Introduction
循環エキソソームの正確な機能は、長期間にわたり未知のままであった。今でもエキソソームの完全パスメカニズムは完全には理解されていない。エキソソームは、起源のそれらの親細胞にそれらを関連付ける抗原、タンパク質及びRNA（mRNAおよびmiRNAの）を運ぶので、細胞 - 細胞シグナル送信機としての機能は、主に優先度が与えられている。
多くの異なる方法がエキソソーム1,2の単離および定量的検出のための文献に記載されている。しかし、「ゴールドスタンダード」に関するコンセンサスに達していない。一方エキソソーム研究の分野で活躍の科学者の大半は分離の一貫した方法は非常に異なったレポートや研究間の比較可能性が高い程度を達成するために保証されることに同意します。
蛍光活性化細胞選別（FACS）は、エキソソーム分析3のための最も一般的で普及しているツールです。 FACSはベンを持って蛍光標識を介して、異なる起源からの細胞を1ステップで比較することができる、efit。 FACSの主な欠点は、さらに少ない彼らのサイズを測定するために、エキソソームは、直径5で30〜120 nmの間で一般的であるのに対し、この方法では、粒子0.5μm未満4を識別するのに十分な感度ではないことである。
走査電子顕微鏡（SEM）および透過型電子顕微鏡（TEM）は、粒子のサイズおよびエキソソームの形態を分析するための他のツールである。しかし、SEMおよびTEMの両方は、サンプルの調製は時間がかかり、両方の方法は、労働集約型の工程を含み、それぞれがアーティファクト世代のいくつかの危険性を有するという欠点を有する。どちらの方法は、1つのサンプルの単一粒子の数千の高いサンプル処理能力および特徴付けに適している。また、サンプルは、多くの場合、非常に短い期間で、同時に、または少なくとも、分析されるている臨床毎日のルーチンの定量分析は、実施が困難。新世代の技術は、今、私たちは前に集中的な準備作業（ 例えば、環境SEM）することなく、エキソソームを分析することができます。これらの近代的な技術はまだそれらの平均数およびサイズ分布6を決定するためにエキソソームを含む大容量の懸濁液を分析するためのかなり不便である。
エキソソームの可視化と分析のためのもう一つの非常に感度の高い方法は、ナノ粒子トラッキング解析（NTA）である。この方法は、物理学の二つの異なる原理を利用しています。まず、粒子がそれらにレーザー光を照射したときの散乱光によって検出される。第2の現象は、それによれば、液体懸濁液中の異なる粒子の拡散が、そのサイズに反比例する、ブラウン運動として知られている。後者の場合、動きは、温度および液体の粘度に依存する。しかし、この速度は、粒子サイズに直接関連し、NTAによって使用される。ソフトの使用ウェアベースの分析、単一粒子からの散乱光のデジタル画像が記録されている。散乱された光スポットのプロットと、その運動速度は、全粒子数及びサイズ分布の決定を容易にするデータを提供する。この技術は、100nm未満の平均直径を有する粒子を分析するために特に強力である。
大きさや濃度測定がZetaViewブラウンと電気モーションビデオ解析マイクロスコープを用いて行われている。これは、液体サンプルのための半自動卓上ナノ粒子分析装置（以下、粒子追跡装置と呼ぶ）である。これは、粒子追跡分析装置およびデータ分析のために使用されるソフトウェアとノートパソコンで構成されている。異種の生物学的試料は、無機粒子のより均一な懸濁液として、この方法に好適である。ビデオカメラとレーザー散乱顕微鏡は、粒子の検出のためとOBSEのために使用されるそれらの動きのrvation。顕微鏡の軸が水平とエキソソームを含有する懸濁液で満たされたセルチャネルに集光されながら、レーザ光が垂直に配向されている。粒子は、レーザー散乱による顕微鏡（ 図1）を介してデジタルビデオカメラ90度で記録された光を照射した。散乱光の強度が大きい粒子直径60nmの観察を可能にする。このような設定において、粒子の明るさは、粒子サイズの唯一の指標ではない。電界無印加時に、粒子の移動は、ブラウン運動に追従し、粒径を算出するための指標として役立ち得る。しかしながら、器具はまた、細胞チャネルにわたって電界を印加することが可能である。このフィールドに曝されたとき、潜在的な、極性および懸濁エキソソームのイオン電荷のレベルは、その移動方向のさらなる決定要因となる。電気泳動MOの速度と方向結果ビリティヒストグラム。
