Summary
Två tekniker för att isolera cellulära lipiddropparna från 1) jästceller och 2) mänskliga moderkakor presenteras. Det viktigaste i båda förfarandena är densitetsgradientcentrifugering, där den resulterande flytande lager som innehåller dropparna kan lätt visualiseras genom ögat, extraherade, och kvantifieras med Western blot-analys för renhet.
Abstract
Lipiddropparna är dynamiska organeller som finns i de flesta eukaryota och vissa prokaryota celler. Strukturellt dropparna består av en kärna av neutrala lipider som omges av en fosfolipid-monoskikt. En av de mest användbara tekniker i att bestämma de cellulära roller dropparna har varit proteomic identifiering av bundna proteiner, som kan isoleras tillsammans med de små dropparna. Här är två metoder som beskrivs för att isolera lipiddropparna och deras bundna proteiner från två omfattande eukaryoter: fission jäst och mänskliga placenta villösa celler. Även om båda teknikerna har skillnader, den viktigaste metoden - densitetsgradientcentrifugering - delas av de båda preparaten. Detta visar den breda tillämpningen av de presenterade droppisoleringstekniker.
I det första protokollet, är jästceller omvandlas till sfäroplasterna genom enzymatisk nedbrytning av deras cellväggar. De erhållna sfäroplaster därefter gently lys i en löst sittande sator. Ficoll tillsättes till lysatet för att ge en densitetsgradient, och blandningen centrifugerades tre gånger. Efter den första spin är de lipiddropparna lokaliserad till vitfärgad flytande skikt av centrifugrören tillsammans med det endoplasmatiska retiklet (ER), plasmamembranet, och vakuoler. Två efterföljande snurrar används för att ta bort dessa tre andra organeller. Resultatet är ett skikt som har endast droppar och bundna proteiner.
I det andra protokollet, är moderkakan villösa celler som isolerats från mänsklig sikt ntas genom enzymatisk spjälkning med trypsin och DNas I. Cellerna homogeniseras i en löst sittande sator. Låg hastighet och medelhastighetscentrifugeringssteg används för att avlägsna hela celler, cellrester, cellkärnor, och mitokondrier. Sackaros tillsätts till homogenatet för att ge en densitetsgradient, och blandningen centrifugeras för att separera de lipiddropparna från den andra cellular fraktioner.
Renheten hos lipiddroppar i båda protokollen bekräftas genom Western blot-analys. Droppen fraktionerna från båda preps är lämpliga för efterföljande proteomic och lipidomic analys.
Introduction
Cellulär lipiddropparna är dynamiska organeller som behandlar flera funktioner i celler. De är förvarings nav för neutrala lipider, som kan omvandlas till energi eller används för fosfolipid syntes. Dropparna spelar centrala roller i fysiologiska och patologiska tillstånd innefattande ateroskleros, fetma och metaboliska sjukdomar, och även infektionssjukdomar 1,2. Dessutom, de är spännande källor för biodieselbränslen.
Mycket information om de cellulära roller lipiddropparna har erhållits från proteomik och lipidomic analys av droppar som renats från omfattande organismer 3. Dessa organismer har inkluderat bakterier 4,5, jäst 6-11, växter 12,13, nematoder 14, och flyger 15,16. Med tanke på intresset av rollen av lipiddroppar i humana metaboliska sjukdomar, har dropparna också isolerats från odlade djurceller och ennimal vävnader. Odlade cellinjer har inkluderat 3T3-L1 adipocyter 17, kinesisk hamsterovarie-(CHO)-K2-celler 18, mänskliga hepatocyes 19,20 och epitelcellinjer 21. Djurvävnader som droppar har isolerats har inkluderat musen skelettmuskel 22, lever 23, och bröstkörtlar 23. Såsom nämnts ovan är målet för de flesta droppisoleringsstudier att utföra proteomic analys på de bundna faktorer och lipidomic analys på den neutrala och fosfolipider.
