Summary
שתי טכניקות לבידוד טיפות שומנים סלולריות מ1) תאי שמרים ו2) שליות אדם מוצגות. במרכזו של שני ההליכים הוא צנטריפוגה שיפוע הצפיפות, שבו השכבה הצפה וכתוצאה מכך המכילה טיפות ניתן דמיינו בקלות על ידי העין, שחולצה, ולכמת על ידי ניתוח כתם מערבי לטוהר.
Abstract
טיפות שומנים הן דינמיים אברונים שניתן למצוא ברוב התאים פרוקריוטים אוקריוטים ומסוימים. מבחינה מבנית, הטיפות מורכבות מליבה של שומנים ניטראליים מוקפים monolayer פוספוליפידים. אחת הטכניקות שימושיות ביותר בקביעת התפקידים הסלולריים של טיפות כבר זיהוי proteomic של חלבונים קשורים, שיכול להיות מבודד יחד עם הטיפות. הנה, שתי שיטות מתוארות לבודד טיפות שומנים וחלבונים הקשורים שלהם משני אאוקריוטים רחבים היקף: שמרי ביקוע ותאי villous שליה אנושיים. אף שיש שני השיטות הבדלים, השיטה העיקרית - צנטריפוגה שיפוע צפיפות - משותפת לשני הכנות. זה מראה את התחולה רחבה של טכניקות בידוד אגל שהוצגו.
בפרוטוקול הראשון, תאי שמרים מומרים לspheroplasts ידי עיכול אנזימטי של קירות התא שלהם. אז spheroplasts כתוצאה מכך הם גנטly lysed בhomogenizer רפוי. Ficoll מתווסף lysate לספק שיפוע צפיפות, ואת התערובת centrifuged שלוש פעמים. אחרי הראשון הספין, טיפות השומנים הם מקומיים לשכבת ציפה בצבע הלבנה של צינורות צנטריפוגה יחד עם reticulum endoplasmic (ER), קרום הפלזמה, ווקואולות. שני ספינים שלאחר מכן משמשים להסרת שלושת אברונים אחרים אלה. התוצאה היא שכבה שיש לו רק טיפות וחלבונים קשורים.
בפרוטוקול השני, תאי שליה villous מבודדים משליות טווח אדם על ידי עיכול אנזימטי עם טריפסין וDNase I. התאים הומוגני בhomogenizer רפוי. צעדים במהירות נמוכה ובינונית צנטריפוגה במהירות משמשים להסרת תאים רצופים, פסולת תאית, גרעינים, ומיטוכונדריה. סוכרוז מתווסף homogenate לספק שיפוע צפיפות והתערובת היא centrifuged להפריד את טיפות השומנים מcellula האחרותשברים r.
טוהר טיפות השומנים בשני הפרוטוקולים אושר על ידי ניתוח כתם מערבי. ברי הטיפה משני preps מתאימים לניתוח proteomic וlipidomic שלאחר מכן.
Introduction
טיפות שומנים סלולריים הן אברונים דינמיים המשרתים פונקציות רבות בתאים. הם רכזות אחסון שומנים ניטראליים, הניתן להמרה לאנרגיה או משמשים לסינתזת פוספוליפידים. הטיפות ממלאות תפקידים מרכזיים במצבים פיסיולוגיים ופתולוגיים כוללים טרשת עורקים, השמנת יתר ומחלות מטבוליות בנושא, וגם במחלות זיהומיות 1,2. בנוסף, הם מקורות מסקרן עבור דלק ביו דיזל.
מידע רב על התפקידים הסלולריים של טיפות שומנים כבר מתקבל מניתוח proteomic וlipidomic של טיפות מטוהרים מאורגניזמים רחבי היקף 3. אורגניזמים אלה כללו חיידקים 4,5, שמרי 6-11, שותלים 12,13, נמטודות 14, ועף 15,16. לאור ההתעניינות בתפקיד של טיפות שומנים במחלות מטבוליות אדם, טיפות יש גם מבודדות מהתאים של בעלי חיים מתורבתים ורקמות nimal. שורות תאים בתרבית כללו adipocytes 3T3-L1 17, תאי K2 השחלה אוגר סיני (CHO) 18, hepatocyes האנושי 19,20, ושורות תאי אפיתל 21. רקמות בעלי החיים שממנו הטיפות היו מבודדות כללו עכבר שרירי שלד 22, כבד 23, ובלוטות החלב 23. כאמור, המטרה של רוב מחקרי בידוד רביב היא לבצע ניתוח proteomic בגורמים קשורים וניתוח lipidomic על ניטראלי ופוספוליפידים.
