Cell Klämma som en robust, mikroflödes Intracellular Delivery Platform

Summary

Snabb mekanisk deformation av celler har vuxit fram som ett lovande, vektor-fri metod för intracellulär leverans av makromolekyler och nanomaterial. Detta protokoll ger detaljerade steg om hur man använder systemet för ett brett spektrum av applikationer.

Abstract

Snabb mekanisk deformation av celler har vuxit fram som ett lovande, vektor-fri metod för intracellulär leverans av makromolekyler och nanomaterial. Denna teknik har visat potential att ta itu med tidigare krävande tillämpningar, inklusive leverans till primära immunceller, cell omprogrammering, Nanorör och quantum dot leverans. Denna vektor fria microfluidic plattform förlitar sig på mekanisk sönderdelning av cellmembranet för att underlätta cytosoliskt leverans av målmaterialet. Häri beskriver vi den detaljerade metoden för användning för dessa mikrofluidanordningar innefattande, anordningsenheten, förberedelse cell och systemets drift. Denna leverans metod kräver en kort optimering av enhetstyp och driftsförhållanden för tidigare orapporterade applikationer. De som instruktionerna är generaliserbara till de flesta celltyper och leveransmaterial eftersom detta system inte kräver specialiserade buffertar eller kemisk modifiering / konjugation steg. Detta arbete ger ocksås rekommendationer om hur man kan förbättra enhetens prestanda och felsöka eventuella problem i samband med igensättning, låga leveranseffektivitet, och cellernas livskraft.

Introduction

Leverans av makromolekyler till cellens cytoplasma är ett kritiskt steg i terapeutiska och forskningstillämpningar. Nanopartiklar medierad leverans, till exempel, har visat potential i genterapi ^1,2, medan proteinleverans är ett lovande sätt att påverka cellfunktioner i både kliniska ³ och laboratorie ⁴ inställningar. Andra material, såsom småmolekylära läkemedel, kvantprickar, eller guld nanopartiklar, är av intresse i allt från cancerterapi ^5,6 till intracellulär märkning ^7,8, och enda molekyl spårning ^9.

Cellmembranet är till stor del impermeabelt för makromolekyler. Många befintliga tekniker använder polymera nanopartiklar ^10,11, liposomer ¹² eller kemiska modifieringar ¹³ för att underlätta membran störningar eller endocytotisk leverans. I dessa metoder, leveranseffektivitet och cellviabiliteten är ofta beroende av strukturen av the målmolekyl och celltypen. Dessa metoder kan vara effektiva på att leverans av strukturellt enhetliga material, såsom nukleinsyror, men är ofta dåligt anpassade för avgivning av flera strukturellt skiftande material, såsom proteiner ^14,15 och nanomaterial ^7. Dessutom är ofta ineffektiv endosomen störningar mekanism att de flesta av dessa metoder är beroende av, och därför lämnar mycket material instängd i vesikel strukturer ^16. Slutligen, metoder som ofta är utvecklade för att användas med etablerade cellinjer inte översätta bra till primära celler.

Membranporeringsmetoder, såsom elektroporation ^17,18 och sonoporation ^19, är ett attraktivt alternativ i vissa program, men de är kända för att orsaka låg cellviabilitet och kan begränsas av laddningen av målet leveransmaterialet.

Rapid mekanisk deformation av celler, en mikroflödes tillvägagångssätt för leverans, har nyligen demonstratörerated dess fördelar jämfört med nuvarande tekniker i samband med cell omprogrammering ²⁰ och nanomaterial leverans ^21. Denna metod förlitar sig på mekanisk sprängning o cellmembranet för att underlätta cytosolisk avgivning av material som är närvarande i den omgivande bufferten. Systemet har visat möjliggör potential i tidigare utmanande celltyper (t.ex. primär immunceller och stamceller) och material (t.ex. antikroppar och kolnanorör). Häri är den allmänna proceduren för att använda dessa enheter för intracellulär leverans av mål makromolekyler beskrivs. Proceduren är generaliserbara till de flesta celltyper och leveransmaterial, dock är det rekommenderat att man gör en kort optimering av sjukdomstillstånd som anges i våra tidigare rapporterade designriktlinjer ^20, för alla tidigare orapporterade applikationer. Hittills har systemet använts framgångsrikt för avgivning av RNA, DNA, guld nanopartiklar, kvantprickar, kolnanorör, proteins, och dextran polymerer ^20,21.

