Summary
Deformação mecânica rápida de células surgiu como um método promissor, livre do vector para a entrega intracelular de macromoléculas e nanomateriais. Este protocolo fornece etapas detalhadas sobre como usar o sistema para uma ampla gama de aplicações.
Abstract
Deformação mecânica rápida de células surgiu como um método promissor, livre do vector para a entrega intracelular de macromoléculas e nanomateriais. Esta tecnologia tem mostrado potencial para enfrentar aplicações previamente desafiantes, incluindo, a entrega de pilhas imunes, reprogramação celular, nanotubos de carbono, e entrega ponto quântico. Esta plataforma de microfluidos livre do vector depende de ruptura mecânica da membrana celular para facilitar a entrega citosólica do material alvo. Relata-se o método detalhado de uso para esses dispositivos microfluídicos, incluindo, a montagem do dispositivo, a preparação celular, e operação do sistema. Esta abordagem requer a entrega de uma breve otimização do tipo de dispositivo e as condições de operação para aplicações previamente não-relatados. As instruções fornecidas são generalizáveis para a maioria dos tipos de células e materiais de entrega, este sistema não requer buffers especializados ou etapas modificação química / conjugação. Este trabalho também fornecers recomendações sobre como melhorar o desempenho do dispositivo e de problemas disparar potenciais problemas relacionados com a obstrução, a eficiência de entrega baixos, ea viabilidade celular.
Introduction
A entrega de macromoléculas para o citoplasma da célula é um passo crítico para aplicações terapêuticas e de pesquisa. Nanopartículas de entrega mediada, por exemplo, revelou potencial na terapia de genes de 1,2, enquanto que a entrega de proteína é uma forma promissora de afectar a função celular, tanto clínicas e laboratoriais 3 4 configurações. Outros materiais, tais como medicamentos de pequenas moléculas, pontos quânticos, ou nanopartículas de ouro, são de interesse em aplicações que vão desde o tratamento do câncer de 5,6 para 7,8 rotulagem intracelular, e única molécula de rastreamento 9.
A membrana da célula é largamente impermeável a macromoléculas. Muitas técnicas existentes usar nanopartículas poliméricas 10,11, lipossomas 12 ou 13 modificações químicas para facilitar a ruptura da membrana ou a entrega endocítica. Nestes métodos, a eficiência de entrega e a viabilidade celular são muitas vezes dependentes da estrutura do the molécula-alvo e do tipo de célula. Estes métodos podem ser eficientes na entrega de materiais estruturalmente uniformes, tais como os ácidos nucleicos, mas são muitas vezes mal adaptados para a entrega de mais estruturalmente diversos materiais, tais como proteínas e os nanomateriais 14,15 7. Além disso, o mecanismo de interrupção do endossoma que a maioria destes métodos baseiam-se é muitas vezes ineficaz, deixando, portanto, muito material aprisionado em estruturas vesiculares 16. Finalmente, os métodos que são muitas vezes desenvolvidos para utilização com as linhas de células estabelecidas, não se traduz bem a células primárias.
Métodos Membrane poração, como eletroporação 17,18 e sonoporação 19, são uma alternativa atraente em algumas aplicações, no entanto, eles são conhecidos por causar a viabilidade celular de baixo e pode ser limitada pela carga do material de entrega alvo.
Deformação mecânica rápida de células, uma abordagem microfluídicos para entrega, tem recentemente demonstrated suas vantagens em relação às técnicas actuais no contexto de reprogramação das células 20 e 21 de fornecimento de nanomateriais. Este método baseia-se o desmembramento mecânico da membrana celular para facilitar a entrega citosólica de materiais presentes no tampão circundante. O sistema demonstrou permitindo potencial anteriormente desafiando tipos de células (por exemplo, células imunes primárias e as células-tronco) e materiais (por exemplo, anticorpos e os nanotubos de carbono). Aqui, o processo geral para utilizar estes dispositivos para a entrega intracelular de macromoléculas alvo é descrita. O procedimento é generalizável para a maioria dos tipos de células e materiais de entrega, no entanto, recomenda-se que uma realização de uma breve otimização das condições, conforme detalhado em nossas diretrizes previamente relatados projeto 20, para todas as aplicações anteriormente não declaradas. Até à data, o sistema tem sido utilizado com sucesso para a entrega de RNA, DNA, as nanopartículas de ouro, quantum dots, nanotubos de carbono, proteínas, e polímeros de dextrano 20,21.