単離されたエキソソームを分析するための最適な方法を見つけることが一つの問題であるが、別のものは、血液、腹水、尿、乳、羊水または細胞培地などの異なるメディアからのエキソソームの有効な分離である。別の方法は、超遠心1（例えばExoquickなど）、工業分離試薬を分離8または限外濾過ステップ9を用いた抗原に対して7、磁性ビーズに基づいている、これまでに記載されている。
このプロトコルでは、超遠心分離を経由してエキソソーム単離のプロセス全体を示し、粒子追跡機器を経由してサスペンションを含む得られたエキソソームを分析する方法を示しています。ヒト血漿または細胞培養培地由来のエキソソームの分析のための具体的な考察が提供される。
Protocol
注：この作品で提示実験は、デュッセルドルフ大学の制度的倫理委員会によって承認されている。
1.エキソソーム準備
- 静脈穿刺（9ミリリットルの合計）を介して3クエン酸チューブに全血を収集します。 15ミリリットルファルコンチューブに血液を注ぐ。
- 血漿からの細胞の分離を開始するために、4℃で20分間、1500×gで試料を集める。新しい15ミリリットルファルコンチューブに上清を移し。
- 遠心プラズマからすべての細胞を除去するために4℃で20分間、2800×gで試料（細胞を含まない血漿; CFP）。超遠心分離チューブ、チューブあたり1mlにCFPを転送します。
- エキソソームを枯渇させる、4℃で90分間100,000×gで遠心し。上清900μlのを削除します。超遠心分離管中の残りの100μlのペレットを再懸濁。 900μlのPBSを追加します。
- 4℃で30分間100,000×gで再び遠心し。 SU900μlのを削除pernatant。残りの100μlでペレットを再懸濁。
- 転送蒸留水40ml中に再懸濁5〜20μlの。より大きな粒子からエキソソームを分離するために450nmのフィルターを介してサスペンションをフィルタリングします。粒子測定のために、この最終懸濁液を使用してください。
粒子追跡インストゥルメントの2の起動手続き
- ソフトウェア·アイコンをダブルクリックしてプログラムを起動します。プロトコルを通じてそれらを切り替えるために、様々なソフトウェアのタブ（「セルチェック」、「測定」、「分析」）をクリックします。
- 起動手順の自動化実施のための画面上の指示に従ってください。セル品質チェックとオートアライメントの両方のボックスを選択します。
注：必要に応じてこれらの手順のいずれもが「セルチェック」タブ上のボタン（A）または（B）を押すことにより、別々に繰り返すことができる。 - NTA器の入口と出口ポートを開いて、10メートルを注入lは、入口ポートを介してセルチャネルシリンジによって水を蒸留した。水の最後の量が注入されているように、出口ポートを閉じます。廃液を収集するために、出口ポートの下にビーカーを置きます。測定セルは、気泡がないことを確認して、システム内に気泡を注射器はありません。すぐに入口ポートを閉じます。
- 「OK」をクリックすることで、細胞の品質チェックを実行します。ソフトウェアは、数秒後に細胞質の高い結果を表示します。
- すべての粒子はまだソフトウェアのライブビュー画面内または品質チェックの結果だけ良いか悪い場合を可視化している場合は、残りの粒子が測定セルから削除されるまで、ステップ2.3を繰り返します。また、粒子の蓄積を避けるために、各測定後に、ステップ2.3を繰り返します。蒸留水の注入を繰り返し、セルチェックすると「良い」結果を生成しない場合は、2.9に進みます。
- 均一な200 nmの大きさのPOLを含む制御サスペンションを準備ystyrene粒子は、レーザー顕微鏡の焦点を合わせるために使用する。 600±100粒子は、ライブビュー画面ごとに表示されるように必要な濃度を得るために、蒸留水500mlに、機器の製造元から提供さ懸濁液濃縮物の一滴を加える。
- ステップ2.3で説明したようにNTAの機器に整列サスペンションを注入。を押して "OK"オートアライメント、システムが自動的に2焦点の最適な位置を見つけるでしょうそれを通して、自動化ルーチンを開始します。
- プロンプトがシステムを記載した表示されたら、測定を開始するために[OK]をクリックして、今の実験の準備ができている。
