Summary
Bakteriyel biyolüminesans gen kasetinin ifade eden memeli hücreleri (
Abstract
Memeli hücre tabanlı in vitro deneyleri yaygın olarak toksikolojik çalışmalar için hayvanlar üzerinde test alternatif olarak istihdam edilmiştir ama nedeniyle ateşböceği lusiferaz-tabanlı tarama yöntemlerinin yıkıcı doğası zorunlu paralel numune hazırlama, yüksek para ve zaman maliyetleri nedeniyle sınırlı kalmıştır . Bu video ilgi çekici bir bileşik olan sitotoksik etkilerinin izlenmesi için bir ucuz ve kolay bir yöntem olarak, bir lusiferin substratının yıkıcı ilave gerektirmeyen Bağımsız biyolüminesans memeli hücrelerinin kullanımını tarif etmektedir. Stabil bir şekilde tam bakteriyel biyolüminesans (luxCDABEfrp) geni ifade kaseti, memeli hücreleri bağımsız olarak bir optik sinyal üreten bir harici enerji kaynağı, ya da geleneksel bir numunenin tahrip edilmesi pahalı ve muhtemelen müdahale lusiferin substratının, uyarma ilavesi olmadan 490 nm pik optik görüntüleme işlemi sırasında yapılans. Dış stimülasyon gelen bu bağımsızlık çıkan sinyal sadece aktif metabolizma sırasında tespit, yani sadece hücre bioluminescent reaksiyon korumak için yük getirmektedir. Biyolüminesans üretiminde değişimler hücre büyümesi ve metabolizması üzerindeki olumsuz etkilerin bir göstergesi olduğundan, bu özellik, lux-eksprese eden hücre soyu sitotoksik etkilerine karşı biosentinel olarak kullanım için mükemmel bir aday yapar. Benzer bir şekilde, gerekli örnek imha özerk doğası ve eksikliği zehiri maruz kalma süresi boyunca gerçek zamanlı olarak aynı numune üzerinde tekrar görüntüleme izin verir ve otomatik bir şekilde mevcut görüntüleme ekipmanı kullanarak çoklu örnekler yardımıyla gerçekleştirilebilir.
Introduction
Onlar Gıda ve İlaç İdaresi tarafından tüketici kullanım için onaylanmıştır önce ABD'de, insan tüketimine yönelik ilaç ve diğer ürünleri kapsamlı bir değerlendirme gerektirir. Bu testinin yapılması için mali yük büyük ölçüde tüketiciler için artan maliyet yeni bileşik geliştirme ve bu nedenle çevirir maliyetini artırır geliştirici 1, yerleştirilir. Bu tarama geleneksel olarak çok insan ana için temsilci olarak vekaleten Hayvanlar üzerinde kullanılan olsa da, bu (Tox / ADME adsorpsiyon, dağılım, metabolizma, boşaltım ve toksisite her yıl harcanan yaklaşık 2800000000 $ ile, büyük bir mali yük olduğu kanıtlanmıştır ) Tek başına tarama 2 ve hayvan modellerinde güvenilir insan toksikolojik yanıtları 3 tahmin edemez düşündüren montaj kanıtlar. Bu nedenle, in vitro insan hücre kültürü tabanlı test nedeniyle nispeten daha düşük olan son yirmi yılda popülerlik kazanmıştırmaliyet, daha yüksek verim ve insan biyoyararlanım ve toksikoloji 4 daha iyi temsil. Mevcut hücre kültürü bazlı toksisite tarama yöntemleri hücre canlılığı 5 değerlendirmek için, hücresel membran bütünlüğünü sondalama veya mitokondriyal aktivite düzeyi izleme, endojen olarak mevcut sitoplazmik enzimlerin aktivitesinin taranması, örneğin ATP seviyelerinin ölçümü gibi, uç noktalar, istihdam , 6. Ölçümler ve böylece tek bir zaman noktasında veri üreten alınabilir önce Ancak, ne olursa olsun seçilen nokta dolayı, bu yöntemler her numunenin imha gerektirir. Sonuç olarak, çok sayıda numune hazırlanmış ve temel toksikolojik kinetik çalışmalar için paralel olarak tedavi, daha yeni bir bileşik geliştirilmesi için gerekli maliyet ve iş gücü ekleyerek olması gerekir. Alternatif olarak, bu tür tahliller kullanılarak Gaussia 7 lusiferaz, Vargula lusiferaz 8 ve 9 Metridia lusiferaz gibi lusiferaz salgılananhücre parçalama için olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve son nokta ölçümü için, ortamın bir kısmını gerektirir, ancak, yine de bu önceden belirlenmiş zaman noktalarında, örnekleme ile sınırlıdır ve ayrıca dışsal ışık aktive edici yüzeyler ilavesi gerektiren geliştirilmiştir.