Eftersom neutrala lipider - den mest talrika komponent av lipiddropparna - är mindre tät än de flesta andra cellulära material, har isolering av droppar som traditionellt utförts med hjälp av densitetsgradientcentrifugering. Denna teknik är mittpunkten i båda preps presenteras här. Tidigare tekniker 6,24 kombineras och modifieras till en visuell presentation av isoleringen av droppar från odlade fissionsjäst celleroch noncultured humana celler erhållna från placenta-vävnad. Målet är att visa den breda tillämpligheten av denna teknik genom att välja två väldigt olika celltyper som utgångspunkter för dropp isolering. Denna teknik bör vara användbart för den som vill isolera droppar från de flesta organismer.
Protokoll 1 beskriver isolering av lipiddroppar från fissionsjäst, Schizosaccharomyces pombe, som har använts som en modell för att observera droppbildning under eukaryotisk celldelning 25. Den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae har använts i stor utsträckning som modellorganism för att studera fettdropp biologi. Protokoll 1 gäller för både organismer och skillnader i förberedelserna är markerade.
Protokoll 2 beskriver isolering av blodfettdroppar från placental villösa celler, som i sin tur är erhållen från humant Undersökningar moderkakor. Deninsamling av långsiktiga placentas ger en unik möjlighet att på ett säkert och etiskt få 200-250 g lättillgängliga mänsklig vävnad 26, som innehåller ett stort antal fettdroppar. Detta är i motsats till de flesta lipid droplet isolering arbete i högre eukaryoter, där dropparna kommer från odlade celler. Under dessa studier används fettsyror ofta tillsätts till odlings att främja syntesen av neutrala lipider och därmed tillväxten av små droppar. Detta är i motsats till det arbete här där lipid droppar bildas under nativa betingelser i placenta-vävnad.
De renheter av lipiden dropp fraktionerna bestämdes genom Western blot-analys med användning av organell markörantikroppar. Dessa två protokollen kommer att ge lipid droplet fraktioner som är lämpliga för efterföljande proteomic och lipidomic analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolera lipiddropparna från (Fission) jästceller
Isolering av droppar från den populära modellorganism knoppande jästen Saccharomyces cerevisiae är nästan identiskt med det följande protokollet 6. Skillnader i beredningarna noteras.
1. Odling av jästceller
- Förbered media. Kombinera 36 g YE5S pulver per liter dH 2 O i glasflaskor eller odlingsflaskor. Kommer att behövas om 2 L av media. Autoklavera medierna vid 121 ° C under 20 min. Tillåt media för att svalna till rumstemperatur. För S. cerevisiae ersätta YE5S med YPD.
- Placera 10-20 ml av de kylda YE5S media i en 250 ml odlingskolv med sterila tekniker. Inokulera mediet med en liten mängd av jästceller från en agarplatta med användning av en steril trästicka eller motsvarande. Låt cellerna växa till den önskade optiska tätheten vid 30 ° C. Mät den optiska tätheten vid envåglängd av 595 nm med användning av en spektrofotometer.
- Placera de återstående material i 2.8 L flaskor. Använd inte mer än 1 liter medium per 2,8 L flaska för att säkerställa korrekt blandning under celltillväxt i den skakande inkubator. Det slutliga utbytet av våta celler bör vara ca 10 g för att kunna skaffa sig tillräckligt lipiddropparna för proteomik och lipidomic analys.
- Presentera cellerna från steg 1.2 i 2.8 L flaskor vardera med 1 L av media som har upprättats i steg 1.1.
- Odla cellerna till den önskade densiteten vid 30 ° C.
- Kontrollera att cellerna har lipiddroppar. Reserv 1 ml av cellerna. Mät den optiska tätheten (OD) av provet. Lägg till 0,1 ml av en 100 mM lager av BODIPY 493/503 i etanol per OD av celler till provet. Placera 3 l av provet mellan en glasskiva och ett glas täckglas. Visualisera under ett fluorescensmikroskop med en GFP-filter (Figur 1A).