Protocol

1. Förvaring

1. Lagra de reservoarer, hållare, O-ringar och mikrofluidikanordningar i 70% etanol. Använd en behållare (t.ex. burk eller bägare) som har ett lock för att förhindra avdunstning och kontamination av damm eller utanför partiklar. Placera enheterna i en behållare (1), kar och O-ringar i en andra behållare (2), och innehavare i den tredje (3).

Anmärkning: Användning av 70% etanol för förvaring är att bibehålla sterilitet. Om de enda komponenterna i lösningen är etanol och vatten (dvs. inga denatureringsmedel), ska alla systemkomponenter är helt kompatibla och kommer inte att försämras med tiden.

2. Ändra etanollösning i behållare (2) och (3) före varje användning för att förhindra korskontaminering mellan experiment och minimera förekomsten av oönskade partiklar som kan orsaka igensättning.

2. Experiment Framställning

1. Placera behållare (2) och (3) i ett ultraljudsbad for 5-10 min före varje användning. Detta hjälper till att ta bort alla förorenande partiklar från tidigare experiment.
2. Ren arbetsyta i biosäkerhet skåp med 70% etanollösning.
3. Spraya alla material (3 behållare, och pincett) med en 70% etanollösning innan du placerar dem i biosäkerhet skåpet.

3. Montering

1. Ställ ner 2-3 låg ludd våtservetter i arbetsområdet.
2. Ta bort plastbehållare ur sin behållare med pincett och ställa dem på våtservetter för att underlätta avdunstning av etanollösning från inre ytor. Knacka försiktigt på behållarna på ytan eller blåsa luft genom dem för att underlätta avlägsnandet av etanollösningen.
3. Sätt O-ringar i deras rätt kortplats på magasinen.
4. Ta bort hållaren och flis från respektive behållare och för att etanol avdunsta (~ 1-2 min).
5. Använd pincett för att placera önskad chipsidan uppåt (dvs. accesshålen uppåt) i hållaren. Höj hållarenmed chip för att eyelevel att se chipet ligger plant i hållaren och justera vid behov med pincetten. VIKTIGT: Om enheten inte passar i hållaren, finns det risk för att det kommer att bryta under de efterföljande stegen.
6. Därefter försiktigt placera behållarna på hållaren och rikta dem med klämmorna. Var försiktig så att O-ringarna inte faller ur sina slots under denna process.
7. Tryck försiktigt ned behållarna tills de klickar på plats. Se till att båda sidor av behållarna är säkra och att chip förefaller befinna sig i rätt position.

4. Cellberedning

1. För vidhäftande celler (primär eller etablerade linjer): Plate celler 1-2 dagar före experimentet så att de inte är mer än 80% sammanflytande på dagen för experimentet.
2. Placera celler i suspension (i PBS eller relevant media) och sikta på en rörelse koncentration av 1,0 x 10 ⁶ celler / ml till 1,0 x 10 ⁷ cells / ml. OBS: Vi har inte observerat betydande förändringar i leveransprecision på grund av cellkoncentrationen.
3. Blanda celler och den önskade tillförselmaterialet i ett separat rör för att erhålla den önskade materialkoncentration för experimentet. VIKTIGT: Eftersom den beskrivna leveransmetod bygger på diffusion för att underlätta leverans, kommer en högre materialkoncentration ger högre leverans. Om möjligt är det rekommenderat att använda en 1 ^ M lösning av det önskade materialet för första försöken. Denna koncentration kan därefter titreras i framtida experiment som behövs. Den lägsta rapporterade koncentrationen som används med den här enheten är 10 nM ^21.