Örnek gerekli imha zararına yanı sıra substratlar maliyeti ortadan kaldırmak için önlemek için, bir insan hücre hattı benzer canlı hücreler sürekli olarak izlenmesi için izin vermek için tam bakteriyel biyolüminesans (lux) gen kasetinin (luxCDABEfrp) ifade eden tasarlandı floresan-boya tabanlı canlı hücre görüntüleme için, ancak ek foton-aktive edici ve mikroskobik inceleme prosedürler olmaksızın. Bu hücre hattı, böylece numunenin imha kaçınarak, yapısal olarak dış uyarılması için gerek olmaksızın sürekli, doğrudan saptanması için bir optik sinyal üretme yeteneğine sahiptir. Mekanik olarak, bu hücrelerden üretilen bioluminescent sinyal nedens luxAB şekillendirilmiş lusiferaz enzim indirgenmiş riboflavin fosfat varlığında (FRP geni tarafından FMN ikinci geri kazanılır FMNH 2, uzun zincirli bir yağ aldehid (endojen maddeleri kullanarak luxCDE gen ürünleri tarafından sentezlenen ve rejenere) oksidasyonunu katalize zaman ürün) ve moleküler oksijen 10. Konakçı hücre içinde, lux kaset ekspresyonu bu nedenle üretilen ve hücre yıkımı veya eksogen bir substrat ilave edilmeden tespit edilmesi ışık sağlar. Benzer şekilde, lux genler ve endojen olarak mevcut FMN ve O 2 cosubstrates ve FMNH 2 FMN dönüşüm destekleyen bir ortamın bakım gereksinimi, arasındaki etkileşim, elde edilen biyolüminesans sinyali sadece oturma tespit edilebilir olmasını sağlar , metabolik olarak aktif hücrelerin.
Bu gereksinimler daha önce o lüks-bas göstermek için istismar edilmiştired bioluminescent çıktı hücresel nüfus büyüklüğü 11 ve zehirli bileşik maruz kalma bir doz-yanıt moda 12 autobioluminescent üretim bozar ile güçlü ilişkilidir. Burada toksisite testi için autobioluminescent memeli hücrelerinin uygulama doğrulamak için temsili bir örnek olarak bilinen DNA hasarına aktivitesi ile bleomisin ailesinin bir antibiyotik otomatik toksikolojik tarama göstermek için, daha önce karakterize edilen autobioluminescent insan embriyonik böbrek (HEK293) hücre hattı 11 kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Hazırlanması
- Sıvı azot donmuş stok biyolüminesans HEK293 hücreleri bir şişe elde etmek ve Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle% 10 cenin sığır serumu ile desteklenmiş ortamı (DMEM), 0.01 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 x antibiyotik antimikotik ve T, 0.01 mM sodyum piruvat onları büyümeye 37, 75 doku kültürü şişesi ° C ve% 5 CO2.
Not: Medya ve ek parçaları hücre hatları göre değişir ve bu nedenle buna göre seçilmelidir. - Yenile orta her kapsamlı kadar 2-3 gün ~ 80% izdiham.
Not: gerekli hücrelerin miktarı deneysel tasarım dayalı olacaktır. Gerekirse, daha fazla hücre alt kültüre ile elde edilebilir. - Testleri için hasat hücreleri.
- Orta kaldırmak ve fosfat hücreleri yıkayın şişeye yavaşça dönen ve daha sonra çıkarılır ve PBS ile peynir salin (PBS).
