Summary
Deformación mecánica rápida de las células se ha convertido en un método prometedor, libre de vectores para el suministro intracelular de macromoléculas y los nanomateriales. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre cómo utilizar el sistema para una amplia gama de aplicaciones.
Abstract
Deformación mecánica rápida de las células se ha convertido en un método prometedor, libre de vectores para el suministro intracelular de macromoléculas y los nanomateriales. Esta tecnología ha demostrado su potencial en el tratamiento de las solicitudes previamente difíciles, como son, la entrega de las células primarias inmunes, la reprogramación celular, nanotubos de carbono, y la entrega de puntos cuánticos. Esta plataforma de microfluidos libre de vectores se basa en la rotura mecánica de la membrana celular para facilitar la entrega citosólica del material objetivo. En este documento, se describe el método detallado de uso de estos dispositivos de microfluidos, incluyendo, conjunto de dispositivo, preparación de células, y la operación del sistema. Este enfoque requiere la entrega de un breve optimización del tipo de dispositivo y condiciones de funcionamiento de las aplicaciones antes publicados. Las instrucciones que se proporcionan son generalizables a la mayoría de tipos de células y materiales de entrega ya que este sistema no requiere tampones especializados o pasos modificación química / de conjugación. Este trabajo también proporcionans de recomendaciones sobre cómo mejorar el rendimiento del dispositivo y localizar averías problemas potenciales relacionados con la obstrucción, la eficiencia de entrega de baja, y la viabilidad celular.
Introduction
La entrega de macromoléculas a la citoplasma de la célula es un paso crítico en aplicaciones terapéuticas y de investigación. Nanopartículas mediada por la entrega, por ejemplo, ha demostrado su potencial en la terapia génica de 1,2, mientras que la entrega de proteínas es un medio prometedor para afectar la función celular en tanto clínicos y de laboratorio 3 4 ajustes. Otros materiales, tales como fármacos de moléculas pequeñas, puntos cuánticos, o nanopartículas de oro, son de interés en aplicaciones que van desde la terapéutica del cáncer 5,6 a 7,8 etiquetado intracelular, y una sola molécula de seguimiento 9.
La membrana celular es en gran medida impermeable a macromoléculas. Muchas de las técnicas existentes utilizan nanopartículas poliméricas, liposomas 10,11 12, o modificaciones químicas 13 para facilitar la ruptura de la membrana o la entrega de endocitosis. En estos métodos, la eficiencia en la entrega y la viabilidad celular son a menudo depende de la estructura de the molécula diana y el tipo de célula. Estos métodos pueden ser eficaces en la entrega de los materiales estructuralmente uniformes, tales como ácidos nucleicos, pero a menudo son poco adecuado para la entrega de más estructuralmente diversos materiales, tales como las proteínas y los nanomateriales 14,15 7. Por otra parte, el mecanismo de interrupción endosoma que la mayoría de estos métodos se basan en es a menudo ineficaz, por lo tanto, dejando mucho material atrapado en estructuras vesiculares 16. Por último, los métodos que a menudo se desarrollan para su uso con las líneas celulares establecidas no se traducen bien a las células primarias.
Métodos poración de membrana, tales como la electroporación 17,18 y sonoporación 19, son una alternativa atractiva en algunas aplicaciones, sin embargo, se sabe que causan la viabilidad celular baja y puede ser limitado por la carga del material de entrega esperados.
Deformación mecánica rápida de las células, un enfoque de microfluidos para la entrega, tiene recientemente demonstrATED sus ventajas sobre las técnicas actuales en el contexto de la reprogramación celular 20 y la entrega nanomaterial 21. Este método se basa en la rotura mecánica o la membrana celular para facilitar la entrega citosólica de los materiales presentes en el tampón circundante. El sistema ha demostrado que permite el potencial para desafiar previamente tipos de células (por ejemplo, células inmunes primarias y las células madre) y materiales (por ejemplo, anticuerpos y nanotubos de carbono). En este documento, se describe el procedimiento general para utilizar estos dispositivos para la entrega intracelular de macromoléculas diana. El procedimiento es generalizable a la mayoría de tipos de células y materiales de entrega, sin embargo, se recomienda que uno Realizar una pequeña optimización de las condiciones, como se detalla en nuestras pautas de diseño de informes anteriores 20, para cualquier aplicación que no reportados previamente. Hasta la fecha, el sistema ha sido utilizado con éxito para la entrega de ARN, ADN, las nanopartículas de oro, puntos cuánticos, nanotubos de carbono, proteínass, y polímeros de dextrano 20,21.