- Pellets cellerna från steg 1,5 vid 4 & #176, C vid 3800 xg under 10 minuter. Arbete i omgångar beroende på kapaciteten av centrifugrören.
- Häll bort YE5S media och tvätta cellerna med en buffert av EMM + 600 mM sorbitol. Sorbitol ger osmotisk stöd.
- Överför cellerna till en steril 50 ml centrifugrör och pelletering av cellerna vid 4 C vid 2000 x g under 10 min. Avlägsna supernatanten. Väg våta celler. Resuspendera cellerna i 2 ml (EMM + 600 mM sorbitol)-buffert per gram celler.
2. Converting fissionsjäst celler till sfäroplaster och efterföljande lys
- Lägg till 5 mg vardera av 1) jäst lytiskt enzym och 2) jäst lyse enzymer från Trichoderma harzianum per gram våta celler som vägdes i steg 1.9. För S. cerevisiae öka dessa enzymer med samma mängd Zymolyase.
- Inkubera cellerna vid 30 ° C under försiktig skakning vid 100 rpm under 60 min.
- Kontrollera att se till att sfäroplasterna har lipid droplets. Genom att upprepa steg 1,6 (Figur 1B).
3. Densitetsgradientcentrifugering
- Pelletera sfäroplasterna genom centrifugering vid 4 ° C vid 2000 x g under 5 min.
- Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av en plast överföringspipett.
- Försiktigt resuspendera de pelleterade sfäroplasterna med iskall 10 mM Tris-HCl, 600 mM sorbitol, och 200 | iM EDTA. Tänk på att sfäroplasterna är mycket bräcklig.
- Pelle sfäroplasterna igen med samma inställningar som i steg 3.1. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera sfäroplaster med hjälp av en plast överföringspipett i 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl, och 200 | iM EDTA vid en koncentration av 2 ml / g-celler.
- Överför resuspenderade sfäroplasterna till en glashomogenisator och försiktigt homogenisera på is, 20-30 slag, med löst sittande mortelstöt av glashomogenisator.
- Överför lyserade sfäroplasterna till centrifugrör och overlay med samma vodeln på 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl, och 200 ^ iM EDTA-buffert. Välj antalet centrifugrör att använda så att varje rör är ungefär två tredjedelar.
- Centrifugera vid 4 ° C vid 100000 x g under 1,5 h i en SW28 rötor eller motsvarande. Låt rotorn till kust stannar (rotorhastighetsminskning = 0).
- Försiktigt överföra topp flytande vitt skikt (figur 2A), som innehåller de små dropparna, i ett annat centrifugrör (er) med användning av antingen en pipett eller en böjd Pasteur-pipett. Tillsätt tillräckligt med volym av 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl, och 200 ^ iM EDTA-buffert till provet så att det fyller i stort sett en tredjedel av centrifugröret.
- Tillsätt samma volym 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl, och 200 ^ iM EDTA-buffert till toppen av provet (er) i den nya centrifugrör (er). Efter tillsats av denna buffert rören bör vara ca två tredjedelar.
- Centrifugera vid 4 ° C vid 100000 x g under 1 h i en SW28 rötor eller motsvarande. Låt rotorn till kusten till ett stopp (rOTOR retardation = 0).
- Försiktigt överföra topp flytande vitt skikt (figur 2B), som kommer att innehålla de små dropparna, i ett annat centrifugrör (er) med användning av antingen en pipett eller en böjd Pasteur-pipett. Addera 600 mM sorbitol, 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl, och 200 ^ iM EDTA-buffert till provet så att den fyller ungefär en tredjedel av centrifugröret.
- Tillsätt samma volym 250 mM sorbitol, 10 mM Tris-HCl, och 200 ^ iM EDTA-buffert till toppen av provet (er) i den nya centrifugrör (er). Efter tillsats av denna buffert rören bör vara ca två tredjedelar.
- Centrifugera vid 4 ° C vid 100000 x g under 1 h i en SW28 rötor eller motsvarande. Låt rotorn till kust stannar (rotorhastighetsminskning = 0).