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Protocol
1. Armazenamento
- Armazene os reservatórios, suportes, anéis de vedação e dispositivos microfluídicos em etanol 70%. Use um recipiente (por exemplo, jarra ou copo) que tem uma tampa para evitar a evaporação e contaminação por poeira ou partículas de fora. Colocar os dispositivos em um recipiente (1), reservatórios e os O-rings em um segundo recipiente (2), e os detentores na terceira (3).
Nota: O uso do etanol de 70% para o armazenamento é manter a esterilidade. Se os únicos componentes da solução são o etanol e água (ou seja, sem agentes de desnaturação), todos os componentes do sistema deve ser totalmente compatível e não se degrada com o tempo.
- Alterar solução de etanol em recipientes (2) e (3) antes de cada utilização, para evitar a contaminação cruzada através de experiências e minimizar a presença de partículas indesejáveis que podem causar o entupimento.
2. Experiência Preparação
- Coloque os recipientes (2) e (3) em um banho de ultra-som for 5-10 min, antes de cada utilização. Isso ajuda a remover as partículas contaminantes a partir de experiências anteriores.
- Limpe espaço de trabalho na cabine de segurança biológica com solução de etanol a 70%.
- Spray de todos os materiais (3 recipientes, e pinças) com uma solução de álcool 70% antes de colocá-los dentro da cabine de segurança biológica.
3. Montagem
- Pouse 2-3 toalhetes baixo fiapos na área de trabalho.
- Remover reservatórios de plástico a partir de seu recipiente com uma pinça e colocá-las sobre os lenços para facilitar a evaporação da solução de etanol a partir de superfícies internas. Bater levemente os reservatórios sobre a superfície ou sopro de ar através delas a fim de facilitar a remoção da solução de etanol.
- Insira o-rings em seu slot apropriado dos reservatórios.
- Retire o suporte e fichas respectivos recipientes e permitir que o etanol evapore (~ 1-2 min).
- Use uma pinça para colocar o chip virado para cima desejado (ou seja, furos de acesso para cima) no suporte. Levante a titularcom o chip para eyelevel para garantir que o chip está deitado no suporte e ajustar, se necessário, com a pinça. IMPORTANTE: Se o dispositivo não encaixar corretamente em seu suporte, há um risco de que ele vai quebrar durante as etapas subseqüentes.
- Em seguida, coloque delicadamente os reservatórios no suporte e alinhá-las com os clipes. Tenha cuidado para que o-rings não caem de seus slots durante este processo.
- Pressione gentilmente os reservatórios até que eles se encaixem no lugar. Assegure-se que ambos os lados dos reservatórios são seguras e que o chip parece estar na posição correcta.
4. Preparação celular
- Para as células aderentes (linhas primárias ou estabelecidas): células da placa de 1-2 dias antes da experiência de modo a que eles não são confluentes mais do que 80% no dia da experiência.
- Coloque as células em suspensão (em PBS ou mídia relevante) e apontar para uma concentração operacional de 1,0 x 10 6 células / ml a 1,0 x 10 7 cells / ml. NOTA: Nós não observamos mudanças significativas no desempenho de entrega, devido à concentração de células.
- Misturar as células e o material de entrega desejado num tubo separado para obter a concentração de material desejado para a experiência. IMPORTANTE: Como o método de entrega descrito depende de difusão para facilitar a entrega, uma concentração maior de material trará entrega superior. Se possível, é recomendado o uso de uma solução 1 mM de o material desejado para ensaios iniciais. Esta concentração pode ser, em seguida, titulada para baixo em futuras experiências, conforme necessário. A concentração mais baixa relatado utilizado com este dispositivo é de 10 nM 21.