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Protocol
1. Almacenamiento
- Guarde los depósitos, soportes, juntas tóricas y los dispositivos de microfluidos en etanol al 70%. Use un recipiente (por ejemplo, frasco o vaso de precipitados) que tiene una tapa para evitar la evaporación y la contaminación por partículas de polvo o fuera. Coloque los dispositivos en un contenedor (1), embalses y juntas tóricas en un segundo recipiente (2), y los titulares en el tercer (3).
Nota: El uso de etanol al 70% para el almacenamiento es para mantener la esterilidad. Si los únicos componentes de la solución son el etanol y el agua (es decir, sin agentes desnaturalizantes), todos los componentes del sistema deben ser totalmente compatibles y no se degradarán con el tiempo.
- Cambie solución de etanol en recipientes (2) y (3) antes de cada uso para evitar la contaminación cruzada a través de experimentos y reducir al mínimo la presencia de partículas no deseadas que pueden causar la obstrucción.
2. Preparación experimental
- Ponga sus recipientes (2) y (3) en un baño de ultrasonido for 5-10 min antes de cada uso. Esto ayuda a eliminar las partículas contaminantes de los experimentos anteriores.
- Espacio de trabajo limpio en cabinas de seguridad con una solución de etanol al 70%.
- Rocíe todos los materiales (3 contenedores y pinzas) con una solución de etanol al 70% antes de colocarlos en el interior de la cabina de bioseguridad.
3. Montaje
- Deposite 2-3 toallitas bajo pelusa en el área de trabajo.
- Eliminar depósitos de plástico de su contenedor con unas pinzas y ponerlos en las toallitas para facilitar la evaporación de la solución de etanol a partir de superficies interiores. Golpear suavemente los depósitos en la superficie o soplar el aire a través de ellos para facilitar la eliminación de la solución de etanol.
- Inserte las juntas tóricas en su ranura correspondiente de los depósitos.
- Retire el soporte y las fichas de los contenedores respectivos y permitir que el etanol se evapore (~ 1-2 min).
- Use pinzas para colocar el chip boca arriba deseada (es decir, los agujeros de acceso de seguridad) en el soporte. Levante el soportecon el chip a nivel de los ojos para asegurarse de que el chip está plana en el soporte y ajuste si es necesario con las pinzas. IMPORTANTE: Si el dispositivo no encaja correctamente en su soporte, existe el riesgo de que se rompa durante las etapas posteriores.
- Luego, coloque suavemente los embalses en el soporte y alinearlos con los clips. Tenga cuidado de que las juntas tóricas no se salgan de sus ranuras durante este proceso.
- Presione suavemente hacia abajo en los embalses hasta que encajen en su lugar. Asegúrese de que ambos lados de los embalses sean seguros y que el chip parece estar en la posición correcta.
4. Preparación de células
- Para células adherentes (líneas primarias o establecidas: células de la placa) 1-2 días antes del experimento de manera que sean no más de 80% de confluencia en el día del experimento.
- Coloque las células en suspensión (en PBS o medio relevante) y aspirar a una concentración de funcionamiento de 1,0 x 10 6 células / ml a 1,0 x 10 7 cells / ml. NOTA: No se han observado cambios significativos en el rendimiento de la entrega debido a la concentración de células.
- Mezclar las células y el material de entrega deseado en un tubo separado para obtener la concentración de material deseado para el experimento. IMPORTANTE: Debido a que el método de entrega descrito se basa en la difusión para facilitar la entrega, una concentración de material de más alto producirá la entrega superior. Si es posible, se recomienda utilizar una solución 1 M de material deseado para los ensayos iniciales. Esta concentración puede entonces ser titulada en futuros experimentos, según sea necesario. La concentración más baja reportada utilizado con este dispositivo es 10 nM 21.
5. Operación
- Mezcla de pipetas de células y el material de entrega en un depósito (diseño actual tiene una capacidad máxima de 150 l). NOTA: La mayoría de los diseños de dispositivos son totalmente reversibles, por tanto, la dirección del flujo a través de los canales, no importa. Las muestras pueden ser cargados en cualquiera de los dos depósitos. Conecte el tubo de presión para el depósito lleno y apriete la tuerca para garantizar el cierre (apretado el dedo suele ser suficiente).