- 時折、エタノールの30％溶液で細胞を洗浄することにより、実験間で手動でセルチャネルをきれい。ソフトウェアは自動エラーレポートが表示されたときにチャンネルを清掃してください。
サンプルの3.測定
- EAの前に蒸留水でチャンネルをフラッシュしますchのサンプル測定（ステップ2.3で説明したように）。
- ステップ2.3で説明したように、チャネルにログイン（セクション1で調製）エキソソームサスペンションを注入。
- 必要に応じてソフトウェアで、次の主なパラメータを調整します。
- 感度。最適な感度範囲を見つけるために、異なる感度レベル用の画面ごとに測定した粒子の曲線を表示するには、ボタン「感度対粒子の数」をクリックしてください。曲線の最大傾斜の前に感度レベルを選択しました。高感度レベルは、より小さな粒子の可視化を可能にするだけでなく、バックグラウンドノイズに関連する問題が増加します。
- 最小輝度。フィルタとして、この機能を使用するには、エキソソームの測定のために20の開始明るさを選択しました。ブランクに強く光散乱粒子まで、このパラメータを調節する。アーティファクトを散乱弱く増幅するためにそれを調節する。実験を通して、必要に応じて明るさを変更します。
注：軽粒子スキャッタあまりに強く重なって誤って分析から除外することができる。 - 最小と最大のサイズ。最小および最大の大きさを調整することによって、オーバーサイズの粒子からピクセルノイズや不要な散乱を排除するためにデジタルフィルタを設定する。エキソソームの測定のために10〜500画素の範囲を使用してください。
- シャッター。カメラは1/300秒に開いている期間を調整します。
- ライブのパラメータを読み出す。
- 「ライブ映像」ボタンをクリックして任意の時点で、デジタルとアナログビュー手口を切り替えます。
- 実験を通して、カラーコード化された指標として、試料の飽和状態が表示され散乱強度バーを、監視する。散乱バーが赤の場合エキソソームを分析しないでください。このような場合には、さらに、この現象を回避するために、サンプルを希釈。実験条件は、試料懸濁液の操作を禁止する場合は、感度をダウンレギュレートまたはソフトウェアの明るさをアップレギュレートする測定結果を改善するettings。
注：パーティクルの極めて高濃度のサンプルが分析されている場合、散乱は、個々の粒子を融合し、それらが1つの粒子としてカウントされます。 - ディスプレイからの視野でカウント粒子の数に注意してください。
- 「測定」タブをクリックします。
- 「実行オプション」配列内の設定を選択します。
- 各買収する前に、繰り返しチェック粒子ドリフトテストのための「チェック運動」を選択します。全体の分析を開始する前に、少なくとも1回テストを実行します。ドリフトが20μm/秒よりも高い場合、サンプルが流れて停止するように、測定を継続する前に待機。
- 実験数（5）と、それらの間の時間遅延（0）を選択する。
- 必要に応じて、「サンプルのチェック」を実行します。このテストでは、起動手順におけるオートアライメントの一部であり、必要に応じてその後に繰り返すことができる。
- 最後に「実行映像取得」ボタンをクリックします。新しいウィンドウに、サイクル数（15）と測定位置（11）の数を定義する。
注：レーザヘッドと顕微鏡11の異なる位置に粒子数を分析するために移動させることができる。実験的な需要に応じて、実験は1つの位置に、または異なる位置で実行する必要があるかどうかを決定する。- 粒子がビデオ解像度（低）を設定することにより、1個々の粒子としてカウントされるために追跡する必要がある最小限の時間の長さを確認してください。短い追跡期間中に低い解像度をもたらす。
- ファイル名を選択し、測定を開始するために「OK」をクリックしてください。
結果の解釈4。
- 「結果」タブに測定した後に表示された以下の結果とパラメータを表示しますトレースされた粒子の（1）総数、一部の（2）平均数位置、および（3）粒子濃度あたりicles。
- 数値の粒子数の割合に粒径（直径、面積および容積）の比、ならびに平均および標準分化の値に対する結果の平均表を見る。
- 複数のピークがグラフ解析に存在する場合、ピーク分析表を使用してください。このテーブルには、第一または第二のそれぞれのピークよりも小さい粒子の分布を示している。