- 2 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe tripsin ve eklemeveya hücre kadar şişesi müstakil.
- PBS içinde müstakil hücreleri toplamak ve temiz bir santrifüj tüpü içine aktarabilirsiniz.
Not: nonadherent hücre hatları santrifüj, ayrı hücrelere kullanılan ve PBS ile bir kez yıkayın varsa.
- Hemasitometre ya da başka hücre sayımı sistemi kullanılarak toplam hücre sayısı belirlenir.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatantı atın ve taze, önceden ısıtılmış orta hücreleri tekrar süspansiyon.
- Opak bir çok-çukurlu plaka bireysel kuyular içine hücre çekirdeği eşit sayıda. Bu örnekte, plaka 5 x 10 siyah 24 oyuklu plakanın her kuyuya, 1 ml'lik bir hacimde 5 hücreleri. Plaka üç kopya halinde kuyularda ortamına ait eşit bir hacmi negatif kontrol olarak hareket eder.
Not: her iyi kaplama hücrelerin sayısı esnek ve ayrı deneyler için optimize edilebilir. Her bioluminescent hücre hattı için, deneysel hücre sayısı ve biolumi arasındaki ilişkiyi belirlemeknescent çıkış yanı sıra, en az saptanabilir hücre önce herhangi bir toksisite testleri sayılır. Standart koşullar altında görüntüleme nüfusun boyutlarda geniş bir aralığı (örneğin, 1 x Ekim 3-1 x 10 hücre 6) karşısında yer alan bu tedbir, biyolüminesans yapmak için. - Aşağıda tarif edildiği gibi test bileşik (ler) ile birlikte hücre tedavisi.
2. Kimyasal Hazırlama
- Bir konsantre stok çözeltisi olarak test edilen kimyasal hazırlayın. Bu örnekte, bir 100 mg / bleomisin ailesinin bir antibiyotik ml stok çözeltisi kullanın.
Not: organik bir çözücü kimyasal eklenmesi için bir araç olarak kullanıldığında, özellikle de potansiyel taşıyıcı bazlı toksik etkilerini minimuma indirmek için, stok konsantrasyonu, en az 1000 kat, istenen uygulama sonrası konsantrasyon olması önerilir. - Doğrudan hücrelere hazırlanan kimyasal stok ekleyin. Bu örnekte, doz nihai konsantrasyonları 100, 200, 300, ve tri 400 ug / ml 'de ilgi antibiyotikkuyu plicate. Tedavi edilmeyen kontrol olarak hücreler üç kuyu bırakın.
Not: Hedef kimyasal nihai konsantrasyon spesifik deneysel hedeflerine göre seçilmelidir. Konsantrasyonları geniş bir aralık, normalde toksik etkilerin tam bir spektrum elde etmek için test edilir.
3. Görüntüleme ve Veri Analizi
- Hemen kimyasal ilave edildikten sonra, görüntü elde etme ve biyolüminesans ölçümü için uygun enstrümanın görüntüleme odasında plaka yerleştirin.
- Her okuma için bir 10 dakika entegrasyon zaman kullanarak 24 saatlik süre içinde önlem biyolüminesans her 15 dk.