5. Operação
- Pipeta mistura de células e material de entrega em um reservatório (projeto atual tem um máximo de capacidade de 150 mL). NOTA: A maioria dos projetos de dispositivos são totalmente reversíveis, portanto, sentido do fluxo através dos canais não importa. As amostras podem ser carregados em qualquer um dos dois reservatórios. Prenda a tubulação de pressão para o reservatório cheio e apertar a porca para garantir vedação adequada (dedo apertado é muitas vezes suficiente).
- Regule a pressão para o nível desejado no regulador. Este controla a velocidade à qual as células de viajar através do dispositivo. Note-se que o fluxo de células não começar até que o botão é pressionado.
NOTA: Num trabalho prévio, o azoto ou o ar comprimido pode trabalhar igualmente bem como o gás de transporte.
- Elevar dispositivo ao nível dos olhos e orientá-la de modo a que o líquido no reservatório é facilmente visível. NOTA: Acompanhe a coluna de líquido para desligar o sistema antes de o reservatório é esvaziado.
- Pressione o botão para pressurizar o reservatório e iniciar o fluxo de celular.
- Quando o nível de líquido é de cerca de 2 mm a partir do fundo do reservatório, desligar rapidamente o regulador de 0 psi até parar o fluxo. IMPORTANTE: Se um falhar para interromper o fluxo antes que o reservatório é esvaziado, se corre o risco de ejetar a amostra do collection reservatório. Observe também que, se a coluna de fluido não está se movendo em um ritmo apreciável, ou diminuiu substancialmente em relação ao seu caudal inicial (por exemplo, 3x mais lento), o dispositivo montado é provavelmente entupida e precisa ser trocado. A operação de um dispositivo obstruído pode levar à morte da célula superior.
- Recolha as células tratadas a partir do reservatório apropriado e coloque-os no tubo de coleta / placa desejada. IMPORTANTE: Não diluir as células coletadas em todos os buffers, nesta fase, as células rado continuará a captação de material para até 10 min 20. Após esta janela já passou, diluir as células na mídia / tampão desejado.
- Para coletar mais células tratadas ou tente condições experimentais alternativos, repita os passos de 5,1-5,7, conforme necessário. Recorde-se que as batatas fritas são reversíveis, por conseguinte, as amostras podem ser montados em qualquer reservatório. Certifique-se de trocar chips como necessário se entupir. Descarte dispositivos entupidos.
6. Desmontagem
- Coloque cada parte no recipiente apropriado (detalhado na seção 1).
- Coloque chips usados em um recipiente separado para a eliminação.
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Representative Results
A Figura 1 apresenta um esquema descritivo de o sistema de entrega de microfluidos. Figuras 2a-b ilustram os resultados típicos de tratamento de células HeLa com diferentes modelos de dispositivos, na presença de fluorescência 3 conjugado dextrano 20 kDa. Se o procedimento for seguido corretamente, o desempenho do sistema será sensível ao tipo de dispositivo e velocidade de operação. Portanto, deve-se otimizar essas condições para uma determinada aplicação antes de prosseguir para mais experimentos complexos. Na gama de condições de funcionamento ilustrado na figura, a viabilidade celular permanece superior a 80%, no entanto, deve-se notar que os parâmetros de sub-óptimos de entrega (por exemplo, do tipo de chip) inadequado pode levar à viabilidades abaixo dos 30%. Assim, a viabilidade e eficiência de entrega devem ser otimizados simultaneamente para qualquer tipo de célula não declarada anteriormente. Se um projeto do dispositivo não é apropriado para o tipo de célula-alvo, um vai ver os resultados que vão desde a não entrega de alta cell morte (por exemplo, 10% de viabilidade). Se as condições experimentais eram inadequados, por exemplo, o material do alvo ligado à superfície da célula, pode não ser capaz de medir com precisão o parto como o sinal de ligação de superfície pode mascarar o sinal citoplasmática.
Figuras 2c-d ilustrar o nosso método preferido para medir a eficiência de entrega dentro da população de células vivas. O caso de controlo na Figura 2c é destinado a reflectir toda a superfície de ligação e efeitos endocitose como as células são expostas a entrega do material pelo menos tão longo quanto os casos tratados. A população de células entregue é definido como a região não sombreada de modo a que apenas 1-5% da população de controlo cai dentro dessa região. Note-se que o trabalho anterior demonstrou que a entrega a esta abordagem não é mediada por endocitose 20. A distribuição duplo pico observado no exemplo entregue não é necessariamente característica do sistema como nós hav observado mais e menos uniformes distribuições para diferentes condições experimentais.