- Överför översta vita lagret (figur 2C), som bör innehålla endast lipiddropparna och bundna proteiner, till dialysslangen, och dialyze O / N i 10 mM Tris-HCl och 200 ^ M EDTA-buffert för att eliminera Ficoll.
Moderkakor samlades in från friska kvinnor med singleton graviditeter genomgår elektiv kejsarsnitt leverans före uppkomsten av spontana arbetskraft på sikt. Ämnen gav skriftligt informerat samtycke till insamling av deras moderkaka. Samlingen, och senare användning, av moderkakor utfördes med godkännande från University of Tennessee och University of Tennessee Graduate School of Medicine i Knoxville Institutional Review Board (# 8757B och # 3338, respektive).
1. Isolera humana placenta villösa celler
Del 1 i protokollet är en ändring av ett tidigare publicerat protokoll från Petroff et al. 26
Förbered följande lösningar:
- NaCl (1 L): lös 9 g NaCl (M 58,4 g / mol) i dH 2 O för att ge en 1 L lösning. Filtrera sterilisera (0,2; Xm membran).
- 10x Hanks balanserade saltlösning (10x HBSS) (1 L): 4 g KCl (M 74,5 g / mol), 0,6 g KH 2 PO 4 (M 136,086 g / mol), 80 g NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol), 10 g D-glukos (M 180,16 g / mol). Lös upp var och en av beståndsdelarna i dH 2 O för att ge en 1 L lösning. Filtrera sterilisera (0,2 | im-membran).
- Enzymdigereringsbuffert (0,6 ml): kombinera 70 ml 10x HBSS med 3,3 ml 7,5% Na-Biscarbonate, 17,5 ml 1 M HEPES och 266,1 ml dH 2 O; filtrera sterilisera (0,2 ^ m membran). Förvaras vid 4 ° C.
- DNas I: strax före användning, tillsätt 5 ml steril 0,9% NaCl till en flaska med DNas. Håll på is tills användning eller förvara vid -20 ° C.
- Förbereda placenta för dissektion
- Erhåll en human placenta och processen så nära tidpunkten för leverans som möjligt. Använd ett tillslutet kärl, såsom en kylare för att transportera moderkakan. Var alltid försiktig när handenling mänskliga biologiska material.
- I den biologiska säkerhetshuven, överföra moderkakan till en steril autoklaver behållare, och försiktigt tvätta blod från moderkakan och membran med hjälp av steril 0,9% NaCl (saltlösning) lösning. Kasta blodiga saltlösning i 1 L bägare som flytande biologiskt avfall.
- Placera moderkakan på ett sterilt område, med den släta ytan med navelsträngen uppåt. Med skarpa, fin-punkt sax och pincett bort fosterhinnor och navelsträngen.
- Vänd moderkakan över så att moderns ytan (ojämn yta) är vänd uppåt. Ta bort den överliggande basala plattan vävnad, ca 3 mm från ytan.
- Gå igenom moderkakan
- Dissekera en cotyledon i taget undvika chorionic plattan. Samla villous vävnad in i en 250 ml bägare med saltlösning.
- Skölj vävnads flera gånger i en separat bägare med 0,9% NaCl genom att snurra med pincett, med hjälp av 1 L bägare för flytande avfall.
- Överför en kotyledon i taget till en 150 mm petriskål. Håll med pincett och skrapa vävnad med rakblad från fartyg på petriskål. Placera skrapas vävnad i separat bägare innehållande 0,9% NaCl. Upprepa för alla vävnadsbitar.
- Överför liten del av vävnaden till den cell dissociation sikt och sköljdes med 0,9% NaCl utför tills eluatet blir klart. Upprepa för alla vävnader.
- Efter sköljning av skrapade vävnaden i cellen dissociation såll, dränera det av överflödig vätska och vikt.
Vid denna punkt i vävnaden kan lagras O / N i en steril Erlenmeyer-kolv vid 4 ° C i DMEM.