Not: Bu örnekte kullanılan entegrasyon zaman bir başına plaka bazında ve seçtiğiniz diğer luminometreyle kullanılarak her iyi bazında ölçümü için ayarlanabilir. Entegrasyon süresi seçilen bioluminescent hücre hattı dayalı da ayarlanabilir. Biyolüminesans hücre yıkımı ya da herhangi bir dış uyarı olmaksızın özerk üretilir çünkü okumakbulgular spesifik deney amaçları yerine getirmek için arzu edilen herhangi bir zaman noktasında alınabilir. - Uyumlu yazılım kullanarak ilgi bir bölge belirleyerek her kuyudan bioluminescent yoğunluğunu ölçmek. Ya toplam akı (fotonlar / saniye) veya her numunenin (fotonlar / cm / saniye 2 / steridian) olarak ışık çıkışı görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, autobioluminescent HEK293 hücreleri ve dinamikleri spektrumlu antibiyotik (Şekil 1) tepki olarak 24 saatlik bir süre boyunca sürekli olarak izlenmiştir. Bağlanabilen ve DNA 13 yarılması ile, canlı hücreleri öldürmek için bilinen bleomisinin ailesinin bir üyesi olan bu antibiyotik, toksik etkileri, Pseudocolor görüntü doğrudan görselleştirilebilir tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla, biyolüminesans üretiminde bir azalma ile ortaya konmuştur (Şekil 2). Değişen ıslah koşulları altında numune tekrarlanan paralel tarama izin verilen bu hücreler, The autobioluminescent doğası kolay doz-cevap analizi için herhangi belirli bir zaman noktasında farklı konsantrasyonları ile karşılaştırma için bırakılmıştır. Örneğin, biyolüminesans olduğu artan antibiyotik tedavisi Resul gösteren, Şekil 3 'de kimyasal konsantrasyonlar karşı çizilmiştir, sonra 15 hücreleri, 18 saat ve 20 saat tedavi saat ürettiBir doz-tepki şekilde biyolüminesans üretiminin azaltılması, ayarlı.
Şekil 1. Kimyasal maddelere maruz kalma. Kurucu biyolüminesans HEK293 hücrelerinde tepki olarak biyolüminesans dinamiklerinin sürekli izleme bleomisin ailesinin bir antibiyotik çeşitli konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır. Bioluminescent üretim maruz kalma 24 saat süre (bir tabak, ortalama ± standart hata teknik triplicates için temsilci veri) (14 basım) üzerinde izlenmiştir.
Şekil 2. Tedavi edilen hücrelerin Pseudocolor görüntüleri.
Şekil 3,. Kimyasal maddelere maruz kalma doz-yanıt. Biyolüminesens 15 saat sonra çıkış, 18 saat ve maruz kalma 20 saat antibiyotik tedavisi artan bir doz-yanıt şekilde hafif üretim azaltılması (bir plaka üzerinde teknik triplicates için temsilci veri, neden olduğunu gösterdi ortalama ± standart hata). R 2 değeri lineer regresyon için hesaplanır.
Tablo 1. Temsilcisi karşılaştırmaautobioluminescent (lux-bazlı) insan hücreleri ya da geleneksel bir ateş böceği lusiferaz (luc) bazlı, bir 96-yuvalı plaka formatı kullanılarak tahlil toksisite göstermiştir ekran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, canlı hücreler sürekli olarak kullanım süresi boyunca takip edilmesine olanak in vitro sitotoksisite tarama deneyi, bir özerk olarak biyolüminesans memeli hücrelerinin kullanımını gösterir. Bu protokol, esnek ve gerektiğinde gibi belirli deney koşulları karşılamak için modifiye edilebilir. Örneğin, deney akut toksik etkilerini izleme için uygundur Burada yer ama art arda artan zaman aralıklarında (yani her 24 saat) görüntüleme ve arasında standart enkübasyon koşulları altında hücreleri korumak tarafından gecikmeli veya uzun süreli etkileri değerlendirmek için adapte edilebilir okuma. Ayrıca, entegrasyon zaman biyolüminesans hücre hattı göre ayarlanabilir. Çeşitli entegrasyon zaman görüntülemenin bir ön deney en uygun okuma penceresi belirlemek için gerçekleştirilebilir. Bu örnekte kullanılan 10 dakika entegrasyonu tüm treatmen genelinde bioluminescent üretim dinamik aralık vurgulamak için seçildiT koşullarında, ancak daha kısa bir okuma çerçevesi, uygulamaya bağlı olarak uygulanabilir. 24 kuyulu bir levha, bu örnekte bir gösteri için kullanılan Benzer bir şekilde, 96 - ya da 384-kuyucuklu plakaların daha yüksek hacimli uygulamalar için ikame edilebilir. Temsilcisi sonuçları tek bir plaka üzerinde teknik triplicates göstermek Burada gösterilen rağmen, ilgi bir bileşik test ederken tedavi düzeyleri arasında istatistiksel olarak anlamlı kurmak için yapılmalıdır farklı tabak o bağımsız testleri dikkat etmek önemlidir. Bu testte değişen algılama hassasiyetleri ile araçların çeşitli kullanım için adapte edilebilir çünkü Ayrıca, kabul edilebilir sinyal-gürültü ve sinyal-arka plan oranları bir başına enstrüman olarak belirlenmelidir önerilir.