מאז שומנים ניטראליים - המרכיב רב ביותר של טיפות שומנים - הם פחות צפופים מרוב החומרים תאיים אחרים, בידוד של טיפות באופן מסורתי מתבצע באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות. טכניקה זו היא במרכזו של שני preps שהוצג כאן. טכניקות קודמות 6,24 משולבות והותאמו למצגת חזותית של הבידוד של טיפות מתאי שמרי ביקוע תרבותייםותאים אנושיים noncultured מתקבלים מרקמת שליה. המטרה היא להראות את תחולתה הרחבה של טכניקה זו על ידי בחירה בשני סוגים שונים בהרבה תא כהחל נקודות עבור בידוד רביב. טכניקה זו צריכה להיות שימושית לכל מי שרוצה לבודד את טיפות מרוב האורגניזמים.
פרוטוקול 1 מתאר את הבידוד של טיפות שומנים משמרי הביקוע, pombe Schizosaccharomyces, אשר שימשו כמודל להתבוננות היווצרות טיפה במהלך חלוקת תא אוקריוטים 25. שמרי ניצני שמר אפייה כבר נעשה שימוש נרחב כאורגניזם מודל ללימוד ביולוגיה אגל שומנים בדם. פרוטוקול 1 הוא ישים שני אורגניזמים והבדלים בהכנות מודגשים.
פרוטוקול 2 מתאר את הבידוד של טיפות שומנים מתאי villous שליה, אשר בתורו המתקבל משליות טווח אנושי.אוסף של שליות טווח מספק הזדמנות ייחודית בצורה בטוחה ואתי כדי להשיג 200-250 גרם של רקמה זמינה אדם 26, המכילה מספר משמעותי של טיפות שומנים. זאת בניגוד למרבית עבודות בידוד טיפת שומנים באאוקריוטים גבוהים יותר שבו טיפות מקורן תאים בתרבית. במחקרים אלה, חומצות שומן מתווספות לעתים קרובות לתרבות כדי לקדם את הסינתזה של שומנים ניטראליים ובכך הצמיחה של טיפות. זאת בניגוד לעבודה כאן שבו טיפות שומנים נוצרות בתנאים מקומיים ברקמת שליה.
Purities של השברים טיפת שומנים בדם נקבעת על ידי ניתוח הכתם המערבי באמצעות נוגדני סמן אברון. שני פרוטוקולים אלה יניבו שברים אגל שומנים המתאימים לניתוח proteomic וlipidomic שלאחר מכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד טיפות שומנים מתאים (ביקוע) שמרים
בידוד של טיפות מאורגניזם המודל הפופולרי ניצני cerevisiae שמרי Saccharomyces הוא כמעט זהה לפרוטוקול הבא 6. הבדלים בהכנות הם ציינו.
1. תאי שמרים גדל
- הכן את אמצעי התקשורת. שלב 36 גרם של אבקת YE5S לליטר של DH 2 O בבקבוקי זכוכית או צלוחיות תרבות. כ -2 ליטר של תקשורת יהיה צורך. החיטוי התקשורת ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאפשר התקשורת להתקרר לטמפרטורת חדר. עבור ס cerevisiae להחליף YE5S עם YPD.
- הנח 10-20 מיליליטר של תקשורת YE5S מקוררת לתוך בקבוק תרבות 250 מיליליטר באמצעות טכניקות סטרילית. לחסן את התקשורת עם כמות קטנה של תאי שמרים מצלחת אגר באמצעות מקל עץ סטרילי או שווה ערך. בואו התאים לגדול לצפיפות האופטית הרצויה ב30 ° C. מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
- הנח את התקשורת שנותרה בצלוחיות L 2.8. שימוש לא יותר מ 1 ליטר של מדיה ל2.8 L בקבוק כדי להבטיח ערבוב נכון במהלך צמיחת תאים בחממה הרועדת. התשואה הסופית של תאים רטובים צריכה להיות על 10 גרם לתוכל לרכוש מספיק טיפות שומנים לניתוח proteomic וlipidomic.
- להציג את התאים מן השלב 1.2 ל2.8 צלוחיות L כל אחד מהם 1 ליטר של מדיה שהוכנו בשלב 1.1.
- לגדל את התאים לצפיפות הרצויה ב30 ° C.
- ודא שיש לי התאים טיפות שומנים. המילואים 1 מיליליטר של התאים. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) של המדגם. הוסף 0.1 מיליליטר של מניית מ"מ 100 של BODIPY 493/503 באתנול בקוטר חיצוני של תאים לדוגמא. מניחים 3 μl של המדגם בין שקופיות זכוכית ולהחליק את מכסה זכוכית. דמיינו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן ה-GFP (איור 1 א).
- גלולה תאי משלב 1.5 ב 4 & #176; C ב 3,800 XG 10 דקות. לעבוד בקבוצות בהתאם לקיבולת של צינורות צנטריפוגה.