5. Operation

1. Pipett blandning av celler och leveransmaterial i en behållare (nuvarande design har en max 150 l kapacitet). OBS: De flesta enhetsdesigner är fullständigt reversibla därför flödesriktning genom kanalerna spelar ingen roll. Prov kan laddas i endera av de två reservoarerna. Fäst tryckslangen till den fyllda behållaren och dra åt muttern för att säkerställa korrekt försegling (för hand är ofta tillräckligt).
2. Justera trycket till önskad nivå på regulatorn. Detta styr hastigheten med vilken celler färdas genom enheten. Observera att cellflödet inte startar förrän du trycker på knappen.

OBSERVERA: I tidigare arbeten har kväve eller tryckluft fungerade lika bra som bärargas.

4. Lyft enheten till ögonhöjd och rikta den så att vätskan i behållaren är väl synlig. OBSERVERA: Oss vätskepelaren för att stänga av systemet innan behållaren töms.
5. Tryck på knappen för att trycksätta behållaren och börja cellflöde.
6. När vätskenivån är cirka 2 mm från botten av behållaren, snabbt vända regulatorn till 0 psi för att stoppa flödet. VIKTIGT: Om man misslyckas med att stoppa flödet innan behållaren töms, riskerar man mata ut provet från collection reservoar. Observera också att om vätskan kolumnen inte rör sig med en märkbar takt, eller har avtagit betydligt i förhållande till sin ursprungliga flöde (t.ex. 3x långsammare), är monterade enheten antagligen igensatt och behöver bytas ut. Operativsystem en igensatt enhet kan leda till högre celldöd.
7. Samla de behandlade cellerna från den lämpliga behållaren och placera dem i det önskade provröret / platta. VIKTIGT: Späd inte de insamlade cellerna i alla buffertar i detta skede som de dats cellerna fortsätter att upptaget material i upp till 10 min ^20. Efter detta fönster har passerat, späd cellerna i den önskade media / buffert.
8. För att samla fler behandlade celler eller prova alternativa experimentella förhållanden, upprepa steg från 5,1 till 5,7 efter behov. Minns att chipsen är reversibla, och därför kan proverna monteras i endera reservoaren. Var noga med att byta marker som behövs om de täppa. Kassera tilltäppta enheter.

6. Demontering

1. Placera varje del i lämplig förvaringsbehållare (anges i avsnitt 1).
2. Placera används marker i en separat behållare för avfallshantering.

Representative Results

Figur 1 innehåller en beskrivande schematisk bild av mikrofluidleveranssystem. Figurerna 2a-b illustrerar typiska resultat från behandling av HeLa-celler med olika enhetsdesigner i närvaro av fluorescerande konjugerad 3 kDa dextran ^20. Om proceduren följs korrekt, kommer systemets prestanda är känslig för enhetstyp och rörelsehastighet. Därför bör man optimera dessa förutsättningar för en given tillämpning innan du går vidare till mer komplexa experiment. I utbudet av driftsförhållanden som illustreras i figuren, förblir cellviabiliteten över 80%, dock måste man notera att suboptimala leveransparametrar (t.ex. olämpligt chip typ) kan leda till viabilitet under 30%. Således lönsamhet och leveranseffektiviteten måste optimeras samtidigt för någon tidigare orapporterade celltyp. Om en enhet design är olämpligt för den typ målcellen, kommer man se resultat som sträcker sig från ingen leverans till höga c.ell död (t ex 10% viabilitet). Om de experimentella betingelserna var olämplig, exempelvis målmaterialet bundet till cellytan, en kanske inte kan mäta leverans exakt som ytan bindande signalen kan maskera den cytoplasmatiska signal.