- Enzymatisk spjälkning av placentavävnad
- Förbered vävnaden matsmältningen blandningen: 100 ml förvärmd enzymutspädningsbuffert, 1 ml DNas I och 20 ml 2,5% 10x trypsin.
- Dividera vävnaden, överföra 60 g från total insamlad vävnad (vanligen ca 250 till 300 g) till en 500 ml steril Erlenmeyerkolv.
- Uppsamling av de dissocierade celler
- Efter de första 45 min dissociation, ställa kolven vid en lutning tills vävnad lägger sig.
- Samla supernatanten, se till att inte samla odissocierad vävnad. Tillsätt en lika mängd av HBSS till den insamlade supernatanten och överför till sterila 15 ml centrifugrör. För ytterligare delar av odissocierad vävnad, upprepa proceduren från steg 3.2 med odissocierad vävnaden.
- Centrifugera homogenatet vid 4 ° C vid 1000 x g under 15 min.
- För varje parti, efter centrifugering, aspirera supernatanten utan att störa pelleten. Placenta villösa celler är övervägande i den vita delen av pellets, som ligger över de röda blodkropparna.
- Överför villösa celler (vita delen av pellets) till en sterile 50 ml koniskt centrifugrör och hålla på is.
- Efter uppsamling av cellerna från alla tre digereringssteg filtreras suspensionen med användning av en 100 | im Nylon cellfilter in i den övre delen av ett sterilt 50 ml koniskt centrifugrör. Om filtrering av cellsuspensionen avtar, lyft uppåt på filtret för att dra ett vakuum inom röret.
- Centrifugera vid 4 ° C vid 1000 x g under 10 min. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten.
2. Homogenisering placental villösa celler
- Innan man börjar med isoleringsprocessen, förbereda 50 ml hypoton lyseringsmedium (HLM) innehållande 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 och 1 mM EDTA. Lägg proteashämmare till HLM strax före användning och förvara mediet på is.
- I den biologiska skyddshuv, tillsätt 4 gånger cellpelleten volym iskall HLM till cellerna. Försiktig och noggrann suspendera cellerna genom att pipettera cellerna upp-end-ner med användning av en 10 ml pipett.
- Inkubera de suspenderade cellerna på is under 10 min.
- Överför cellerna till Dounce-homogenisator, som bör vara på is. Sakta homogenisera cellerna genom att tillämpa 20-25 försiktiga rörelser med löst sittande mortelstöt av homogenisator.
- Centrifugera cellysatet vid 4 ° C vid 3000 x g under 10 min för att avlägsna hela celler, cellrester och cellkärnor.
- Samla upp supernatanten och överföra till ett SW28-rör (eller alternativ som kan centrifugeras vid 25000 x g). Centrifugera vid 4 ° C vid 25000 x g under 20 min för att avlägsna mitokondrier.
3. Isolera lipiddropparna genom ultracentrifugering
- Bered 50 ml av 100 mM natriumkarbonat (M 106 g / mol)-buffert (pH 11,5) och 50 ml av 60% sackaros (vikt / vikt) lösning. Lägg proteashämmare till natriumkarbonat buffert strax före användning och förvara på is.
- Samla supernatanten från steg 2,6 i ett 50 ml centrifugrör, justeratill 20% sackaros och överföring in i botten av en ultracentrifug-rör för en SW28 rötor, eller motsvarande. Overlay densitet justerades supernatanten med ~ 10 ml av iskall 100 mM natriumkarbonatbuffert (pH 11,5) och 0,5 till 1 ml iskall HLM för att fylla röret.
- Centrifugera vid 4 ° C vid 130000 x g under 45 min med användning av SW28 swinging bucket rötor. Låt rotorn till kust stannar (rotorhastighetsminskning = 0).