- יוצקים את תקשורת YE5S ולשטוף את התאים עם חיץ של EMM + 600 מ"מ סורביטול. סורביטול מספק תמיכה האוסמוטי.
- להעביר את תאי צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר סטרילי וגלולת התאים ב 4 ° C XG ב 2000 10 דקות. הסר את supernatant. לשקול את התאים הרטובים. Resuspend התאים 2 מיליליטר של חיץ (EMM + 600 מ"מ סורביטול) לגרם של תאים.
2. המרת תאי שמרי ביקוע לspheroplasts ותמוגה הבאה
- הוסף 5 מ"ג כל אחד מ1) אנזים שמרי ממס ו2) שמרי lysing אנזימים מTrichoderma harzianum לגרם של תאים רטובים שנשקלו בשלב 1.9. עבור ס cerevisiae להגדיל את האנזימים האלה עם אותה הכמות של Zymolyase.
- דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס מתחת עדין רועד ל60 דקות 100 סל"ד.
- בדוק כדי לוודא שיש לי spheroplasts ד"ר שומנים בדםoplets. על ידי חזרה על שלב 1.6 (איור 1).
3. צנטריפוגה שיפוע צפיפות
- גלולה spheroplasts ידי צנטריפוגה ב 4 ° C XG ב 2000 למשך 5 דקות.
- מוציא בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה העברה פלסטיק.
- בעדינות resuspend spheroplasts הטבליות עם הקרח קר 10 מ"מ טריס-HCl, 600 מ"מ סורביטול, ו200 מיקרומטר EDTA. זכור כי spheroplasts הם מאוד שביר.
- גלולה spheroplasts שוב עם אותן ההגדרות כמו בשלב 3.1. מוציאים בזהירות את supernatant ו resuspend spheroplasts באמצעות פיפטה פלסטיק העברה ב12% Ficoll, 10 מ"מ טריס-HCl, ו200 מיקרומטר EDTA בריכוז של 2 מיליליטר / g-תאים.
- העבר spheroplasts resuspended לhomogenizer זכוכית ובעדינות homogenize על קרח, 20-30 שבץ, עם העלי הרפוי של homogenizer הזכוכית.
- העבר spheroplasts lysed לצינורות צנטריפוגות וכיסוי עם אותו volume של 12% Ficoll, 10 מ"מ טריס-HCl, ו200 חיץ EDTA מיקרומטר. בחר את מספר צנטריפוגות צינורות לשימוש, כך שכל צינור מלא כשני שלישים.
- צנטריפוגה ב 4 ° C ב100,000 XG במשך 1.5 שעות ברוטור SW28 או שווה ערך. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (האטת רוטור = 0).
- בעדינות להעביר את השכבה העליונה צף לבנה (איור 2 א), המכילה את הטיפות, לצינור חדש צנטריפוגות (ים) או באמצעות pipettor או פיפטה פסטר כפופה. הוסף מספיק נפח 12% Ficoll, 10 מ"מ טריס-HCl, ו200 חיץ EDTA מיקרומטר למדגם, כך שהוא ממלא כשליש מצינור צנטריפוגות.
- הוסף את ההיקף שווה הערך של 8% Ficoll, 10 מ"מ טריס-HCl, ו200 חיץ EDTA מיקרומטר לחלק העליון של הדוגמא (ו) בצינור החדש צנטריפוגות (ים). לאחר תוספת של זה חיץ הצינורות צריכים להיות כשני שליש מלא.
- צנטריפוגה ב 4 ° C ב100,000 XG במשך שעה 1 ברוטור SW28 או שווה ערך. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (r otor האטה = 0).
- בעדינות להעביר את השכבה העליונה צף לבנה (איור 2), שתכיל את הטיפות, לצינור חדש צנטריפוגות (ים) או באמצעות pipettor או פיפטה פסטר כפופה. הוספת 600 מ"מ סורביטול, 8% Ficoll, 10 מ"מ טריס-HCl, ו200 חיץ EDTA מיקרומטר למדגם, כך שהוא ממלא כשליש מצינור צנטריפוגות.
- הוסף את ההיקף שווה הערך של 250 מ"מ סורביטול, 10 מ"מ טריס-HCl, וחיץ EDTA 200 מיקרומטר לחלק העליון של הדוגמא (ו) בצינור החדש צנטריפוגות (ים). לאחר תוספת של זה חיץ הצינורות צריכים להיות כשני שליש מלא.
- צנטריפוגה ב 4 ° C ב100,000 XG במשך שעה 1 ברוטור SW28 או שווה ערך. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (האטת רוטור = 0).