- Ajustar la presión al nivel deseado en el regulador. Esto controla la velocidad a la que las células viajan a través del dispositivo. Tenga en cuenta que el flujo de células no se inicia hasta que se pulse el botón.
NOTA: En el trabajo anterior, nitrógeno o aire comprimido han trabajado igualmente bien como gas portador.
- Elevar dispositivo a nivel de los ojos y orientarla de modo que el líquido en el depósito es fácilmente visible. NOTA: Seguimiento de la columna de líquido para apagar el sistema antes de vaciar el depósito.
- Pulse el botón para presurizar el depósito y comenzar el flujo de células.
- Cuando el nivel de líquido es de aproximadamente 2 mm de la parte inferior del depósito, gire rápidamente el regulador a 0 psi para detener el flujo. IMPORTANTE: Si uno no logra detener el flujo antes de vaciar el depósito, se corre el riesgo de expulsar la muestra de la CollectioN depósito. También tenga en cuenta que si la columna de fluido no se está moviendo a un ritmo apreciable, o ha disminuido sustancialmente en relación a su caudal inicial (por ejemplo, 3 veces más lento), el dispositivo montado probablemente obstruido y necesita ser intercambiado. La operación de un dispositivo obstruido puede conducir a una mayor muerte celular.
- Recoger las células tratadas desde el depósito correspondiente y colocarlos en el tubo de recogida / plato deseado. IMPORTANTE: No diluir las células recogidas en cualquier búfer en esta etapa ya que las células porated continuarán con la captación de material para un máximo de 10 min 20. Después de esta ventana ha pasado, diluir las células en los medios de comunicación / tampón deseada.
- Para recoger las células tratadas más o tratar condiciones experimentales alternativos, repita los pasos 5.1 a 5.7, según sea necesario. Recordemos que las fichas son reversibles, por lo tanto, las muestras se pueden montar en cualquiera de los depósitos. Asegúrese de cambiar fichas según sea necesario si se obstruyen. Deseche dispositivos tapados.
6. Desmontaje
- Coloca cada pieza en el recipiente de almacenamiento adecuado (que se detallan en la sección 1).
- Coloque los chips usados en un contenedor separado para su eliminación.
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Representative Results
La figura 1 contiene un esquema descriptivo del sistema de suministro de microfluidos. Figuras 2a-b ilustran resultados típicos de tratamiento de las células HeLa con diferentes diseños de dispositivos en la presencia de fluorescencia conjugado 3 kDa de dextrano 20. Si el procedimiento se sigue correctamente, el rendimiento del sistema será sensible al tipo de dispositivo y la velocidad de operación. Por lo tanto, se debe optimizar estas condiciones para una aplicación dada antes de proceder a experimentos más complejos. En la gama de condiciones de funcionamiento ilustrada en la figura, la viabilidad celular se mantiene por encima de 80%, sin embargo, hay que señalar que los parámetros de administración óptimos (por ejemplo, de tipo de chip apropiado) podría conducir a viabilidades inferiores a 30%. Así, la viabilidad y la eficiencia en la entrega se deben optimizar simultáneamente para cualquier tipo de célula no declarada previamente. Si un diseño del dispositivo no es apropiado para el tipo de célula diana, uno verá los resultados que van desde la entrega a la alta cmuerte ell (por ejemplo, 10% de viabilidad). Si las condiciones experimentales eran inadecuadas, por ejemplo, el material diana unido a la superficie celular, uno puede no ser capaz de medir la entrega precisión la señal de unión a la superficie puede enmascarar la señal citoplasmática.
Figuras 2c-d ilustran nuestro método preferido para medir la eficiencia de la entrega dentro de la población de células vivas. El caso de control en la Figura 2c está destinado a reflejar toda la superficie de unión y los efectos endocytotic como las células se exponen al material de entrega para al menos tan largo como los casos tratados. La población de células entregado se define como la región sombreada de tal manera que sólo el 1-5% de la población de control cae dentro de esa región. Tenga en cuenta que el trabajo previo ha establecido que la entrega de este enfoque no está mediada por endocitosis 20. La distribución de doble pico observado en el ejemplo entregado no es necesariamente característica del sistema como se have observa más o menos uniforme distribución para diferentes condiciones experimentales.