- サイズによって粒子の分布を見るために測定し算出グラフを表示します。設定を変更するには、表示モードで、グラフ上のアイコンを使用してください。
Representative Results
このデモのために使用したサンプルは、85％の感度、感度曲線の最大傾斜の前に（ 図2）を用いた測定のための最適な設定を示しています。プロトコールで推奨されているように明るさは、最小/最大値が選択された。粒子の平均サイズが、それらのほとんどは0.137ミクロンであった、0.149ミクロンであった5.3×10 6粒子/ mlの濃度を測定した。
測定後に受信した値が.pdfのファイル形式を持つまたはデータベースにエクスポートするための.txtとしてレポートに保存することができます。好ましいものとしてプロトコル（セクション4）に記載のようにグラフを調整することができる。ビデオシーケンスも保存され、後でオフラインで再分析のために使用することができる。しかし、このようなオフライン分析に、カメラの取得前の設定が遡及的に変更することができない。
測定のための最適なパラメータ設定を見つけるために、ここでは目を記述100nmのポリスチレンサイズ標準の例に機器設定の電子の最適化。二つのパラメータ、ビデオ画像及び粒度分布における感度及び最小/最大サイズの影響を詳細に説明する。他のすべてのパラメータを表1にまとめる。
アナログおよびデジタル画像上で（50から94までの範囲）の感度の影響の視覚的印象は、 図3に視覚化される。画像から導出定量的情報は、表1の設定に基づいて、 図4に提示され、最小サイズ=感度対検出された粒子の数を5と最大サイズ= 200の典型的な関係を、 図4Aに示されている。 50と90との間に、検出された粒子の数は、感度を増加し、> 90の感度のために劇的に上昇した。感度の最適範囲は、66と86（A）との間で見出された。のdifで得られた粒子サイズ分布異なる感度の設定は、図4Bに示されている。粒度分布はつの個々の測定値の平均を表す。感度（感度= 62、赤の曲線）が低すぎるために、わずか数粒子はかなり貧弱統計結果を分析した。分析された粒子の数は、感度を増加し、損失正接（曲線）（黄線）70〜86、最適に達した。さらに小さいサイズ（感度= 94、青の曲線）の方にシフト落下粒子サイズ分布の数粒径分布の劣化に対する感受性のリードを高めることができる。 図4Cは、多数のベース×50直 径の傾向（50％を示している粒子は、感受性の関数として）、この直径よりも小さい。ベージュ色の間隔で、粒径のRSDが8％未満であり、Aの最適な間隔に対応する赤色領域悪い統計（低すぎる感度）または広域distriの結果> 8％RSDを示し小さいサイズ（感度が高すぎる）へのシフトとbutions。
最小サイズと最大サイズの設定は、最小サイズよりも小さく、最大サイズよりも大きなスポットサイズの粒子を除去するために、デジタル画像に適用されるフィルタである。光を散乱させる能力のために、粒子は、デジタル画像上で一定の大きさのスポットを生成する。スポットのサイズは、画素数（ピクセル）として測定される。粒子が非常によく（ 例えば、粒子> 200nm以下の凝集体）の光を散乱する際に、スポットサイズは、 例えば、> 500ピクセル、かなり大きい。スポットサイズは、粒子材料に応じて、小さな粒子（ 例えば、<20 nm）を（ 例えば、<10ピクセル）非常に小さい。それらが同一ではなく、これらの2つの変数の間には直接的な関係がないため、スポットサイズ（ピクセル）の粒子サイズ（ナノメートル）と交換しなくてもよい。最小値と最大サイズの最適化は、ユーザがそのような凝集体（最大サイズ）、小さいなどの不要なオブジェクトをフィルタリングすることができますそのようなバックグラウンドノイズ（最小サイズ）などのオブジェクト。 100 nmのサイズ標準の粒度分布に最小/最大サイズの影響を図4D（感度= 82）に示されている。間隔が小さいスポットサイズ（ 例えば、分= 1、最大= 52;オレンジカーブ）に設定されている場合、分析された粒子の数が減少し、数ベース×50の直径がわずかに小さいサイズの方へシフトする。より大きなスポットの設定（分= 40、最大=千;赤線）ブロードな粒度分布の結果は、より大きなサイズへとシフト。粒子の等しい総数を得るためには、オレンジ色と赤色の両方の分布区間境界は80粒子と一致するように調整した。最適な設定で分布（分= 5、MAX = 200、日焼け曲線）360粒子からなる。