- העבר את השכבה העליונה לבנה (איור 2 ג), שאמור להכיל רק טיפות שומנים וחלבונים קשורים, לצינורות דיאליזה, וdialyze O / N ל10 מ"מ טריס-HCl ו200 חיץ מיקרומטר EDTA לחסל Ficoll.
class = "jove_title"> 2. בידוד טיפות שומנים מתאי אדם השליה villous
שליות נאספו מנשות בריאות עם הריונות סינגלטון עוברים ניתוח קיסרי אלקטיבי משלוח לפני תחילת עבודה ספונטנית במועד. נושאים נתנו הסכמה בכתב, הודיעה לאיסוף השליה שלהם. האוסף, והשימוש הבא, של שליות בוצעו באישור מאוניברסיטת טנסי והאוניברסיטה של בית הספר לרפואה של בוגרת טנסי בנוקסוויל דירקטוריון סקירה מוסדית (8757B # ו # 3338, בהתאמה).
1. בידוד תאי villous שליה אדם
חלק 1 של הפרוטוקול הוא שינוי של פרוטוקול שפורסם קודם לכן על ידי Petroff et al. 26
הכן את הפתרונות הבאים:
- NaCl (1 ליטר): להמס 9 גרם NaCl (58.4 M g / mol) ב DH 2 O להניב פתרון 1 ליטר. סנן לעקר (0.2; מיקרומטר קרום).
- תמיסת מלח מאוזנת של 10x האנק (10x HBSS) (1 ליטר): 4 גרם KCl (74.5 M g / mol); 0.6 KH גרם 2 PO 4 (136.086 M g / mol); 80 גרם NaCl (58.44 M g / mol); Na 2 HPO 4 (141.96 M g / mol); 10 D-גרם גלוקוז (180.16 M g / mol). להמס כל אחד מהמרכיבים בDH 2 O להניב פתרון 1 ליטר. סנן לעקר (0.2 קרום מיקרומטר).
- חיץ אנזים עיכול (0.6 מיליליטר): לשלב 70 מיליליטר 10x HBSS עם 3.3 מיליליטר 7.5% Na Biscarbonate, 17.5 מיליליטר 1 M HEPES, ו266.1 מיליליטר DH 2 O; סנן לעקר (0.2 מיקרומטר קרום). חנות ב 4 ° C.
- DNase אני: רק לפני השימוש, מוסיף 5 מיליליטר 0.9% סטרילי NaCl לבקבוקון של DNase. שמור על קרח עד לשימוש או חנות ב -20 ° C.
- שליה מתכוננת לנתיחה
- השג שליה ותהליך קרוב לזמן לידה ככל האפשר אנושיות. השתמש בכלי אטום כגון קריר כדי להעביר את השליה. השתמש תמיד במשנה זהירות בעת ידחומרים ביולוגיים אנושיים לינג.
- ב למכסת מנוע הבטיחות הביולוגית, להעביר את השליה למכל autoclavable סטרילי, ולשטוף בזהירות דם משליה וקרומים באמצעות תמיסה סטרילית 0.9% NaCl (מלח). בטל מלוח דמים בכוס 1 ליטר כפסולת ביולוגית נוזלית.
- מניחים את השליה בשדה סטרילי, עם המשטח החלק הנושא את חבל הטבור כלפי מעלה. עם, מספריים עדין נקודה חדה ומלקחיים להסיר קרומים עובריים וחבל טבור.
- להעיף את השליה על כך את פני השטח האימהיים (משטח מחוספס) פונה כלפי מעלה. להסיר את רקמת צלחת הבסיסית שמעליה, כ -3 מ"מ מעל פני השטח.
- לנתח את השליה
- לנתח טבורית אחד בכל פעם הימנעות צלחת כוריוני. איסוף רקמות villous לתוך מבחנה 250 מיליליטר עם מי מלח.
- יש לשטוף מספר פעמים רקמות בכוס נפרדת עם 0.9% NaCl על ידי מתערבל עם מלקחיים, תוך שימוש בכוס 1 ליטר לפסולת נוזלית.
- העבר את טבורית אחד בכל פעם לצלחת פטרי 150 מ"מ. מחזיק עם מלקחיים ולגרד רקמות עם סכין גילוח מכלי על צלחת פטרי. הנח רקמה מגורדת לתוך כוס נפרדת המכילה 0.9% NaCl. חזור על פעולה עבור כל פיסות הרקמה.
- העבר את החלק קטן של הרקמה למסננת תא דיסוציאציה ולשטוף עם 0.9% NaCl בהרחבה עד eluate הופך להיות ברור. חזור על פעולה עבור כל הרקמה.
- לאחר שטיפת הרקמה מגורדת במסננת התא דיסוציאציה, מסנן אותו מנוזלים ומשקל עודפים.