Figura 1. Chematic S do sistema completo e sua interface com os dispositivos microfluídicos. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Os resultados representativos com células HeLa 20. Uma) a eficiência de entrega e b) a viabilidade celular das células HeLa tratadas por três diferentes modelos de dispositivos, na presença de azul cascata conjugado 3 kDa de dextrano (0,2 mg / mL). Nestas experiências, a célula slução foi a uma concentração de 10 6 culas por mL em PBS contendo 3% de soro fetal bovino e 1% Pluronics F68. A viabilidade foi medida por coloração com iodeto de propidio de células mortas e os resultados da entrega são mostradas apenas as células vivas. Todos os pontos de dados foram executados em triplicado, e barras de erro representam 2 SDs. C) Um histograma representativo de um controle experimental onde as células HeLa foram expostos a cascata azul conjugado 3 kDa dextran, pelo menos, a mesma quantidade de tempo que um caso dispositivo tratada. d) O processo correspondente no qual as células foram passadas através do dispositivo para facilitar a entrega. A fração da população de células vivas que se encontra na região unshaded do histograma é definida como a população entregue '. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Certos aspectos do procedimento experimental descrito (isto é, com excepção de design de chips e a velocidade de funcionamento factores) pode necessitar de ser optimizada, dependendo do tipo de célula e material de entrega que o sistema é aplicado. A discussão que se segue aborda alguns dos fatores mais comuns a considerar ao projetar experimentos.
Para melhorar o sinal de entrega para compostos marcados com fluorescência, é preciso abordar as fontes de fluorescência de fundo. Superfície de ligação e endocitose, por exemplo, pode ser abordado por lavagem as células 5-10 min após a entrega para remover o excesso de material, antes de cultura ou para tratamento adicional. Se optar por abrir mão de uma etapa de lavagem, que seria melhor para diluir as células tratadas por 5-10x na mídia desejada para diminuir a concentração de material do alvo na solução circundante e, portanto, reduzir as taxas de endocitose. Em alguns casos, por exemplo entrega de proteína, pode-se achar que é necessário para bloquear ativamente a surfa celularce (por exemplo, usando albumina de soro de bovino não marcado) para minimizar a ligação não específica do material de entrega. Numa determinada aplicação, se a intensidade de fluorescência do caso não tratado, tal como medido por citometria de fluxo, mais de uma década é menor do que o controlo, em seguida, a superfície de ligação de endocitose / endocitose pode ser um problema. Note-se que problemas com sinal de fundo só são relevantes para a detecção de fluorescência direta do material de entrega, testes funcionais (por exemplo, de reprogramação de células) são geralmente afetados como endocytosed ou material vinculado superfície muitas vezes são inativos.
Para melhorar a viabilidade das células após o tratamento, é preciso minimizar a quantidade de processamento pós-parto. Recomenda-se que um excesso de evitar a centrifugação e lavagem e as células de transferência no seu suporte desejado em uma incubadora de 5-10 minutos após o parto é completa. Em linhas aderentes, as células são muitas vezes totalmente colada e dividindo dentro de 24 horas após o tratamento. Como discutido previously 20, não observamos quaisquer efeitos colaterais a longo prazo do uso dessa técnica.
Os dispositivos de microfluidos utilizados neste sistema de entrega são propensas ao entupimento ao longo do tempo. Obstruções formam frequentemente na constrição, uma vez que é a característica mais reduzida no dispositivo. Entupimento pode ser causada por células danificadas ou por contaminantes ambientais. O efeito deste último podem ser minimizados, garantindo um ambiente limpo, livre de poeira para operar os dispositivos (por exemplo, um gabinete de biossegurança bem conservado). Para as linhas de células, recomendamos células Passaging 1-2 dias antes da entrega, de modo a minimizar a presença de restos de células na suspensão resultante. Ao operar o aparelho, deve-se estar atento a vazão volumétrica do fluido no reservatório. Se a taxa de fluxo cai para menos de um terço da sua velocidade inicial, o dispositivo poderá estar a causar a morte celular excessiva e devem ser trocadas, ou a direcção de fluxo invertido. Possíveis problemas de entupimento também pode ser mitigciado pela passagem da suspensão de células através de um coador de células de malha de 40 pm. Este processo garante uma suspensão de células individuais impedindo assim a formação de obstruções potenciais nas secções mais largas, com baixa taxa de fluxo do chip.