成功した一連の実験は、超遠心分離によって単離したエキソソームを用いて実施して提示システムを用いてNTAによって測定した。結果のデータは非常にあった一貫して再現性の高いレベルを確認した。他の分離方法には、同様の結果を表示する必要があります。しかし、希釈工程は、特に重要なステップであると同定された粒子の計算された総数に及ぼす影響は、再評価されなければならない。
NTAのセットアップの図1.。顕微鏡/ビデオ軸とレーザビームがセルチャネル断面に交差し、互いに直交するように配向される。粒子によって散乱された光はソフトの「ライブビュー」ウィンドウに表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
アナログおよびデジタル画像上の感度の図3.インパクト。ライブビュー画面上の粒子の可視化は、アナログ（一番上の行）ANの両方の50と94の間で感度のために表示されているDデジタル（下の行）の景色。感度が低すぎると、ほんの数粒子（左）が検出される。最適な感度で粒子が互いに十分に分離され、単一のドット（中央）として表示されます。比較的高感度で粒子が貧弱な画像品質（右）につながる一緒にマージする。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
感度minおよびコントロール100nmのポリスチレン粒子サンプルの最大サイズの設定を図4に与える影響の粒子の検出数に対する感度（A）のプロット。最適な間隔は、66から86の曲線の最大傾斜前である。 （B）は、複数の感度設定を用いて得られた粒子サイズ分布（62から94）; （62）低すぎるまたは高すぎるためのグラフは、（94）の感度は、100nmのポリスチレン対照サンプルについての粒子サイズ分布を捕捉しない。 （C）感度対数ベースのX50の直径。ベージュ間隔で×50の誤差は8％未満であり、最適な間隔は、66から86の粒度分布における最小の（D）衝撃と最大サイズである。最適なパラメータ（最小= 5およびmax = 200）は、制御サンプルの正しい分布をキャプチャします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 事前取得パラメータ | |
| 感度 | 変数 |
| シャッター | 40 |
| フレームレート | 30 FPS |
| 解像度 | ハイガーナ |
| サイクル | 10 |
| 複数の取得 | 3 |
| ポジション | 1 |
| 取得後のパラメータ | |
| ミン明るさ | 30 |
| 最大容量 | 変数 |
| ミンサイズ | 変数 |
粒子追跡装置の設定の前後の取得パラメータ表1.。
Discussion
我々は、生体液中のエキソソームのサイズおよび濃度を測定するための新規かつ革新的な方法としては、血液、本ナノ粒子追跡からエキソソームを単離するための詳細なプロトコルを示す。提示された実験では、ヒト末梢血は、エキソソームの起源として使用した。しかし、 など尿、痰、細胞培養上清のような他の起源は、また、試験材料として使用することができる。
ヒトでのエキソソーム濃度の生物学的変動に基づいて、異なる個体からのアッセイは、エキソソームの著しく変動する濃度を特徴とすることができる。しかし、生物学的試験プローブ中の粒子の濃度は、結果に影響を与えることができる。そのため、プローブの希釈用の信頼性と標準化されたアプローチが必要とされている。提示された方法では、エキソソーム含有プラズマは、末梢全血9mlのから生成された。分画遠心法を使用して、エキソソームペレットから単離した手順1ミリリットル血漿懸濁エキソソームの作業サンプルをもたらすように蒸留水5mlに再懸濁した。この事前定義された設定は、NTA時にパーティクルの適切な濃度、 すなわち、適切な散乱強度を私たちに提供してきました。ボリュームおよび希釈側面のほかに、使用されている溶液の組成も重要である。私たちは、エキソソームの最終再懸濁用蒸留水を使用している。もちろん、最終希釈ステップのための異なるメディアはまた実験設定の要件に応じて、使用することができる。緩衝能力を有するサンプルをテストする際しかし、イオン性 - ソリューションのゼータ電位測定の場合には、特に、乱流を含まない条件での慎重な希釈が便利です。複数のサンプルの直接比較のために、我々はすべての試料について同じ希釈レベルを維持することをお勧めします。感度およびビデオ解像度を除くすべての設定はZetaView分析ソフトウェアを使用して後で変更することができる。