- Samla det flytande skiktet, justera till 10% sackaros och överför till botten av ett 13,2 ml ultracentrifugrör för en SW41Ti rötor, eller motsvarande. Overlay densitet justerades supernatanten med cirka 5 ml iskyld 100 mM natriumkarbonatbuffert (pH 11,5) och 0,5 ml iskall HLM.
- Centrifugera vid fyra C vid 274.000 g under 60 min med användning av SW41Ti svängrotor. Låt rotorn till kust stannar (rotor retardation = 0) för att minimera störningar av fettdropplagret.
- Försiktigt samla topp flytande lagret (figur 2D) som innehållerlipiddropparna med en 1 ml pipett och upprepa steg 3.4.
- Centrifugera vid 4 ° C vid 274000 x g under 30 min med användning av SW41Ti swinging bucket rötor. Låt rotorn till kust stannar (rotorhastighetsminskning = 0).
- Försiktigt samla den översta vita-färgade flytande lager som innehåller lipid droppar med en böjd pastörpipett i tre 1,5 ml rör som innehåller 100 ^ HLM.
Characterizing lipiddropparna fraktion (protokoll nr 1 och 2)
Kan verifieras Återhämtningen och renhet av lipiden droppfraktion genom Western Blöt kombineras med ljus eller elektronmikroskopi. Dessutom kan alikvoter efter olika centrifugeringssteg samlas in och bevaras för att bestämma effektiviteten rening. I Western blotting, är det lämpligare att jämföra en volym av lipid droppfraktionen som utgör en motsvarighet till helcellslysat än att jämföra lipiddropparna till andra membranfraktioner på tHan grundval av den totala proteinhalten 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om densitetsgradientcentrifugering fungerat som förväntat, bör den flytande lagret innehålla lipiddropparna och vara uttömda av andra organeller genom utvecklingen av de snabba snurrar.
För protokoll 1 ades Western blöts utfördes med markerings antikroppar till lipiddroppar (Erg6p) och organeller som har visat sig interagera med lipiddroppar i jäst, ER (Dpm1p), mitokondrier (Por1p), plasmamembran (Pma1p) och vakuoler (Vma1p).
Lika stora volymer av den flytande lagret av vardera tre spinn (steg 3,7, 3,10 och 3,13) uppsamlades, fälldes ut med triklorättiksyra (15% slutlig koncentration), och solubiliserades i vatten. 13 ml av cell-lysat (figur 3A, "Lys") och protein prep av vardera tre spinn (figur 3A, "Spin1", "Spin2" och "Spin3") separerades på 12% SDS-PAGE, överfördes till nitrocellulosa membran och immunblottades med organell specific-antikroppar. Som väntat är lipiden droppmarkörprotein Erg6p närvarande i det flytande skiktet efter varje av de tre spinn (figur 3A); Por1p inte är närvarande i det flytande skiktet efter Spin1 (figur 3A); Vma1p utarmas från den flytande skiktet efter Spin2 (figur 3A), och Dpm1p och Pma1p inte är närvarande i det flytande skiktet efter Spin3 (figur 3A).
För protokoll 2, var förekomsten av fettdroppar som isolerats från mänsklig sikt placenta villösa celler verifieras genom färgning med en neutral lipid specifik fluorescens färgämne, BODIPY 493/503. De små dropparna därefter visualiserades under ett fluorescensmikroskop (figur 3B). Renheten hos de isolerade lipid droplet fraktioner utvärderades genom Western blotting med markörproteiner för lipiddroppar (Perilipin 2), ER (kalnexin), Golgi (GM130), mitokondrier (COX IV) och plasmamembran (MEK1) (figur 3C). Den lipid droplets var de-lipiderad med kall aceton och proteinerna extraheras. Lika procentsatser av post-nukleära supematanten (PNS), fraktionen under den flytande skiktet av det sista centrifugerings (steg 3,6, "Spin4" på fig 3C), den efterföljande tvättsteg (steg 3,8, "Spin5" på fig 3C), och de-lipiderade proteinet prep av flytande lipid droplet skiktet (steg 3,8, "LD" på fig 3C) separerades på 12% SDS-PAGE, överfördes och immunblottades med angivna antikropparna. Perilipin 2 (även känd som ADRP), lipid droplet protein, detekterades i postnukleära supernatanten och i isolerade vit flytande skikt innehållande lipiddroppar. Proteiner specifika för plasmamembran (MEK1) och Golgi (GM130) inte registreras i lipid droppfraktioner i endera skikt under det flytande lagret för Spin4 och Spin5. Som tidigare rapporterats, har ER protein kalnexin 18,27,28 och en svag färgning av mitokondriell membranproteinet COX IV varit DETECTED annorstädes i lipiden dropp fraktion 22. Dessa resultat överensstämmer med tidigare rapporter som visar att fettdroppar samverkar med mitokondrier i däggdjursceller 29 och med ER 30,31.
