióticoTed en la reducción de la producción bioluminiscente en una manera dosis-respuesta.
Figura 1. Seguimiento continuo de la dinámica de bioluminiscentes en respuesta a la exposición química. Constitutivamente células bioluminiscentes HEK293 fueron expuestas a varias concentraciones de un antibiótico de la familia de la bleomicina. Producción bioluminiscente se controló durante un período de 24 h de exposición (datos representativos para triplicados técnicos sobre un plato, media ± error estándar) (reimpresión del 14).
Figura 2. Imágenes Pseudocolor de las células tratadas.
Figura 3. Dosis-respuesta de la exposición química. La salida bioluminiscente después de 15 h, 18 hy 20 h de exposición mostró que el aumento de un tratamiento antibiótico resultó en la reducción de la producción de luz de una manera dosis-respuesta (datos representativos de triplicados técnicos sobre un plato, media ± error estándar). R 2 valor se calcula por regresión lineal.
Tabla 1. Comparación de Representante de lapantalla de toxicidad demostrado utilizando ya sea autobioluminescent (lux) a base de células humanas o un tradicional luciferasa de luciérnaga (luc) ensayo basado en un formato de placa de 96 pocillos.
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Discussion
Este método demuestra el uso de células de mamíferos bioluminiscentes forma autónoma como un ensayo de cribado de citotoxicidad in vitro que permite a las células en vivo para ser controlados continuamente durante toda su vida en. Este protocolo es flexible y puede ser modificado para adaptarse a las condiciones experimentales específicas según se requiera. Por ejemplo, el experimento que aquí se presenta es adecuado para el seguimiento de los efectos tóxicos agudos, pero puede ser adaptado para evaluar los efectos de acción lenta o a largo plazo por el aumento de formación de imágenes repetidas veces en intervalos de tiempo (es decir, cada 24 horas) y el mantenimiento de las células bajo condiciones de incubación estándar entre lecturas. Además, el tiempo de integración se puede ajustar sobre la base de la línea de células bioluminiscente. Un experimento preliminar de formación de imágenes con diferentes tiempos de integración se puede realizar para determinar la ventana de lectura óptima. La integración 10 min usado en este ejemplo fue elegido para resaltar el rango dinámico de la producción bioluminiscente en todos TreatmenCondiciones de T, sin embargo, un marco de lectura más corto se pueden aplicar dependiendo de la aplicación. Del mismo modo, mientras que una placa de 24 pocillos se utiliza para la demostración en este ejemplo, 96 - placas de 384 pocillos o pueden ser sustituidos para las aplicaciones de mayor rendimiento. Aunque los resultados representativos mostrados aquí demuestran triplicados técnicas sobre una sola placa, es importante tener en cuenta que los ensayos independientes en diferentes placas deben ser realizadas para establecer la significación estadística entre los niveles de tratamiento cuando se prueba un compuesto de interés. Por otra parte, debido a este ensayo se puede adaptar para su uso en una variedad de instrumentos con diferentes sensibilidades de detección, se recomienda que la señal-a-ruido y señal a fondo proporciones aceptables deben determinarse en una base por-instrumento.
Se determinó previamente que el número de células mínima detectable en una placa de 24 pocillos fue de aproximadamente 1,5 x 10 4 células en las condiciones de formación de imágenes descritos aquí 15.Sin embargo, es importante tener en cuenta que el número mínimo de células requeridas para la detección fiable varía con el tamaño así, y que el uso de pozos más pequeñas reduce el número de células necesarias para la detección mediante el aumento del número de células bioluminiscentes por unidad de área. Por lo tanto, se recomienda que la relación entre la producción y el tamaño de la población bioluminiscente se determinará en las condiciones de la imagen que desee antes de la selección. Además, un lector de placas de tubo fotomultiplicador basado también puede ser utilizado para la adquisición de datos en lugar del sistema de formación de imágenes IVIS Lumina, pero en detrimento de la obtención de imágenes pseudocolor. Independientemente del instrumento de formación de imágenes empleado, una placa opaca se debe utilizar para minimizar la pérdida de señal y / o la contaminación bioluminiscente de pozos adyacentes debido a los fotones que atraviesan la placa.
En comparación con otra célula comúnmente empleado enfoques basados en la cultura, este método ofrece la ventaja de que la adquisición de datos puede ser performed de una manera totalmente automatizada dado que la necesidad para la destrucción de la muestra o la adición del sustrato se elimina. También permite el seguimiento continuo de los efectos dinámicos de la misma población de células durante un período prolongado de exposición, lo que proporciona una resolución mejorada de la cinética de toxicológicos sin el aumento simultáneo de los costos monetarios y de tiempo que se hace necesaria cuando se utiliza la lisis celular que requiere métodos ( Tabla 1). Sin embargo, una importante limitación de este método es que la célula de prueba específica del tipo requerirá la transfección estable de la casete de lux, en cada tipo de célula de interés con el fin de generar un fenotipo autobioluminescent para el cribado. A pesar de esta necesidad sólo se realiza una vez ya que las células posteriormente se pueden almacenar en nitrógeno líquido para su uso futuro, el procedimiento de transfección es un esfuerzo potencialmente consume mucho tiempo.
A pesar de este requisito previo, el protocolo descrito aquí es simple y barato, requerirs mínima manos-en el trabajo del personal de laboratorio, no requiere ningún reactivo adicional, y genera datos que se puede utilizar directamente para la interpretación toxicológica. Por estas razones, llegamos a la conclusión de que las líneas de células de mamíferos autobioluminescent se pueden utilizar como un ensayo de alto rendimiento para la detección rápida preliminar de un gran número de candidatos para seleccionar compuestos que requieren evaluación aguas abajo más detallada.
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Disclosures
DM Close, SA Ripp y GS Sayler son fundadores y propietarios de 490 BioTech, Inc.
Acknowledgments
Estos esfuerzos de investigación fueron apoyados por la División Nacional Science Foundation de la Química, Bioingeniería, Medio Ambiente y Sistemas de Transporte (CBET) bajo el número de premios CBET-0853780 y CBET-1159344 y los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental (NIEHS) bajo el número de concesión 1R43ES022567-01, y el Instituto Nacional del Cáncer, Programa de Imagen del Cáncer con el número premio CA127745-01. El instrumento IVIS Lumina utilizado en este trabajo se obtuvo del Programa de Instrumentación EE.UU. Ejército Defense University Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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