10と一緒に行く別の機器設計を提供する他のシステムを採用している。私たちは、結果のサンプルの取り扱いや再現性に関する実用的な側面は、エキソソーム評価のための方法論的順序を選択する際に中心的な重要性であると考えています。我々はまた、理想的な検出システムは、測定の結果を妨げる可能性が、ユーザーによっては要因を排除するべきだと考えています。ここに提示されたエキソソーム解析アプローチは、高度に簡単に取り扱いの基準を満たしている。さらなる利点として、サンプルの半自動解析は短時間で結果を生成する、高速プロセスで行われる。エキソソーム助剤のオンライン可視化GAにアナライザエキソソーム特性、 例えば、総濃度の瞬間アイデアで。
ここに提示さ測定技術に非常にシンプルでありながらエレガントな添加は、抗体標識エキソソームと検出器の前に先行するフィルタを用いて、散乱レーザ光の捕獲を使用することである。このようにして、エキソソームの亜集団は、選択的蛍光染色技術的にアクセス可能なそれらの表面抗原および他の生物学的に関連する特性に応じて区別することができる。
我々の粒子追跡装置の現在のバージョンの1つの欠点は、非常に高い感度レベルでそのようなバックグラウンドノイズなどのアーチファクトは、セルチャネル壁に基づいており、現在になるかもしれないという事実である。現在のシステムへの技術的な解決策と改善は、近い将来に利用可能になることがあります。この方法により、チャネル壁上のレーザ散乱光の反射がそれによって増大する、減少する測定された信号と、得られたデータと検出限界を下げるの精度。
エキソソームの単離のために現在使用されるプロトコルは、十分に確立されて適用される粒子追跡装置は、30nmの低いサイズ分布を有する著しく正確な分解能を有しているが、検出された粒子が実際に完全に真のエキソソームであるという保証はない。そのような死細胞断片またはより大きなタンパク質複合体のような他の粒子は、また、エキソソーム懸濁液中に存在することができ、偽陽性シグナルをもたらし得る。このような「汚染」は、電子顕微鏡（EM）、送信EMや走査EMのいずれであってもよく、除外することが可能な一つの信頼できる方法。以前に提案された表面マーカーの数は、テトラスパニン（TSPAN）、CD81、C63、CD9、 等 11を含む注目の増加量を得ているが、残念ながら、エキソソームのための一般的かつ特異的なマーカーは、これまでに同定されていない。
">にかかわらず、特にエキソソーム特異的マーカーに関するエキソソーム生物学の研究の将来の進行の、ここに提示されているプロトコルは、エキソソームの単離および検出のための強力な方法を提供する。濃度とサイズを容易にソフトウェア支援で決定することができる簡単なファッション。選択的な蛍光マーカーまたはフルオロフォア結合された抗体の添加は、おそらくさらにNTAの提示手法の適用可能性を高めます。Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15 ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1.5 ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2.6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5 ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5 ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450 µm |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
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