Figura 1. S chematic del sistema completo y su interfaz para los dispositivos de microfluidos. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Los resultados representativos con células HeLa 20. A) la eficiencia de entrega y b) la viabilidad celular de células HeLa tratadas por 3 diferentes diseños de dispositivos en la presencia de cascada azul conjugado 3 kDa de dextrano (0,2 mg / ml). En estos experimentos, la s célulaslución fue a una concentración de 10 6 células por ml en PBS que contenía suero bovino fetal al 3% y 1% Pluronics F68. La viabilidad se midió mediante tinción con yoduro de propidio de las células muertas y los resultados de entrega se muestran sólo a las células vivas. Todos los puntos de datos se realizaron por triplicado, y las barras de error representan 2 desviaciones estándar. C) Un histograma representativo de un control experimental, donde se expusieron las células HeLa en cascada azul conjugado 3 kDa dextrano por lo menos la misma cantidad de tiempo como un caso de dispositivo de tratamiento. d) El caso correspondiente en el que se pasaron las células a través del dispositivo para facilitar la entrega. La fracción de la población de células vivas que hay en la región no sombreada del histograma se define como la población 'entregado'. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
Pueden necesitar ser optimizado en función del tipo de células y material de suministro del sistema se aplica a ciertos aspectos del procedimiento experimental descrito (es decir, factores distintos de diseño de chips y la velocidad de funcionamiento). La discusión que sigue trata sobre algunos de los factores más comunes a tener en cuenta en el diseño de experimentos.
Para mejorar la señal de entrega de compuestos marcados con fluorescencia, se necesita para hacer frente a las fuentes de la fluorescencia de fondo. Superficie de unión y la endocitosis, por ejemplo, puede ser abordado mediante el lavado de las células 5-10 minutos después del parto para eliminar el exceso de material antes de la cultura o de su procesamiento. Si la elección de renunciar a una etapa de lavado, que sería mejor para diluir las células tratadas por 5-10x en los medios de comunicación deseada para disminuir la concentración de material de blanco en la solución circundante y por lo tanto reducir las tasas de endocytotic. En algunos casos, como por ejemplo la entrega de proteínas, uno puede verse en la necesidad de bloquear activamente el surfa celularCE (por ejemplo, utilizando albúmina de suero bovino no marcado) para minimizar la unión no específica del material de suministro. En una aplicación dada, si la intensidad de fluorescencia del caso sin tratar, tal como se mide por citometría de flujo, es más de una década menor que la de control de la endocitosis a continuación, la superficie de unión / endocitosis puede ser un problema. Tenga en cuenta que los problemas con la señal de fondo sólo son relevantes para la detección fluorescente directa del material de entrega, ensayos funcionales (por ejemplo, la reprogramación de células) no suelen estar afectados como endocitosis o material unido superficie son a menudo inactivo.
Para mejorar la viabilidad de las células después del tratamiento, hay que minimizar la cantidad de procesamiento de post-parto. Se recomienda que uno evite centrifugación excesivo o etapas de lavado y las células de transferencia en su medio deseado en una incubadora a 5-10 minutos después de la entrega es completa. En líneas adherentes, las células son a menudo totalmente adheridos y dividiendo dentro 24 horas después del tratamiento. Como anterior discutidoiamente 20, no hemos observado ningún largo plazo los efectos secundarios derivados del uso de esta técnica.
Los dispositivos de microfluidos utilizados en este sistema de administración son propensos a la obstrucción con el tiempo. Zuecos a menudo se forman en el estrechamiento, ya que es la característica más estrecha en el dispositivo. La obstrucción puede ser causada por las células dañadas o por contaminantes ambientales. Efecto de este último se puede minimizar al garantizar un entorno limpio y sin polvo para el funcionamiento de los dispositivos (por ejemplo, un gabinete de seguridad biológica en buen estado). Para las líneas celulares, se recomienda células pases 1-2 días antes de la entrega con el fin de minimizar la presencia de restos de células en la suspensión resultante. Al operar el dispositivo, hay que ser conscientes de la velocidad de flujo volumétrico del fluido en el depósito. Si la velocidad de flujo se reduce a menos de un tercio de su velocidad inicial, el dispositivo puede ser la causa de la muerte celular excesiva y debe ser intercambiado, o la dirección del flujo invertido. Problemas de obstrucción potenciales también pueden ser mitigATED haciendo pasar la suspensión celular a través de un filtro de células de malla de 40 micras. Este proceso asegura una suspensión de células individuales evitando así obstrucciones potenciales de la formación en las secciones, baja tasa de flujo más amplios de la viruta.