Daha önce, bir 24-çukurlu plaka içinde en az saptanabilir hücre sayısı, burada açıklanan 15 görüntüleme koşulları altında yaklaşık olarak 1.5 x 10 4 hücre olduğu tespit edilmiştir.Ancak, güvenilir bir tespit için gerekli olan hücrelerin en az sayıda de büyüklüğüne bağlı olarak değişir, ve daha küçük kuyu kullanımı birim alan başına biyolüminesans hücrelerin sayısını artırarak tespiti için gerekli olan hücre sayısını azalttığını dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, güçlü biyolüminesens çıktı ve nüfus alanı arasındaki ilişki önce tarama için istenen görüntüleme koşullar altında belirlenmesi tavsiye edilir. Buna ek olarak, bir foto çoğaltıcı tüp tabanlı plaka okuyucu da IVIS Lumina görüntüleme sistemi yerine, veri toplama için kullanılabilir, ancak Pseudocolor görüntüler elde zararına. Ne olursa olsun kullanılan görüntüleme enstrüman, opak plaka sinyal kaybı ve / veya plaka geçme fotonlar nedeniyle bitişik kuyu biyolüminesens kontaminasyonu en aza indirmek için kullanılmalıdır.
Diğer yaygın olarak kullanılan hücre kültürü bazlı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, veri toplama performe olması avantajını sunarÖrnek imha veya substrat eklenmesi için gerekli olduğundan, tam otomatik bir şekilde d elimine edilir. Yöntemleri parçalama gerektiren hücre kullanırken aynı zamanda zorunlu olduğu para veya zaman maliyeti eşzamanlı artış olmadan toksikolojik kinetik gelişmiş bir çözünürlük sunuyor maruz kalma, uzun bir süre içinde aynı hücre popülasyonu üzerinde dinamik etkileri sürekli izleme sağlar ( Tablo 1). Bununla birlikte, bu yöntemin önemli bir sınırlama, hücre tipine özgü test tarama için bir autobioluminescent fenotip elde etmek için her bir ilgi hücre tipi içine lüks kasetinin kararlı transfeksiyonu gerekli olacaktır. Hücreler daha sonra gelecekteki kullanım için sıvı azot içinde saklanır edilebilir çünkü bu ihtiyacı sadece bir defa gerçekleştirilir, ancak transfeksiyon prosedürü potansiyel olarak zaman alıcı bir çaba.
Bu ön koşul rağmen, protokol burada basit ve ucuz, ihtiyaç olduğu belirtilenin en az eller üzerindeki laboratuar personelinin çalışma, herhangi bir ek reaktifler gerektirmez ve doğrudan toksikolojik yorumlanması için kullanılabilecek veri oluşturur etmez. Bu nedenlerden dolayı, autobioluminescent memeli hücre hatları daha ayrıntılı bir alt değerlendirilmesi gerekir bileşimlerin seçilmesi için olan bir aday çok sayıda ön hızlı taranması için yüksek verimli bir tahlil olarak kullanılabilir olduğu sonucuna vardık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DM Kapat, SA Ripp ve GS Sayler 490 BioTech, Inc kurucuları ve sahipleri
Acknowledgments
Bu araştırma çabaları Kimya, Biyomühendislik, Çevre ve ödül numaraları CBET-0853780 ve CBET-1159344 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri, Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIEHS) altında Transport (CBET) Sistemleri, Ulusal Bilim Vakfı Bölümü tarafından desteklenmiştir ödül sayısı 1R43ES022567-01 ve Ulusal Kanser Enstitüsü, ödül sayısı CA127745-01 altında Kanser Görüntüleme Programı kapsamında. Bu çalışmada kullanılan IVIS Lumina aracı ABD Ordusu Savunma Üniversitesi Araştırma Araçları Program elde edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