Ao conceber ensaios para diferentes materiais de entrega, é preciso ter em conta a dimensão do material do alvo e da sua concentração. Como essa tecnologia baseia-se na difusão passiva de material através da membrana celular rompida, o gradiente de concentração molar e o raio hidrodinâmico de entrega do material regulará a taxa de transferência de massa - assumindo que as perturbações da membrana são suficientemente grandes para acomodar o material. Assim, é aconselhável usar concentrações molares elevados (por exemplo, 1 uM) de grandes materiais alvo relativamente às suas partes contrárias menores. A técnica tem demonstrado entrega eficaz a concentrações tão baixas como 10 nM no caso de entrega quantum dot 21. Além disso, a técnica é not pensado para ser limitada pela natureza do material de entrega alvo excepto no contexto do material e tamanho de difusividade (por exemplo, os materiais de baixa difusividade terá eficiência de entrega de material de baixa e maior do que o tamanho das perturbações provavelmente não pode entrar no citoplasma).
Estudos em reprogramação celular e entrega ponto quântico ilustraram os pontos fortes da abordagem apertar célula relativa a eletroporação. Com base no entendimento atual dos mecanismos de ruptura da membrana nestas duas técnicas, parece que apertar célula tem uma vantagem significativa em aplicações que envolvem proteínas, moléculas pequenas, e nanomateriais 20,21. O contraste entre os dois métodos em aplicações envolvendo ácidos nucleicos (que são altamente carregadas em comparação com os materiais anteriormente referidos) é incerto.
Esta abordagem de microfluidos para entrega depende de ruptura mecânica da membrana celular parafacilitar a difusão passiva de material para dentro da célula e tem sido mostrado para ser aplicável a uma variedade de tipos de células 20. O sistema é, portanto, em princípio, apropriados para a entrega citosólica de quase todo o material para quase qualquer tipo de célula. Acreditamos que as vantagens do sistema são mais pronunciadas em casos que envolvem tradicionalmente difícil para transfecção células primárias (por exemplo, imunológico e as células-tronco) e os materiais convencionalmente difíceis (por exemplo, proteínas, pontos quânticos, nanotubos de carbono e RNA). O potencial em aplicações de células imunes e tronco acima mencionado é enfatizada pelas deficiências dos métodos tradicionais de entrega em abordar esses tipos de células. No entanto, o sistema pode precisar de mais melhorias para facilitar a entrega do gene por vectores plasmídeos como estas aplicações requerem a entrega para o núcleo. Em resumo, acreditamos que a abordagem deformação microfluídicos para entrega pode potencialmente enfrentar muitos desafios existentes para a entrega intracelular. O systeindependência de m de vetores químicos ou campos elétricos permite sua aplicação robusta para uma série de estudos. As instruções aqui fornecidas deverão permitir quaisquer pesquisadores interessados para operar esse sistema de forma independente e adaptá-lo para os seus fins de investigação.
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Disclosures
Os autores Armon Sharei, Robert Langer e Klavs F. Jensen são acionistas da SQZ Biotechnologies empresa que produz os dispositivos microfluídicos usados neste artigo.
Acknowledgments
Agradecemos T. Shatova para discussão útil em delineamento experimental e análise de dados. A assistência e competências de G. Paradis, o pessoal da citometria de fluxo do núcleo do Instituto Koch, e os funcionários do Laboratório de Tecnologia Microsystems no Instituto de Tecnologia de Massachusetts estão reconhecido agradecimento. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, e parcialmente pelo Instituto Nacional do Câncer Cancer Center Support (Core) Concede-P30 CA14051 e MPP-09Call-Langer-60.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
References
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