Figur 1. Cellular lipiddropparna i klyvningsjästceller. (A) Bright fält (BF) och brett fält fluorescens (Lysrör) bilder av sex representativa fission jästceller där lipiddropparna är färgade med BODIPY 493/503. (B) Bright fält (BF ) och brett fält fluorescens (Lysrör) bilder av en representativ sferoplast där lipiddropparna är färgade med BODIPY 493/503. Skala barer är 1 mm. Klicka här för att se en större version of denna figur.
Figur 2. Flytande lager efter densitetsgradientcentrifugering. Centrifugrör efter (A) Spin1 (steg 3,8), (B) Spin2 (steg 3.11) och (C) Spin3 (steg 3.14) i protokoll 1. (D) Centrifugrör efter Spin4 (steg 3,6) i protokoll 2. De flytande skikt innehållande lipiddropparna indikeras med pilar.
Figur 3. Analys av renheten av de isolerade fettdropparna. (A) Western blöt av viktiga steg i protokoll nr 1. Lika volymer av varje protein prep (Spin1 - steg 3,7, Spin2 - steg 3.10, och Spi n3 - steg 3,13) separerades genom SDS-PAGE, överfördes till nitrocellulosamembran och immunblottades med antikroppar för Erg6p (LD, lipiddropparna) Dpm1p (ER), Por1p (MT, mitokondrier), Pma1p (PM, plasmamembran), och Vma1p (vakuoler). (B) Faskontrast (PC) och brett fält fluorescens (Lysrör) bilder av BODIPY 493/503-stained lipiddropparna som har isolerats från human placenta villösa celler. (C) Western blotting av viktiga steg i protokoll nr 2. Likprocentig pf PNS (efter kärnkrafts supernatant), supernatant under det flytande lagret efter den sista spinn (Spin4 - steg 3.6), efterföljande tvätt (Spin5 - steg 3.8), och flytande lager (LD) separerades med SDS-sidan, överfördes till membran och immun med antikroppar för Perilipin 2 (LD, lipiddropparna), kalnexin (ER), GM130 (Golgi matrisprotein, Golgi), COX IV (cytokrom c oxidas, MT, mitokondrier), och MEK1 (MAPK-kinas, PM, plasma membranet).ad/50981/50981fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version i denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i detta protokoll
Se till att vara konsekvent med media och celldensiteter under tillväxt av odlade celler. Cellulära lipiddropparna är unika i att de har associerade proteiner är i hög grad beroende av den omgivning i vilken cellerna odlas 17. Därför bör mediet i vilket cellerna odlas och densiteten av cellerna övervakas noggrant före lys.
Proteinsammansättningen av lipiddroppar är en funktion av tillväxtfasen av jästcellerna. Färre proteiner kommer att bindas till dropparna i log tillväxtfas kontra stationär fas. Också spheroplasting effektivitet är en funktion av tillväxtfasen av jästcellerna. Celler i log-tillväxtfasen kommer att ha högre utbyten av sfäroplaster än celler i stationär fas, eftersom de senare är mer resistenta mot enzymatisk behandling.
tält ">Se till att använda mjuka tekniker för att bryta upp cellerna. Tekniker som bryter ner jästcellväggen genom enzymatisk nedbrytning är att föredra framför metoder som spricker cellväggen genom tillämpad kraft. Den senare metoden kan störa den strukturella integriteten hos de små dropparna som resulterar i förlust av bundna proteiner eller lipider.