בשלב זה הרקמות עשויות להיות מאוחסנים O / N בבקבוק Erlenmeyer סטרילי על 4 מעלות צלזיוס בDMEM.
- עיכול אנזימתי של רקמת השליה
- מכין את תערובת עיכול רקמה: של חיץ דילול אנזים prewarmed 100 מיליליטר, 1 מיליליטר DNase אני ו20 מיליליטר 2.5% טריפסין 10x.
- מחלקים את הרקמה, העברת 60 גרם מרקמות שנאספו בסך הכל (בדרך כלל על 250-300 גר ') לבקבוק Erlenmeyer סטרילי 500 מיליליטר.
- איסוף התאים ניתקו
- לאחר ניתוק דקות הראשון 45, הגדר את בקבוק העיכול בהטיה עד רקמה תשקע.
- לאסוף את supernatant, נזהר שלא לאסוף רקמת undissociated. מוסיף כמות שווה של HBSS לsupernatant נאסף ולהעביר לתוך צינורות 15 צנטריפוגות מיליליטר סטרילי. לחלקים נוספים של רקמת undissociated, לחזור על הליך החל מהשלב 3.2 עם רקמת undissociated.
- צנטריפוגה homogenate ב 4 ° C XG ב 1000 ל15 דקות.
- עבור כל אצווה, בעקבות צנטריפוגה, לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה. תאי villous השליה הם בעיקר בחלק הלבן של גלולה, שמעל תאי דם האדומים.
- להעביר את תאי villous (חלק לבן של גלולה) לרחerile 50 מיליליטר צינור צנטריפוגות חרוטי ולשמור על קרח.
- לאחר איסוף התאים מכל שלושת שלבי העיכול, לסנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר מוכנסת בחלקו העליון של צינור צנטריפוגות סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. אם הסינון של ההשעיה התא מאט, הרם כלפי מעלה על המסנן לצייר ואקום בתוך הצינור.
- צנטריפוגה ב 4 ° C XG ב 1000 10 דקות. מוציא בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה.
2. מאחד תאי villous שליה
- לפני שמתחיל בתהליך הבידוד, להכין 50 מיליליטר של hypotonic תמוגה בינוני (HLM) המכיל 20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4 ו1 mM EDTA. הוספת מעכבי פרוטאז לHLM רק לפני השימוש ולשמור את המדיום על קרח.
- ב למכסת מנוע הבטיחות הביולוגית, להוסיף 4 פעמים את התא גלולה נפח HLM קר כקרח לתאים. בעדינות וביסודיות resuspend התאים על ידי pipetting התאים למעלהד למטה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר.
- דגירה התאים התלויים על קרח דק 10.
- להעביר את תאי homogenizer Dounce, שאמורה להיות על קרח. לאט homogenize התאים על ידי יישום 20-25 משיכות עדינות עם העלי הרפוי של homogenizer.
- צנטריפוגה lysate התא על 4 מעלות צלזיוס ב3,000 XG במשך 10 דקות כדי להסיר תאים רצופים, פסולת וגרעינים סלולריות.
- לאסוף את supernatant ולהעביר לצינור SW28 (או חלופה שניתן centrifuged ב25,000 XG). צנטריפוגה ב 4 ° C ב25,000 XG עבור 20 דקות כדי להסיר את המיטוכונדריה.
3. בידוד טיפות שומנים על ידי ultracentrifugation
- הכן 50 מיליליטר של 100 סודיום קרבונט מ"מ (M 106 g / mol) חיץ (pH 11.5) וסוכרוז 50 מיליליטר של 60% פתרון (w / w). הוסף מעכבי פרוטאז למאגר סודיום קרבונט רק לפני השימוש ולשמור על קרח.
- לאסוף את supernatant משלב 2.6 לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר, להתאים20% של סוכרוז והעברה לתוך החלק התחתון של צינור ultracentrifuge לרוטור SW28, או שווה ערך. supernatant צפיפות כיסוי מותאם עם ~ 10 מיליליטר של חיץ קר כקרח פחמה 100 נתרן מ"מ (pH 11.5) ו0.5-1 מיליליטר של HLM קר כקרח כדי למלא את הצינור.
- צנטריפוגה ב C ° 4 ב130,000 XG דקות 45 באמצעות הרוטור דלי מתנדנד SW28. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (האטת רוטור = 0).
- לאסוף את השכבה הצפה, להסתגל לסוכרוז 10% ולהעביר לתוך החלק התחתון של צינור ultracentrifuge 13.2 מיליליטר לרוטור SW41Ti, או שווה ערך. צפיפות כיסוי יותאם supernatant עם כ -5 מיליליטר של חיץ קר כקרח סודיום קרבונט 100 מ"מ (pH 11.5) ו0.5 מיליליטר של HLM קר כקרח.