Figurerna 2c-d illustrerar vår bästa metoden för att mäta leveranseffektivitet inom den levande cellpopulation. Kontroll fallet i figur 2c är tänkt att spegla all yta bindande och endocytotisk effekter som cellerna utsätts för leveransmaterialet för åtminstone så länge som de behandlade fallen. Den levererade cellpopulationen är definierad som den oskuggade området så att endast 1-5% av kontrollpopulationen ligger inom detta område. Observera att tidigare arbete har visat att leverans i detta tillvägagångssätt inte medieras av endocytos ^20. Det dubbeltopp fördelning observerades i den levererade exempel är inte nödvändigtvis kännetecknande för systemet som vi have observerade fler och mindre likformiga fördelningar för olika experimentella förhållanden.

Figur 1. S chematic av hela systemet och dess gränssnitt till mikroflödessystem enheter. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Representativa resultat med HeLa-celler ^20. A) Leverans effektivitet och b) cellviabiliteten av HeLa-celler behandlade med tre olika enhetsdesigner i närvaro av kaskad blå konjugerad 3 kDa-dextran (0,2 mg / ml). I dessa experiment cellen solution var vid en koncentration av 10 ⁶ celler per ml i PBS innehållande 3% fetalt bovint serum och 1% F68 pluronics. Viabilitet mättes genom propidiumjodid-färgning av döda celler och leverans resultaten visas endast för levande celler. Alla datapunkter kördes i tre exemplar, och felstaplar representerar 2 SD. C) Ett representativt histogram för en experimentell kontroll där HeLa-celler exponerades för kaskad blå konjugerad 3 kDa dextran under minst lika lång tid som en enhet behandlat fallet. d) motsvarande fallet där cellerna fick passera genom anordningen för att underlätta leverans. Den del av den levande cellpopulation som är i oskuggade området i histogrammet definieras som "levererade" befolkning. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Vissa aspekter av det beskrivna försöksförfarandet (dvs. andra än chipdesign och drifthastighet faktorer) kan behöva optimeras beroende på vilken celltyp och tillförselmaterialet systemet appliceras. Diskussionen som följer adresser några av de vanligaste faktorer att tänka på när man utformar experiment.

För att förbättra leveransen signalen för fluorescensmärkta föreningar, måste man ta itu med källor till bakgrundsfluorescens. Surface bindning och endocytos, till exempel, kan behandlas genom att tvätta cellerna 5-10 min efter leverans för att avlägsna överskottsmaterial innan odling eller ytterligare bearbetning. Om att välja att avstå från ett tvättsteg, skulle det vara bäst att späda ut de behandlade cellerna med 5-10x i önskad media för att sänka koncentrationen av målmaterial i den omgivande lösningen och därmed minska endocytotisk priser. I vissa fall, till exempel proteinleverans, kan man finna det nödvändigt att aktivt blockera cell surface (t.ex. med användning av omärkt bovinserumalbumin) för att minimera icke-specifik bindning av tillförselmaterialet. I en given tillämpning, om fluorescensintensiteten hos den obehandlade fall, såsom mätt med flödescytometri, är över ett decennium lägre än endocytos kontroll sedan ytbindande / endocytos kan vara ett problem. Observera att problem med bakgrundssignal är endast relevant för fluorescent detektion av leveransmaterialet, funktionella analyser (t.ex. cell omprogrammering) är oftast opåverkad som endocyteras eller yta bundna material är ofta inaktiva.

För att förbättra viabiliteten hos cellerna efter behandling, ett behov att minimera mängden bearbetning efter leverans. Det rekommenderas att man undviker överdriven centrifugering eller tvätta steg och överföringsceller in sin önskade media i en inkubator 5-10 min efter att leveransen är komplett. I tillhörande rader, celler ofta helt efterlevs och dividera inom 24 timmar efter behandling. Såsom diskuterats previously ²⁰ har vi inte observerat några långsiktiga biverkningar från användning av denna teknik.