Cuando el diseño de experimentos para diferentes materiales de suministro, hay que tener en cuenta el tamaño del material del blanco y su concentración. Como esta tecnología se basa en la difusión pasiva de material a través de la membrana de células rotas, el gradiente de concentración molar y el radio hidrodinámico del material de entrega regirán la tasa de transferencia de masa - asumiendo que las interrupciones de la membrana son lo suficientemente grandes para acomodar el material. Por tanto, es aconsejable usar concentraciones molares altas (por ejemplo, 1 m) de grandes materiales de blanco con respecto a sus homólogos más pequeños. La técnica ha demostrado la entrega eficaz a concentraciones tan bajas como 10 nM en el caso de la entrega de puntos cuánticos 21. Por otra parte, la técnica es npensado OT estar limitado por la naturaleza del material de entrega de destino, excepto en el contexto de tamaño del material y la difusividad (es decir, materiales de baja difusividad tendrán eficiencias de entrega más bajas y material mayor que el tamaño de las interrupciones probablemente no puede entrar en el citoplasma).
Los estudios realizados en la reprogramación celular y la entrega de puntos cuánticos han ilustrado los puntos fuertes de la compresión de células enfoque en relación con la electroporación. Sobre la base de la comprensión actual de los mecanismos de disrupción de la membrana en estas dos técnicas, parece que la compresión célula tiene una ventaja significativa en aplicaciones que implican proteínas, moléculas pequeñas, y los nanomateriales 20,21. El contraste entre los dos métodos en aplicaciones que implican ácidos nucleicos (que están altamente cargados en comparación con los materiales mencionados anteriormente) no está clara.
Este enfoque a la entrega de microfluidos se basa en la rotura mecánica de la membrana celular afacilitar la difusión pasiva de material en la célula y se ha demostrado que es aplicable a una gama de tipos de células 20. El sistema es por lo tanto apropiada en principal para la entrega citosólica de casi cualquier material a casi cualquier tipo de célula. Creemos que las ventajas del sistema son más pronunciadas en los casos relacionados tradicionalmente difíciles de transfectar células primarias (por ejemplo, inmunológico y las células madre) y los materiales convencionalmente difíciles (por ejemplo, las proteínas, los puntos cuánticos, nanotubos de carbono, y el ARN). El potencial mencionada en aplicaciones de células inmunes y madre se acentúa por las deficiencias de los métodos tradicionales de entrega para hacer frente a estos tipos de células. Sin embargo, el sistema puede requerir una mejora adicional para facilitar la entrega de genes por los vectores plasmídicos como estas aplicaciones requieren la entrega al núcleo. En resumen, creemos que el enfoque de la deformación de microfluidos para entrega puede potencialmente hacer frente a muchos desafíos existentes para el suministro intracelular. El systela independencia de m de vectores químicos o campos eléctricos permite su aplicación robusta para una serie de estudios. Las instrucciones proporcionadas en este documento deben permitir cualquier investigador interesado para operar un sistema de este tipo de forma independiente y adaptarlo para sus propósitos de investigación.
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Disclosures
Los autores Armon Sharei, Robert Langer, y Klavs F. Jensen son accionistas de SQZ Biotecnologías Empresa que produce los dispositivos de microfluidos utilizados en este artículo.
Acknowledgments
Damos las gracias a T. Shatova útil para el debate sobre el diseño experimental y análisis de datos. La ayuda y la experiencia de G. Paradis, el personal de la citometría de flujo básico en el Instituto Koch, y el personal del Laboratorio de Tecnología de Microsistemas en el Instituto de Tecnología de Massachusetts Se agradecen. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, y en parte por el Instituto Nacional del Cáncer Centro del Cáncer de Apoyo (Core) Subvenciones P30-CA14051 y MPP-09Call-Langer-60.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
References
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