- צנטריפוגה ב C ° 4 ב274,000 XG במשך 60 דקות באמצעות הרוטור דלי מתנדנד SW41Ti. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (האטת רוטור = 0) כדי למזער את ההפרעה של שכבת טיפת שומנים בדם.
- לאסוף את השכבה הצפה העליונה (איור 2 ד) המכילה בזהירותטיפות שומנים עם טפטפת מיליליטר 1 וחזור על שלב 3.4.
- צנטריפוגה ב C ° 4 ב274,000 XG במשך 30 דקות באמצעות הרוטור דלי מתנדנד SW41Ti. לאפשר הרוטור לחוף לעצירה (האטת רוטור = 0).
- לאסוף בזהירות את שכבת הציפה בצבע לבנה העליונה המכילה טיפות שומנים עם פיפטה פסטר כפופה לשלושה 1.5 מיליליטר צינורות המכילים 100 HLM μl.
שבריר טיפות שומנים אפיון (פרוטוקולי 1 ו -2)
ההתאוששות והטוהר של שבריר טיפת שומנים בדם יכולים להיות מאומתת על ידי הכתם המערבי בשילוב עם אור או במיקרוסקופ אלקטרונים. בנוסף, ניתן לאסוף aliquots לאחר צעדי צנטריפוגה שונים ונשמרים לקביעת יעילות טיהור. במערבי סופג, זה מתאים יותר להשוואת היקף של שבריר אגל שומנים המייצג שווה ערך של כל התא lysate מאשר השוואת טיפות שומנים לשברים קרום אחרים על tהוא הבסיס של תכולת חלבון כוללת 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אם צנטריפוגה שיפוע הצפיפות עבדה כצפוי, את השכבה הצפה צריכה להכיל טיפות שומנים ולהיות מדולדלת של אברונים אחרים בהתקדמות של הספינים במהירות גבוהה.
לפרוטוקול 1, כתמים מערביים בוצעו עם נוגדני סמן לטיפי שומנים (Erg6p), ואברונים שכבר נמצאו באינטראקציה עם טיפות שומנים בשמרים, ER (Dpm1p), מיטוכונדריה (Por1p), קרום פלזמה (Pma1p), ווקואולות (Vma1p).
כמויות שווה של השכבה הצפה של כל שלושה ספינים (שלבים 3.7, 3.10, ו3.13) נאספו, זירזה עם חומצת trichloroacetic (15% ריכוז סופי), וsolubilized במים. 13 מיליליטר של lysate התא (איור 3 א, "ליס") והכנת חלבון של כל שלושה ספינים (איור 3 א, "Spin1", "Spin2", ו "Spin3") הופרדו ביום 12% SDS-PAGE, הועברו לניטרוצלולוזה קרום, וimmunoblotted עם speci אברוןנוגדני FIC. כצפוי, חלבון סמן אגל השומנים Erg6p נמצא בשכבה צף לאחר כל אחת משלושת הספינים (איור 3 א); Por1p אינו קיים בשכבה צף לאחר Spin1 (איור 3 א); Vma1p התרוקן מהשכבה צף לאחר Spin2 (איור 3 א); וDpm1p וPma1p אינם נוכחים בשכבה צף לאחר (איור 3 א) Spin3.
לפרוטוקול 2, הנוכחות של טיפות שומנים מבודדות תאי villous שליה טווח אנושי אומתה על ידי צביעה עם צבע ניטראלי שומנים ספציפי הקרינה, BODIPY 493/503. הטיפות אז היו דמיינו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3 ב). טוהר השברים אגל שומנים המבודדים הוערך על ידי מערבי סופג עם חלבוני סמן לטיפי שומנים (perilipin 2), ER (calnexin), Golgi (GM130), מיטוכונדריה (COX-IV) וקרום פלזמה (MEK1) (איור 3 ג). ד"ר השומנים בדםoplets היו דה lipidated עם אצטון הקר והחלבונים חולצו. האחוזים שווים של supernatant לאחר גרעיני (PNS), חלק קטן מתחת לשכבה הצפה של הספין האחרון (שלב 3.6, "Spin4" באיור 3 ג), לשטוף את השלב הבא (שלב 3.8, "Spin5" באיור 3 ג), ו הכנת חלבון lipidated-de של שכבה הצפה טיפת שומנים בדם (שלב 3.8, "LD" באיור 3 ג) הופרדו ביום 12% SDS-PAGE, הועברה וimmunoblotted עם נוגדנים שצוינו. Perilipin 2 (הידוע גם בADRP), חלבון טיפת שומנים בדם, התגלה בsupernatant לאחר גרעיני ובשכבה הלבנה המבודדת הצפה המכילה טיפות שומנים. חלבונים ספציפיים לקרום פלזמה (MEK1) וGolgi (GM130) לא התגלו שברי טיפת שומנים בדם בכל שכבה מתחת לשכבה צף לSpin4 וSpin5. כפי שדווחו בעבר, calnexin חלבון ER 18,27,28 ומכתימים חלש של חלבון קרום המיטוכונדריה COX IV היה detected במקומות אחר בשבריר אגל שומנים 22. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם דיווחים קודמים שהראו כי טיפות שומנים אינטראקציה עם המיטוכונדריה בתאי יונקים 29 ועם ER 30,31.
איור 1. שדה מואר טיפות נייד שומנים בתאי שמרי ביקוע. () שדה מואר (BF) וקרינה בתחום רחבה תמונות (Fluor.) של שישה תאי שמרי ביקוע נציג שבו טיפות השומנים הם צבועים עם BODIPY 493/503. (ב) (BF ) וקרינה בתחום רחבה (תמונות Fluor.) של spheroplast נציג שבו טיפות השומנים הם צבועים עם BODIPY 493/503. ברים סולם הם 1 מ"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בo גרסה גדולה יותרו נתון זה.
איור 2. צף שכבה לאחר צנטריפוגה שיפוע הצפיפות. צנטריפוגה צינורות אחרי () Spin1 (שלב 3.8), (ב) Spin2 (שלב 3.11), ו (ג) Spin3 (שלב 3.14) של 1 פרוטוקול. (ד ') צנטריפוגה צינורות לאחר Spin4 (שלב 3.6) לפרוטוקול 2. השכבות צפות המכילות טיפות השומנים מסומנות על ידי חצים.
איור 3. ניתוח של טוהר טיפות שומנים המבודדים. () מערביים כתמים של שלבים עיקריים בפרוטוקול 1. כמויות שווה של כל הכנת חלבון (Spin1 - צעד 3.7, Spin2 - צעד 3.10, וSPI N3 - צעד 3.13) הופרד על ידי SDS-Page, הועבר לקרומי ניטרוצלולוזה, וimmunoblotted עם נוגדנים לErg6p (LD, טיפות שומנים), Dpm1p (ER), Por1p (MT, מיטוכונדריה), Pma1p (PM, קרום פלזמה), וVma1p (vacuoles). (ב ') בניגוד שלב (PC) וקרינה בתחום רחבה תמונות (Fluor.) של 493/503-stained טיפות שומנים BODIPY שהיו מבודדים מתאי villous שליה אנושיים. (C) כתמים מערביים של שלבים עיקריים בפרוטוקול 2. PNS אחוז שווה PF (supernatant פוסט הגרעיני), supernatant מתחת לשכבה צף אחרי הספין האחרון (Spin4 - צעד 3.6), לשטוף לאחר מכן (Spin5 - צעד 3.8), ושכבה הצפה (LD) הופרדו על ידי SDS-Page, הועבר ל קרומים וimmunoblotted עם נוגדנים לperilipin 2 (LD, טיפות שומנים), calnexin (ER), GM130 (חלבון מטריקס Golgi, Golgi), COX IV (מונואמין ציטוכרום C; MT, מיטוכונדריה), וMEK1 (קינאז MAPK; PM, פלזמה קרום).ad/50981/50981fig3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול זה
הפוך להיות עקבי עם תקשורת וצפיפות תאים במהלך הצמיחה של תאים בתרבית בטוח. טיפות שומנים נייד הן ייחודיות בכך שהחלבונים הקשורים שלהם תלויים במידה רבה על הסביבה שבה התאים 17 בתרבית. לכן, אמצעי התקשורת שבו התאים גדלים והצפיפות של התאים צריכים להיות תחת פיקוח הדוק לפני תמוגה.
הרכב החלבון של טיפות שומנים הוא פונקציה של שלב הצמיחה של תאי השמרים. חלבונים פחות יהיו מחויבים לטיפין בשלב צמיחת יומן לעומת שלב נייח. כמו כן, spheroplasting יעילות היא פונקציה של שלב הצמיחה של תאי השמרים. תאים בשלב צמיחת יומן יהיו תשואות גבוהות יותר של spheroplasts מאשר תאים בשלב נייח משום שהאחרון הוא עמיד יותר לטיפול אנזימטי.
אוהל ">הקפד להשתמש בטכניקות עדינות לפרוץ את התאים. טכניקות שלשבור את קיר תא שמרים על ידי עיכול אנזימטי עדיפים על טכניקות שקרע דופן התא באמצעות כוח ליישם. השיטה השנייה עלולה לשבש את השלמות המבנית של הטיפות והתוצאה הוא אובדן של חלבונים או שומני כבולות.
הימנעו מהקפאת דגימות לאחר התאים כבר lysed. טיפות הקפאה אינה מומלצת משום שהוא יכול להשפיע על השלמות המבנית שלהם וכתוצאה מכך האובדן של חלבון או שומנים מאוגדים. הקפאה יכולה גם לגרום לטיפי הפתיל או בר 24. זה עשוי להיות רלוונטי במיוחד מאז טיפות נצפו לפצל או לעבור ביקוע בתאים שמרים חי 25 ולכן התמוטטות של טיפות גדולות למולקולות קטנות יותר אפשרית. חתיכות של טיפות שבר לא יכול להיות הציפה שתופיע בfשכבת loating במהלך צנטריפוגה שיפוע צפיפות. זה באופן מלאכותי יכול להפחית את מספר גורמי אגל שיהיה מזוהה על ידי טכניקה זו מאז הרכב החלבון של משטחי אגל עשוי להיות פונקציה של גודל הטיפה 32.
הקפד לבדוק את הלוקליזציה של גורמים הקשורים אגל שומנים לטיפי שומנים. אחד המאפיינים של טיפות שומנים הוא שהם מתקשרים עם אברונים אחרים 33-37. לכן, גורמים מאברונים אלה נמצאים לעתים קרובות בשבריר טיפת שומנים בדם. לכן, חשוב להשתמש בטכניקות נוספות כדי להבטיח שהגורמים הללו בתרגום לטיפין. צריכים טכניקות כגון מתאם חלבון יחסי הציבור לשמש מחקרים עם חלבון היתוך ניאון הצמוד לחלבון של עניין בתאים שבם טיפות השומנים מגואלות סמן פלואורסצנטי שונה כדי לקבוע את מידת colocalization 15.ofiling יכול לשמש כדי לכמת את טוהר שבריר אגל שומנים 15 נוסף. באסטרטגיה זו, שני רכיבים כל שכותרתו עם חומצות אמינו המכיל איזוטופ שונים. המרכיב הראשון הוא גורם אגל שומנים ידוע, והמרכיב השני הוא חלק קטן שהוא להיות מנותח. לאחר מכן נעשות השוואות בין מקומות השבר של שני רכיבים.
שינויים ופתרון בעיות
שינויים 1 פרוטוקול לבידוד טיפות שומנים מcerevisiae השמרים Saccharomyces ניצנים הם ציינו. שים לב שהגדלים של טיפות שומנים יכולים להשתנות במידה רבה. מהירויות צנטריפוגה שיפוע צפיפות ייתכן שתהיינה צורך מוגבר לטיפין קטנות יותר כדי לצבור בשכבה הצפה.
מגבלות של הטכניקה
גישה לצנטריפוגות במיוחד עם כאלתרתי הרוטור דלי הוא חיוני לבידוד של טיפות שומנים סלולריות. למרות שפריט ציוד זה הוא סטנדרטי ברוב מעבדות ביולוגיה של התא וביוכימיה, זה יקר.
משמעות של הטכניקה ביחס לשיטות קיימות או שיטות אלטרנטיביות אחרות
כאמור, פרוטוקול 1 מבוסס באופן הדוק על עבודתה של לבר et al. 6 וחלק 1 של פרוטוקול 2 הוא שינוי של פרוטוקול שפורסם קודם לכן על ידי Petroff et al. 26
יישומים
בידוד אגל שומנים הוא שימושי ביותר עבור ניתוח proteomic וlipidomic הבא של חלבונים קשורים, שומנים ניטראליים ופוספוליפידים. מלאי חלבוני טיפת שומנים בדם קשורים ושומנים עברו הידור 4,6-17,19,20,22,23,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הפרס איגוד לב האמריקאי 13SDG14500046 לפ"ד, חינוך בר קיימא באנרגיה ומחקר מרכז פרס (אוניברסיטת טנסי) לפ"ד, ועל ידי החינוך הרפואי 'הרופאים וקרן מחקר (אוניברסיטת טנסי) הפרס לג' מחברים מודים קרוליין Leplante (ייל Univ.) לפרוטוקול להמרת שמרי ביקוע לspheroplasts; אריק ט Boder (אוניברסיטת טנסי) לשימוש בחממות שלו רועדות, צנטריפוגה שולחן, וציוד ניתוח כתם המערבי, והמרכז עבור הסביבה ביוטכנולוגיה (אוניברסיטת טנסי) לשימוש באולטרה צנטריפוגה; גינטר דאום לשמרי נוגדנים (גראץ אונ טכנולוגי, אוסטריה.); כוח האדם של המחלקה למיילדות וגניקולוגיה (המרכז רפואי טנסי Univ.) לקבלת סיוע טכני .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