Undvik att frysa proverna efter cellerna har lyserade. Fryser droppar rekommenderas inte eftersom det kan påverka deras hållfasthet resulterar i förlust av bundet protein eller lipider. Frysning kan också orsaka dropparna att smälta eller fragment 24. Detta kan vara särskilt relevant eftersom dropparna har observerats att fragmentera eller genomgå fission i levande jästceller 25 och därmed uppdelning av större droppar i mindre är möjlig. Bitar av droppar som fragment kanske inte har flytkraft för att visas i floating skiktet under densitetsgradientcentrifugering. Detta kan artificiellt minska antalet dropp faktorer som skulle kunna ha blivit identifierade genom denna teknik eftersom proteinkompositionen av droppytor kan vara en funktion av droppstorleken 32.
Se till att testa lokalisering av lipid droplet associerade faktorer till lipid droppar. Ett av kännetecknen för lipiddropparna är att de interagerar med andra organeller 33-37. Därför är faktorer från dessa organeller ofta i fettdroppfraktionen. Därför är det viktigt att använda ytterligare tekniker för att säkerställa att dessa faktorer lokalisera till dropparna. Studier med en fluorescerande fusionsprotein kopplat till proteinet av intresse i celler där de lipiddropparna är färgade med en annan fluorescensmarkör bör användas för att bestämma omfattningen av colocalization 15. Tekniker såsom protein korrelation profiling kan användas för att ytterligare kvantifiera den renhet av lipiden dropp fraktion 15. I denna strategi är två komponenter var märkta med olika isotop-innehållande aminosyror. Den första komponenten är en känd lipid droplet faktor, och den andra komponenten är den fraktion som håller på att analyseras. Jämförelser görs sedan mellan de fraktionella placeringarna av de två komponenterna.
Ändringar och felsökning
Ändringar i protokoll nr 1 för att isolera lipiddropparna från spirande jästen Saccharomyces cerevisiae noteras. Observera att storleken på fettdroppar kan variera kraftigt. Densitetsgradientcentrifugering Hastigheterna kan behöva ökas för mindre droppar ackumuleras i det flytande skiktet.
Begränsningar av tekniken
Tillgång till en ultracentrifug med somwinging hink rotor är avgörande för isolering av cellulära fettdroppar. Även om denna utrustning är standard i de flesta cellbiologiska och biokemiska laboratorier, är det dyrt.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga metoder eller andra alternativa metoder
Som nämnts ovan, är protokoll 1 nära baserad på arbete av Leber et al. 6 och del 1 i protokoll nr 2 är en ändring av ett tidigare publicerat protokoll från Petroff et al. 26
Tillämpningar
Lipid dropp isolering är mest användbart för efterföljande proteomik och lipidomic analys av bundna proteiner, neutrala lipider och fosfolipider. Lager av lipid droplet associerade proteiner och lipider har sammanställts 4,6-17,19,20,22,23,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av American Heart Association utmärkelse 13SDG14500046 till PD, en hållbar energi Education & Research Center Award (Univ. of Tennessee) till PD, och av läkare "medicinsk utbildning och forskning Foundation (Univ. of Tennessee) utmärkelse till JM Författarna tackar Caroline Leplante (Yale Univ..) för protokollet för konvertering fissionsjäst till sfäroplaster, Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) för användning av hans skakande inkubatorer, bordscentrifug och Western Blot-analys utrustning, och Centrum för Environmental Biotechnology (Univ. Tennessee) för användningen av deras ultracentrifug, Günther Daum för jäst antikroppar (Graz Univ. of Technology, Österrike.), personalen vid avdelningen för obstetrik och gynekologi (Univ. Tennessee Medical Center) för att få hjälp .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