De mikrofluidanordningar som används i detta leveranssystem är benägna att igensättning med tiden. Träskor bildar ofta vid förträngningen som det är den smalaste funktionen på enheten. Igensättning kan orsakas av skadade celler eller av miljöföroreningar. Den senare effekt kan minimeras genom att säkerställa en ren, dammfri miljö för att driva enheter (t.ex. en välskött biosäkerhet skåp). För cellinjer rekommenderar vi passaging celler 1-2 dagar före leverans för att minimera förekomsten av cellfragment i den resulterande suspensionen. Vid drift av anordningen, måste man vara uppmärksam på den volymetriska flödeshastigheten hos fluiden i reservoaren. Om flödeshastigheten sänks till mindre än en tredjedel av dess ursprungliga satsen, kan anordningen att orsaka överdriven celldöd och bör utbytas, eller flödesriktningen omkastad. Potentiella igensättningsfrågor kan också mitigated genom att passera cellsuspensionen genom ett 40 | im cellfilter mesh. Denna process säkerställer en enkelcellsuspension och förhindrar därigenom potentiella träskor från att bildas i de bredare och låga sektioner av spånflödet.

Vid utformningen av experiment för olika tillförselmaterial, måste en står för storleken på målmaterialet och dess koncentration. Eftersom denna teknik förlitar sig på passiv diffusion av material över den avbrutna cellmembranet, kommer det molära koncentrations-gradient och den hydrodynamiska radien hos tillförselmaterialet styra hastigheten för massöverföring - förutsatt att membranstörningar är tillräckligt stora för att rymma materialet. Det är därför tillrådligt att använda höga molära koncentrationer (t ex 1 | iM) för stora målmaterial i förhållande till deras mindre motsvarigheter. Tekniken har visat effektiv leverans vid koncentrationer så låga som 10 nM i fallet med quantum dot leverans ^21. Dessutom är den teknik not tros vara begränsad av vilken typ av mål leveransmaterialet utom i samband med materialstorlek och diffusivitet (dvs. låg diffusivitet material kommer att ha lägre leverans effektivitet och material större än storleken på de störningar förmodligen inte kan komma in i cytoplasman).

Studier i cell omprogrammering och quantum dot leverans har visat styrkan i cellens klämma synsätt i förhållande till elektroporation. Baserat på nuvarande kunskap om de membranstörningsmekanismerna i dessa två tekniker, verkar det som att cell klämma har en betydande fördel i applikationer som involverar proteiner, små molekyler och nanomaterial ^20,21. Kontrasten mellan de två metoder i tillämpningar som innefattar nukleinsyror (som är starkt laddade jämfört med de tidigare nämnda materialen) är oklar.

Denna mikroflödes förhållningssätt till leverans är beroende av mekanisk störning av cellmembranet tilllätta passiv diffusion av material in i cellen och har visat sig vara tillämplig på en rad olika celltyper ^20. Systemet är således i princip är lämpligt för den cytosoliska leverans av nästan vilket material som helst till nästan alla celltyper. Vi tror systemets fördelar är mest uttalad i fall som rör traditionellt svårt att transfektera primära celler (t.ex. immun och stamceller) och konventionellt utmanande material (t.ex. proteiner, kvantprickar, kolnanorör, och RNA). Den tidigare nämnda potential i immun-och stamcellstillämpningar betonas av bristerna i traditionella leveransmetoder i itu med dessa celltyper. Emellertid kan systemet därför måste förbättras för att underlätta genleverans av plasmidvektorer som dessa applikationer kräver leverans till kärnan. Sammanfattningsvis tror vi mikroflödes deformation förhållningssätt till leverans kan potentiellt hantera många befintliga utmaningar för intracellulär leverans. Den systemam självständighet från kemiska vektorer eller elektriska fält gör sin robusta tillämpning på en rad studier. Instruktionerna som tillhandahålls här bör göra det möjligt för alla intresserade forskare att driva ett sådant system självständigt och anpassa den för sina forskningsändamål.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Holder & Plastic reservoir	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa Analyzer	Becton Dickinson	N/A	Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device	SQZ Biotechnologies	Cell Squeeze
O-Rings	McMaster	9452K311
Pressure system to operate device	SQZ Biotechnologies	Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath