Summary
) 1 से सेलुलर लिपिड बूंदों अलग खमीर कोशिकाओं और 2) मानव placentas प्रस्तुत कर रहे हैं के लिए दो तकनीकों. दोनों प्रक्रियाओं के केंद्र बूंदों से युक्त जिसके परिणामस्वरूप चल परत आसानी से, आँख द्वारा कल्पना निकाला, और पवित्रता के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जहां घनत्व ढाल centrifugation है.
Abstract
लिपिड बूंदों सबसे यूकेरियोटिक और कुछ prokaryotic कोशिकाओं में पाया जा सकता है कि गतिशील organelles हैं. Structurally, बूंदों एक फॉस्फोलिपिड monolayer से घिरे तटस्थ लिपिड का एक कोर से मिलकर बनता है. बूंदों के सेलुलर भूमिकाओं का निर्धारण करने में सबसे उपयोगी तकनीकों में से एक बूंदों के साथ अलग किया जा सकता है, जो बाध्य प्रोटीन की प्रोटिओमिक पहचान की गई है. विखंडन खमीर और मानव अपरा विलस कोशिकाओं: यहाँ, दो तरीकों दो व्यापक यूकैर्योसाइटों से लिपिड बूंदों और उनके बाध्य प्रोटीन को अलग करने वर्णित हैं. दोनों तकनीकों मतभेद हैं हालांकि, मुख्य विधि - घनत्व ढाल centrifugation - दोनों की तैयारी द्वारा साझा किया जाता है. इस प्रस्तुत छोटी बूंद अलगाव तकनीक का व्यापक प्रयोज्यता पता चलता है.
पहली प्रोटोकॉल में, खमीर कोशिकाओं अपने सेल दीवारों के enzymatic पाचन द्वारा स्फेरोप्लास्ट में परिवर्तित कर रहे हैं. परिणामस्वरूप स्फेरोप्लास्ट तो सज्जन कर रहे हैंly एक ढीले ढाले homogenizer में lysed. Ficoll एक घनत्व ढाल प्रदान करने के लिए lysate में जोड़ा जाता है, और मिश्रण तीन बार centrifuged है. पहली स्पिन के बाद, लिपिड बूंदों जालिका (ईआर), प्लाज्मा झिल्ली, और vacuoles के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूबों का सफेद रंग का अस्थायी परत के लिए स्थानीय कर रहे हैं. दो बाद spins इन तीन अन्य अंगों को निकालने के लिए उपयोग किया जाता है. परिणाम केवल बूंदों और बाध्य प्रोटीन है कि एक परत है.
दूसरा प्रोटोकॉल में, अपरा विलस कोशिकाओं trypsin और DNase मैं कोशिकाओं को एक ढीले ढाले homogenizer में homogenized हैं साथ enzymatic पाचन द्वारा मानव अवधि placentas से अलग कर रहे हैं. कम गति और मध्यम गति centrifugation कदम अटूट कोशिकाओं, सेलुलर मलबे, नाभिक, और mitochondria दूर करने के लिए उपयोग किया जाता है. सुक्रोज एक घनत्व ढाल प्रदान करने के लिए homogenate में जोड़ा जाता है और मिश्रण अन्य सूक्ष्मकोशिका से लिपिड बूंदों अलग करने के लिए centrifuged हैआर भिन्न.
दोनों प्रोटोकॉल में लिपिड बूंदों की पवित्रता पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करके इसकी पुष्टि की है. दोनों preps से छोटी बूंद भिन्न बाद प्रोटिओमिक और lipidomic विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं.
Introduction
सेलुलर लिपिड बूंदों कोशिकाओं में कई कार्यों की सेवा है कि गतिशील organelles हैं. वे ऊर्जा में परिवर्तित या फॉस्फोलिपिड संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो तटस्थ लिपिड, के लिए भंडारण केन्द्र हैं. बूंदों atherosclerosis, मोटापा और संबंधित चयापचय रोगों सहित शारीरिक और रोग की स्थिति में केंद्रीय भूमिका निभाने, और भी संक्रामक रोगों 1,2. इसके अलावा, वे biodiesel ईंधन के लिए साज़िश का स्रोत हैं.
लिपिड बूंदों के सेलुलर भूमिकाओं पर ज्यादा जानकारी व्यापक जीवों 3 से शुद्ध बूंदों की प्रोटिओमिक और lipidomic विश्लेषण से प्राप्त किया गया है. इन जीवों, बैक्टीरिया 4,5, खमीर 6-11 शामिल 12,13 संयंत्र, 14 नेमाटोड, और 15,16 मक्खियों है. मानव चयापचय रोगों में लिपिड बूंदों की भूमिका में रुचि को देखते हुए, बूंदों भी सभ्य पशु कोशिकाओं और एक से पृथक किया गया हैनिमल ऊतकों. सभ्य सेल लाइनों 3T3-एल 1 adipocytes 17, चीनी हम्सटर अंडाशय (चो) K2 कोशिकाओं 18, मानव hepatocyes 19,20, और उपकला कोशिका लाइनों 21 को शामिल किया है. बूंदों पृथक किया गया है जिसमें से जानवरों के ऊतकों माउस कंकाल की मांसपेशी 22, जिगर 23, और स्तन ग्रंथियों 23 को शामिल किया है. जैसा कि ऊपर कहा, सबसे छोटी बूंद अलगाव पढ़ाई के लक्ष्य के लिए बाध्य कारकों और तटस्थ और phospholipids पर lipidomic विश्लेषण पर प्रोटिओमिक विश्लेषण करने के लिए है.
तटस्थ लिपिड के बाद से - लिपिड बूंदों की सबसे अनेक घटक - सबसे अन्य सेलुलर सामग्री की तुलना में कम घने हैं, बूंदों के अलगाव पारंपरिक रूप से घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है. यही तकनीक यहाँ प्रस्तुत दोनों preps के केंद्र में है. पिछले तकनीकों 6,24 सुसंस्कृत विखंडन खमीर कोशिकाओं से बूंदों के अलगाव का एक दृश्य प्रस्तुति में संयुक्त और संशोधित कर रहे हैंऔर noncultured मानव कोशिकाओं अपरा ऊतक से प्राप्त की. लक्ष्य छोटी बूंद अलगाव के लिए अंक शुरू करने के रूप में दो बेहद अलग प्रकार की कोशिकाओं को चुनकर इस तकनीक का व्यापक प्रयोज्यता दिखाने के लिए है. इस तकनीक को सबसे जीवों से बूंदों को अलग करने के इच्छुक लोगों के लिए उपयोगी होना चाहिए.
प्रोटोकॉल 1 यूकेरियोटिक कोशिका विभाजन 25 के दौरान छोटी बूंद गठन के अवलोकन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है जो विखंडन खमीर, Schizosaccharomyces pombe, से लिपिड बूंदों के अलगाव का वर्णन करता है. नवोदित खमीर लिपिड छोटी बूंद जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में जीव बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. प्रोटोकॉल 1 जीवों और तैयारी में मतभेद दोनों पर लागू होता है डाला जाता है.
प्रोटोकॉल 2 मानव अवधि placentas से प्राप्त बारी में हैं जो अपरा विलस कोशिकाओं से लिपिड बूंदों के अलगाव का वर्णन करता है.अवधि placentas का संग्रह सुरक्षित और नैतिकता की दृष्टि से लिपिड बूंदों की बड़ी संख्या शामिल है, जो आसानी से उपलब्ध मानव ऊतक 26 की 200-250 ग्राम प्राप्त करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है. इस बूंदों संवर्धित कोशिकाओं से उत्पन्न जहां उच्च eukaryotes में सबसे लिपिड छोटी बूंद अलगाव काम के विपरीत है. उन अध्ययनों में, फैटी एसिड अक्सर तटस्थ लिपिड और इस तरह बूंदों के विकास के संश्लेषण को बढ़ावा देने के लिए संस्कृति को जोड़ रहे हैं. इस लिपिड बूंदों अपरा ऊतक में देशी परिस्थितियों में गठन कर रहे हैं जहां यहां काम के विपरीत है.
लिपिड छोटी बूंद अंशों की purities organelle मार्कर एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. इन दो प्रोटोकॉल बाद प्रोटिओमिक और lipidomic विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं कि लिपिड छोटी बूंद भिन्न निकलेगा.
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Protocol
1. (विखंडन) खमीर कोशिकाओं से लिपिड बूंदों अलग
खमीर नवोदित लोकप्रिय मॉडल जीव से बूंदों के अलगाव को निम्नलिखित प्रोटोकॉल 6 के लगभग समान है. तैयारी में मतभेद नोट कर रहे हैं.
1. बढ़ते खमीर कोशिकाओं
- मीडिया तैयार करें. कांच की बोतल या संस्कृति बोतल में DH 2 हे की प्रति लीटर YE5S पाउडर के 36 ग्राम का मिश्रण. मीडिया के बारे में 2 एल की जरूरत होगी. 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया आटोक्लेव. मीडिया कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें. एस के लिए cerevisiae YPD साथ YE5S जगह.
- बाँझ तकनीक का उपयोग कर एक 250 मिलीलीटर संस्कृति फ्लास्क में ठंडा YE5S मीडिया के 10-20 मिलीलीटर रखें. एक बाँझ लकड़ी की छड़ी या समकक्ष का उपयोग कर एक अगर प्लेट से खमीर कोशिकाओं की एक छोटी राशि के साथ मीडिया टीका लगाना. कोशिकाओं 30 डिग्री सेल्सियस पर वांछित ऑप्टिकल घनत्व को बढ़ने दो. एक में ऑप्टिकल घनत्व को मापनेएक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 595 एनएम के तरंग दैर्ध्य.
- 2.8 एल बोतल में शेष मीडिया रखें. मिलाते इनक्यूबेटर में सेल के विकास के दौरान उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए मीडिया 2.8 एल प्रति कुप्पी की नहीं 1 से अधिक एल का प्रयोग करें. गीला कोशिकाओं के अंतिम उपज प्रोटिओमिक और lipidomic विश्लेषण के लिए पर्याप्त लिपिड बूंदों प्राप्त करने के लिए सक्षम होने के बारे में 10 ग्राम होना चाहिए.
- प्रत्येक 1.1 चरण में तैयार किया गया है कि मीडिया के 1 एल होने 2.8 एल बोतल में कदम 1.2 से कोशिकाओं का परिचय.
- 30 डिग्री सेल्सियस पर वांछित घनत्व के लिए कोशिकाओं को विकसित
- कोशिकाओं लिपिड बूंदों है कि सुनिश्चित करें. कोशिकाओं रिजर्व 1 मिलीलीटर. नमूना के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने. नमूने के लिए कोशिकाओं के आयुध डिपो प्रति इथेनॉल में BODIPY 493/503 की एक 100 मिमी शेयर के 0.1 मिलीलीटर जोड़ें. एक गिलास स्लाइड और एक गिलास को कवर पर्ची के बीच नमूना के 3 μl रखें. एक GFP फिल्टर (चित्रा 1 ए) के साथ एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कल्पना.
- 4 & # में 1.5 कदम से गोली कोशिकाओं176, सी 10 मिनट के लिए 3800 XG पर. अपकेंद्रित्र ट्यूबों की क्षमता पर निर्भर करता है बैचों में काम करते हैं.
- YE5S मीडिया डालो और sorbitol ईएमएम + 600 मिमी की एक बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें. Sorbitol आसमाटिक सहायता प्रदान करता है.
- एक बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए 2,000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला निकालें. गीला कोशिकाओं वजन. कोशिकाओं के प्रति ग्राम (ईएमएम + 600 मिमी sorbitol) बफर के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend.
2. स्फेरोप्लास्ट और बाद में सेल में विखंडन खमीर कोशिकाओं परिवर्तित
- ) खमीर अपघट्य एंजाइम 5 मिलीग्राम 1 में से प्रत्येक में जोड़ें और 2) खमीर ट्राइकोडर्मा harzianum प्रति ग्राम कदम 1.9 में तौल रहे थे कि गीला कोशिकाओं की से एंजाइमों lysing. एस के लिए cerevisiae Zymolyase का एक ही राशि के साथ इन एंजाइमों बढ़ाने.
- 60 मिनट के लिए 100 rpm पर मिलाते हुए सज्जन के तहत 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं.
- स्फेरोप्लास्ट लिपिड डॉ. है कि सुनिश्चित करने के लिए जाँच करेंoplets. कदम 1.6 (चित्रा 1 बी) को दोहराने से.
3. घनत्व ढाल centrifugation
- 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा स्फेरोप्लास्ट गोली.
- ध्यान से एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- धीरे बर्फ के ठंडे 10 मिमी Tris-एचसीएल, sorbitol 600 मिमी, और 200 माइक्रोन EDTA के साथ pelleted स्फेरोप्लास्ट resuspend. स्फेरोप्लास्ट बहुत नाजुक हैं कि मन में रखो.
- 3.1 कदम के रूप में ही सेटिंग्स का उपयोग कर फिर से स्फेरोप्लास्ट गोली. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और 2 मिलीलीटर / जी कोशिकाओं के एक एकाग्रता में एक 12% Ficoll में प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट, 10 मिमी Tris-एचसीएल, और 200 माइक्रोन EDTA का उपयोग स्फेरोप्लास्ट resuspend.
- एक गिलास homogenizer को resuspended स्फेरोप्लास्ट स्थानांतरण और धीरे गिलास homogenizer के ढीले ढाले मूसल के साथ, बर्फ पर 20-30 स्ट्रोक homogenize.
- अपकेंद्रित्र ट्यूबों को lysed स्फेरोप्लास्ट स्थानांतरण और एक ही Vo के साथ ओवरले12% Ficoll, 10 मिमी Tris-एचसीएल, और 200 माइक्रोन EDTA बफर के lume. इसलिए प्रत्येक ट्यूब के बारे में दो तिहाई भरा है कि उपयोग करने के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूबों की संख्या चुनें.
- एक SW28 रोटर या समकक्ष में 1.5 घंटे के लिए 100,000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. एक बंद करो (रोटर मंदी = 0) के लिए तट के रोटर की अनुमति दें.
- धीरे एक pipettor या एक तुला पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब (ओं) को बूंदों होता है जो शीर्ष अस्थायी सफेद परत (2A चित्रा), स्थानांतरण. यह अपकेंद्रित्र ट्यूब के लगभग एक तिहाई भरता है तो नमूना करने के लिए पर्याप्त 12% Ficoll की मात्रा 10 मिमी Tris-एचसीएल, और 200 माइक्रोन EDTA बफर जोड़ें.
- नई अपकेंद्रित्र ट्यूब (ओं) में नमूना (एस) के शीर्ष के बराबर 8% Ficoll की मात्रा 10 मिमी Tris-एचसीएल, और 200 माइक्रोन EDTA बफर जोड़ें. इस के अलावा के बाद ट्यूबों पूर्ण के बारे में दो तिहाई होना चाहिए बफर.
- एक SW28 रोटर या समकक्ष में 1 घंटे के लिए 100,000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. एक रोकने के लिए तट के रोटर की अनुमति दें (नि.OTOR मंदी = 0).
- धीरे एक pipettor या एक तुला पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब (ओं) के लिए, बूंदों में शामिल होंगे जो ऊपर तैरते सफेद परत (चित्रा 2 बी), हस्तांतरण. यह अपकेंद्रित्र ट्यूब के बारे में एक तिहाई भरता है तो नमूना करने के लिए, sorbitol 8% Ficoll, 10 मिमी Tris-एचसीएल, और 200 माइक्रोन EDTA बफर 600 मिमी जोड़ें.
- नई अपकेंद्रित्र ट्यूब (ओं) में नमूना (एस) के शीर्ष पर, sorbitol 10 मिमी Tris-एचसीएल 250 मिमी की बराबर मात्रा में जोड़ें, और 200 माइक्रोन EDTA बफर. इस के अलावा के बाद ट्यूबों पूर्ण के बारे में दो तिहाई होना चाहिए बफर.
- एक SW28 रोटर या समकक्ष में 1 घंटे के लिए 100,000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. एक बंद करो (रोटर मंदी = 0) के लिए तट के रोटर की अनुमति दें.
- डायलिसिस टयूबिंग के लिए, केवल लिपिड बूंदों और बाध्य प्रोटीन होते हैं, और Ficoll को खत्म करने के लिए 10 मिमी Tris-एचसीएल और 200 माइक्रोन EDTA बफर में ओ / एन dialyze चाहिए जो ऊपर सफेद परत (चित्रा -2), स्थानांतरण.
Placentas सिंगलटन गर्भधारण पूर्व अवधि में सहज श्रम की शुरुआत करने के लिए वैकल्पिक सीजेरियन सेक्शन प्रसव के दौर से गुजर के साथ स्वस्थ महिलाओं से एकत्र किए गए थे. विषयों उनके नाल के संग्रह के लिए लिखा, सूचित सहमति दे दी है. placentas का संग्रह है, और बाद में उपयोग, Knoxville संस्थागत समीक्षा बोर्ड में टेनेसी और चिकित्सा के टेनेसी ग्रेजुएट स्कूल के विश्वविद्यालय के विश्वविद्यालय (क्रमशः # 8757B और # 3338,) से अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया था.
1. मानव अपरा विलस कोशिकाओं को अलग
प्रोटोकॉल के भाग 1 Petroff एट अल. 26 से पहले के एक प्रकाशित प्रोटोकॉल के एक संशोधन है
समाधान निम्न तैयार:
- NaCl (1 एल): एक 1 एल समाधान के लिए उपज DH 2 हे में 9 छ NaCl (एम 58.4 छ / mol) को भंग. बाँझ फ़िल्टर (0.2; माइक्रोन झिल्ली).
- 10x हांक संतुलित नमक समाधान (10x HBSS) (1 एल): 4 जी KCl (एम 74.5 छ / mol), 0.6 जी के.एच. 2 पीओ 4 (एम 136.086 छ / mol), 80 ग्राम NaCl (एम 58.44 छ / mol); 10 जी डी ग्लूकोज (एम 180.16 छ / mol), 2 4 HPO (एम 141.96 छ / mol) ना. एक 1 एल समाधान के लिए उपज DH 2 हे में घटकों में से प्रत्येक भंग. बाँझ फ़िल्टर (0.2 माइक्रोन झिल्ली).
- एंजाइम पाचन बफर (0.6 मिलीलीटर): 3.3 मिलीलीटर 7.5% ना Biscarbonate, 17.5 मिलीलीटर 1 एम HEPES, और 266.1 मिलीलीटर DH 2 हे के साथ 70 मिलीलीटर 10x HBSS गठबंधन; बाँझ फ़िल्टर (0.2 माइक्रोन झिल्ली). 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
- DNase मैं: बस का उपयोग करने से पहले, DNase की एक शीशी 5 एमएल बाँझ 0.9% NaCl जोड़ें. -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग या दुकान तक बर्फ पर रखें
- विच्छेदन के लिए तैयारी नाल
- एक मानव प्लेसेंटा और संभव के रूप में प्रसव के समय के करीब प्रक्रिया प्राप्त करते हैं. ऐसे नाल परिवहन के लिए एक कूलर के रूप में एक मोहरबंद पोत का प्रयोग करें. जब हाथ हमेशा सावधानी का उपयोगलिंग मानव जैविक सामग्री.
- जैविक सुरक्षा हुड में, एक बाँझ autoclavable कंटेनर को नाल हस्तांतरण, और ध्यान से बाँझ 0.9% NaCl (खारा) समाधान का उपयोग नाल और झिल्ली से खून धो लो. तरल जैविक कचरे के रूप में 1 एल बीकर में खूनी खारा त्यागें.
- चिकनी सतह का सामना करना पड़ गर्भनाल असर के साथ, एक बाँझ मैदान पर नाल रखें. तेज, ठीक बिंदु कैंची और संदंश के साथ भ्रूण झिल्ली और गर्भनाल हटा दें.
- मातृ सतह (किसी न किसी सतह) का सामना करना पड़ रहा है कि इतना नाल पर पलटें. Overlying बेसल थाली ऊतक, सतह से लगभग 3 मिमी निकालें.
- नाल विदारक
- कोरियोनिक थाली से बचने के लिए एक समय में एक गर्भदल काटना. नमक के साथ एक 250 मिलीलीटर बीकर में विलस ऊतक लीजिए.
- तरल कचरे के लिए 1 एल बीकर का उपयोग, संदंश के साथ घूमता द्वारा 0.9% NaCl के साथ एक अलग बीकर में ऊतक कई बार कुल्ला.
- एक 150 मिमी पेट्री डिश के लिए एक समय में एक गर्भदल स्थानांतरण. संदंश के साथ पकड़ और पेट्री डिश पर जहाजों से धार के साथ ऊतक परिमार्जन. 0.9% NaCl युक्त अलग बीकर में scraped ऊतक रखें. सभी ऊतक टुकड़े के लिए दोहराएँ.
- सेल हदबंदी चलनी के लिए ऊतक के छोटे से हिस्से स्थानांतरण और eluate स्पष्ट हो जाता है जब तक बड़े पैमाने पर 0.9% NaCl के साथ कुल्ला. सभी ऊतक के लिए दोहराएँ.
- सेल हदबंदी चलनी में scraped ऊतक rinsing के बाद, अतिरिक्त तरल और वजन का यह नाली.
इस बिंदु पर ऊतक DMEM में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ Erlenmeyer फ्लास्क में ओ / एन संग्रहित किया जा सकता है.
- अपरा ऊतक के enzymatic पाचन
- Prewarmed एंजाइम कमजोर पड़ने बफर के 100 मिलीलीटर, 1 मिलीलीटर DNase मैं और 20 मिलीलीटर 2.5% 10x trypsin: ऊतक पाचन मिश्रण तैयार करें.
- एक 500 मिलीलीटर बाँझ Erlenmeyer फ्लास्क के लिए कुल एकत्र ऊतक (आमतौर पर के बारे में 250-300 ग्राम) से 60 ग्राम के हस्तांतरण, ऊतक फूट डालो.
- अलग कोशिकाओं का संग्रह
- ऊतक सुलझेगी जब तक पहले 45 मिनट हदबंदी के बाद, एक झुकाव पर पाचन कुप्पी निर्धारित किया है.
- Undissociated ऊतक एकत्रित करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, सतह पर तैरनेवाला लीजिए. एकत्र सतह पर तैरनेवाला को HBSS के बराबर राशि जोड़ें और बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरण. Undissociated ऊतक के अतिरिक्त हिस्से के लिए, undissociated ऊतक के साथ 3.2 कदम से शुरू प्रक्रिया को दोहराने.
- 15 मिनट के लिए 1000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर homogenate अपकेंद्रित्र.
- प्रत्येक बैच के लिए, centrifugation के बाद, गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate. अपरा विलस कोशिकाओं लाल रक्त कोशिकाओं overlying, गोली के सफेद भाग में मुख्य रूप से कर रहे हैं.
- एक सेंट के लिए विलस कोशिकाओं (गोली के सफेद भाग) स्थानांतरण50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब erile और बर्फ पर रख.
- सभी तीन पाचन चरणों से कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बाद, एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब के शीर्ष में डाला एक 100 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी का उपयोग निलंबन फिल्टर. सेल निलंबन की छानने का काम धीमा कर देती है, ट्यूब के भीतर एक निर्वात आकर्षित करने के लिए फिल्टर पर ऊपर की ओर उठा.
- 10 मिनट के लिए 1000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. ध्यान से गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटायें.
2. अपरा विलस कोशिकाओं homogenizing
- अलगाव की प्रक्रिया के साथ शुरू करने से पहले, 20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 7.4 और 1 मिमी EDTA युक्त Hypotonic Lysis मध्यम (HLM) के 50 एमएल तैयार करते हैं. बस का उपयोग करने से पहले HLM को protease inhibitors जोड़ें और बर्फ पर मध्यम रखना.
- जैविक सुरक्षा हुड में, कोशिकाओं को ठंडा HLM की 4 बार सेल गोली मात्रा में जोड़ें. धीरे और अच्छी तरह से कोशिकाओं pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspend ऊपर से एकएक 10 एमएल पिपेट का उपयोग डी नीचे.
- 10 मिनट के लिए बर्फ पर निलंबित कोशिकाओं को सेते हैं.
- बर्फ पर होना चाहिए जो Dounce homogenizer, कोशिकाओं स्थानांतरण. धीरे धीरे homogenizer के ढीले ढाले मूसल के साथ 20-25 कोमल स्ट्रोक लगाने से कोशिकाओं homogenize.
- अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 3000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल lysate अटूट कोशिकाओं, सेलुलर मलबे और नाभिक को दूर करने के लिए.
- सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एक SW28 ट्यूब (या 25,000 XG पर centrifuged किया जा सकता है कि वैकल्पिक) करने के लिए स्थानांतरण. Mitochondria दूर करने के लिए 20 मिनट के लिए 25,000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र.
3. Ultracentrifugation द्वारा लिपिड बूंदों अलग
- 50 100 मिमी सोडियम कार्बोनेट (एम 106 छ / mol) बफर (पीएच 11.5) की मिलीग्राम और 50 मिलीग्राम 60% of सुक्रोज (डब्ल्यू / डब्ल्यू) समाधान तैयार करें. बस का उपयोग करने से पहले सोडियम कार्बोनेट बफर protease inhibitors जोड़ें और बर्फ पर रख.
- समायोजित, एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कदम 2.6 से सतह पर तैरनेवाला लीजिएएक SW28 रोटर, या समकक्ष के लिए ultracentrifuge एक ट्यूब के तल में सुक्रोज और हस्तांतरण के 20% करने के लिए. ~ ठंडा 100 मिमी सोडियम कार्बोनेट बफर (पीएच 11.5) के 10 एमएल और ट्यूब भरने के लिए ठंडा HLM के 0.5-1 मिलीग्राम के साथ ओवरले घनत्व समायोजित सतह पर तैरनेवाला.
- SW28 झूल बाल्टी रोटर का उपयोग कर 45 मिनट के लिए 130,000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. एक बंद करो (रोटर मंदी = 0) के लिए तट के रोटर की अनुमति दें.
- 10% sucrose को समायोजित करने और एक SW41Ti रोटर, या समकक्ष के लिए एक 13.2 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब के नीचे में स्थानांतरण, चल परत लीजिए. ओवरले घनत्व के बारे में 5 ठंडा 100 मिमी सोडियम कार्बोनेट बफर (पीएच 11.5) की मिलीलीटर और बर्फ ठंड HLM के 0.5 मिलीलीटर के साथ सतह पर तैरनेवाला समायोजित.
- SW41Ti झूल बाल्टी रोटर का उपयोग कर 60 मिनट के लिए 274.000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. (रोटर मंदी = 0) लिपिड छोटी बूंद परत के विघटन को कम करने के लिए एक रोकने के लिए तट के रोटर की अनुमति दें.
- ध्यान से युक्त शीर्ष चल परत (चित्रा 2 डी) इकट्ठाएक 1 एमएल पिपेट और दोहराने कदम 3.4 के साथ लिपिड बूंदों.
- SW41Ti झूल बाल्टी रोटर का उपयोग कर 30 मिनट के लिए 274.000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. एक बंद करो (रोटर मंदी = 0) के लिए तट के रोटर की अनुमति दें.
- सावधानी से 100 μl HLM युक्त तीन 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में एक तुला पाश्चर विंदुक के साथ लिपिड बूंदों से युक्त शीर्ष सफेद रंग का अस्थायी परत जमा.
निस्र्पक लिपिड बूंदों अंश (प्रोटोकॉल 1 और 2)
लिपिड छोटी बूंद अंश की वसूली और पवित्रता प्रकाश या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त वेस्टर्न ब्लाट द्वारा सत्यापित किया जा सकता है. इसके अलावा, विभिन्न centrifugation कदम के बाद aliquots एकत्र किया जा सकता है और शुद्धि दक्षता का निर्धारण करने के लिए बनाए रखा. पश्चिमी सोख्ता में, यह टी पर अन्य झिल्ली भिन्न करने के लिए लिपिड बूंदों की तुलना से पूरे सेल lysate के एक बराबर का प्रतिनिधित्व करता है कि लिपिड छोटी बूंद अंश की मात्रा की तुलना करने के लिए अधिक उपयुक्त हैकुल प्रोटीन सामग्री 24 का वह आधार है.
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Representative Results
उम्मीद के रूप में घनत्व ढाल centrifugation काम किया है, चल परत लिपिड बूंदों को शामिल करना चाहिए और उच्च गति की स्पिन प्रगति भर में अन्य अंगों के समाप्त हो.
प्रोटोकॉल के लिए 1, पश्चिमी blots मार्कर लिपिड बूंदों (Erg6p) के लिए एंटीबॉडी, और खमीर, ईआर (Dpm1p), mitochondria (Por1p) में लिपिड बूंदों के साथ बातचीत करने के लिए पाया गया है कि organelles के साथ प्रदर्शन किया गया, प्लाज्मा झिल्ली (Pma1p), और रिक्तिकाएं (Vma1p).
प्रत्येक तीन की स्पिन चल परत (कदम 3.7, 3.10, और 3.13) एकत्र किए गए थे की बराबर मात्रा, Trichloroacetic एसिड (15% अंतिम एकाग्रता) के साथ उपजी, और पानी में solubilized. 13 सेल lysate की मिलीलीटर (चित्रा 3A, "लिस") और प्रत्येक तीन की स्पिन प्रोटीन प्रस्तुत करने का (चित्रा 3A, "Spin1", "Spin2", और "Spin3") nitrocellulose को हस्तांतरित, 12% एसडीएस पृष्ठ पर अलग हो गए थे झिल्ली, और organelle तकनीक और नवीनता के साथ immunoblottedFIC एंटीबॉडी. जैसी कि उम्मीद थी, लिपिड छोटी बूंद मार्कर प्रोटीन Erg6p तीन spins (चित्रा 3) में से प्रत्येक के बाद चल परत में मौजूद है; Por1p (चित्रा 3) Spin1 के बाद चल परत में मौजूद नहीं है, Vma1p Spin2 के बाद चल परत से समाप्त हो गया है (चित्रा 3), और Dpm1p और Pma1p Spin3 (चित्रा 3) के बाद चल परत में मौजूद नहीं हैं.
प्रोटोकॉल 2 के लिए, मानव अवधि अपरा विलस कोशिकाओं से अलग लिपिड बूंदों की उपस्थिति एक तटस्थ लिपिड विशिष्ट प्रतिदीप्ति डाई, BODIPY 493/503 के साथ धुंधला द्वारा सत्यापित किया गया था. बूंदों तो एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 बी) के तहत कल्पना कर रहे थे. पृथक लिपिड छोटी बूंद अंशों की पवित्रता लिपिड (2 perilipin) बूंदों, ईआर (calnexin), Golgi (GM130), mitochondria (कॉक्स चतुर्थ) और प्लाज्मा झिल्ली (MEK1) (चित्रा -3 सी) के लिए मार्कर प्रोटीन के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा मूल्यांकन किया गया था. लिपिड डॉ.oplets ठंड एसीटोन के साथ de-lipidated थे और प्रोटीन निकाले गए थे. बाद परमाणु सतह पर तैरनेवाला (पीएन) के बराबर प्रतिशत, पिछले स्पिन की चल परत (चित्रा -3 सी पर कदम 3.6, "Spin4") के नीचे अंश, बाद में धोने कदम (कदम 3.8, "Spin5" चित्रा -3 सी पर), और चल लिपिड छोटी बूंद परत (कदम 3.8, चित्रा -3 सी पर "एलडी") की de-lipidated प्रोटीन प्रस्तुत करने का, 12% एसडीएस पृष्ठ पर अलग तबादला और संकेत दिया एंटीबॉडी के साथ immunoblotted गया. (यह भी ADRP के रूप में जाना जाता है) perilipin 2, लिपिड छोटी बूंद प्रोटीन, के बाद परमाणु सतह पर तैरनेवाला में और लिपिड बूंदों से युक्त पृथक सफेद चल परत में पाया गया था. प्लाज्मा झिल्ली (MEK1) के लिए विशिष्ट और Golgi (GM130) प्रोटीन Spin4 और Spin5 के लिए चल परत के नीचे या तो परत में लिपिड छोटी बूंद भागों में पता नहीं थे. जैसा कि पहले बताया, ईआर प्रोटीन calnexin 18,27,28 और mitochondrial झिल्ली प्रोटीन कॉक्स चतुर्थ के एक कमजोर धुंधला देते किया गया हैलिपिड छोटी बूंद अंश 22 में कहीं cted. ये परिणाम है कि लिपिड बूंदों स्तनधारी कोशिकाओं 29 में और ईआर 30,31 साथ mitochondria के साथ बातचीत दिखा पहले की रिपोर्टों के साथ संगत कर रहे हैं.
चित्रा 1. विखंडन खमीर कोशिकाओं में सेलुलर लिपिड बूंदों. (ए) उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) और व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति लिपिड बूंदों BODIPY 493/503 के साथ रंगे हैं जहां छह प्रतिनिधि विखंडन खमीर कोशिकाओं की (Fluor.) छवियों. (बी) उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ ) और व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति लिपिड बूंदों BODIPY 493/503 के साथ रंगे हैं जहां एक प्रतिनिधि spheroplast की (Fluor.) छवियों. स्केल सलाखों 1 मिमी हैं. एक बड़ा संस्करण ओ देखने के लिए यहां क्लिक करेंच यह आंकड़ा.
चित्रा 2. घनत्व ढाल centrifugation के बाद फ्लोटिंग परत. बाद अपकेंद्रित्र ट्यूब (ए) Spin1 (कदम 3.8), (ख) Spin2 (कदम 3.11), और प्रोटोकॉल 1 (सी) Spin3 (कदम 3.14). (डी) अपकेंद्रित्र ट्यूबों के बाद प्रोटोकॉल 2 की Spin4 (3.6 कदम). लिपिड बूंदों से युक्त चल परतों तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 3. पृथक लिपिड बूंदों की शुद्धता का विश्लेषण. प्रोटोकॉल 1 में महत्वपूर्ण कदम की (ए) पश्चिमी blots. प्रत्येक प्रोटीन प्रस्तुत करने का (Spin1 की बराबर मात्रा - कदम 3.7, Spin2 - 3.10 कदम, और Spi N3 - कदम 3.13)) nitrocellulose झिल्ली को हस्तांतरित, एसडीएस पृष्ठ से अलग कर दिया, और Erg6p (एलडी, लिपिड बूंदों के लिए एंटीबॉडी के साथ immunoblotted गया था, Dpm1p (ईआर), Por1p (एमटी, mitochondria), Pma1p (प्रधानमंत्री, प्लाज्मा झिल्ली), और Vma1p (रिक्तिकाएं). (बी) चरण विपरीत (पीसी) और व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति मानव अपरा विलस कोशिकाओं से अलग कर दिया गया है कि BODIPY 493/503-stained लिपिड बूंदों की (Fluor.) छवियों. (सी) प्रमुख कदम के पश्चिमी blots प्रोटोकॉल 2 में. बराबर प्रतिशत पीएफ पीएन (पोस्ट परमाणु सतह पर तैरनेवाला), पिछले स्पिन (Spin4 - कदम 3.6) के बाद चल परत के नीचे सतह पर तैरनेवाला, बाद में धोने (Spin5 - कदम 3.8), और अस्थायी परत (एलडी) को हस्तांतरित, एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे झिल्ली और 2 (एलडी, लिपिड बूंदों) perilipin के लिए एंटीबॉडी के साथ immunoblotted, calnexin (ईआर), GM130 (Golgi मैट्रिक्स प्रोटीन, Golgi), कॉक्स चतुर्थ (साइटोक्रोम ग oxidase, मीट्रिक टन, mitochondria), और MEK1 (MAPK kinase, प्रधानमंत्री, प्लाज्मा झिल्ली).ad/50981/50981fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
संवर्धित कोशिकाओं के विकास के दौरान मीडिया और सेल घनत्व के अनुरूप होना सुनिश्चित करें. सेलुलर लिपिड बूंदों उनके जुड़े प्रोटीन कोशिकाओं सुसंस्कृत 17 हैं, जिसमें पर्यावरण पर बहुत निर्भर कर रहे हैं कि में अद्वितीय हैं. इसलिए, कोशिकाओं बड़े हो रहे हैं, जिसमें मीडिया और कोशिकाओं के घनत्व को बारीकी से सेल से पहले निगरानी की जानी चाहिए.
लिपिड बूंदों की प्रोटीन संरचना खमीर कोशिकाओं के विकास के चरण के एक समारोह है. कम प्रोटीन स्थिर चरण बनाम लॉग विकास के चरण में बूंदों के लिए बाध्य होंगे. इसके अलावा, दक्षता spheroplasting खमीर कोशिकाओं के विकास के चरण के एक समारोह है. उत्तरार्द्ध एंजाइमी उपचार के लिए प्रतिरोधी रहे हैं क्योंकि लॉग विकास के चरण में कोशिकाओं स्थिर चरण में कोशिकाओं की तुलना में स्फेरोप्लास्ट की अधिक पैदावार के लिए होगा.
तम्बू ">कोशिकाओं. Enzymatic पाचन द्वारा खमीर कोशिका दीवार टूट कि तकनीक लागू बल के माध्यम से कोशिका दीवार टूटना तकनीक है कि अधिक पसंद कर रहे हैं खुला तोड़ने के लिए कोमल तकनीकों का उपयोग करना सुनिश्चित करें. बाद विधि बाध्य प्रोटीन या लिपिड के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप बूंदों के संरचनात्मक अखंडता को बाधित कर सकते हैं.
यह बाध्य प्रोटीन या लिपिड के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप उनकी संरचनात्मक अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं क्योंकि कोशिकाओं lysed किया गया है के बाद नमूने ठंड से बचें. बर्फ़ीली बूंदों की सिफारिश नहीं है. बर्फ़ीली भी बूंदों 24 फ्यूज या टुकड़ा करने के लिए पैदा कर सकता है. बूंदों संभव है छोटे में टुकड़ा या गुजरना विखंडन लाइव खमीर कोशिकाओं 25 में और इस तरह बड़ा बूंदों के टूटने के लिए मनाया गया है के बाद से यह विशेष रूप से प्रासंगिक हो सकता है. टुकड़ा च में प्रदर्शित करने के लिए उछाल नहीं हो सकता है कि बूंदों के मोहरेघनत्व ढाल centrifugation के दौरान loating परत. यह कृत्रिम रूप से छोटी बूंद सतहों की प्रोटीन संरचना बूंद आकार 32 के एक समारोह हो सकता है, क्योंकि इस तकनीक के द्वारा की पहचान की जाएगी कि छोटी बूंद कारकों की संख्या कम कर सकता है.
लिपिड बूंदों को लिपिड छोटी बूंद जुड़े कारकों का स्थानीयकरण परीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें. लिपिड बूंदों की विशेषताओं में से एक है कि वे अन्य अंगों 33-37 के साथ बातचीत करता है. इसलिए, इन अंगों से कारकों अक्सर लिपिड छोटी बूंद अंश में पाए जाते हैं. इसलिए, यह इन कारकों बूंदों को स्थानीय बनाना सुनिश्चित करना है कि अतिरिक्त तकनीक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. लिपिड बूंदों एक अलग फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ दाग रहे हैं, जहां कोशिकाओं में ब्याज की प्रोटीन से जुड़ा हुआ एक फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन के साथ अध्ययन colocalization 15 की सीमा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. ऐसे प्रोटीन सहसंबंध के रूप में तकनीक जनसंपर्कofiling आगे लिपिड छोटी बूंद अंश 15 की पवित्रता यों इस्तेमाल किया जा सकता है. कि रणनीति में, दो घटकों प्रत्येक विभिन्न आइसोटोप युक्त एमिनो एसिड के साथ लेबल रहे हैं. पहला घटक एक ज्ञात लिपिड छोटी बूंद कारक है, और दूसरे घटक विश्लेषण किया जा रहा है कि अंश है. तुलना तो दो घटकों के आंशिक स्थानों के बीच बने हैं.
संशोधन और निवारण
नवोदित खमीर से लिपिड बूंदों के लिए अलग प्रोटोकॉल 1 के लिए संशोधन का उल्लेख किया जाता है. लिपिड बूंदों का आकार बहुत भिन्न हो सकता है. घनत्व ढाल centrifugation गति चल परत में जमा करने के लिए छोटे बूंदों के लिए वृद्धि की आवश्यकता हो सकती है.
तकनीक की सीमाएं
रूप के साथ एक अति अपकेंद्रित्र तक पहुंचबाल्टी रोटर winging सेलुलर लिपिड बूंदों के अलगाव के लिए आवश्यक है. उपकरण के इस टुकड़े सबसे कोशिका जीव विज्ञान और जैव रसायन प्रयोगशालाओं में मानक है, यह महंगा है.
मौजूदा तरीकों या अन्य वैकल्पिक तरीकों के संबंध में तकनीक का महत्व
जैसा कि ऊपर कहा, प्रोटोकॉल 1 बारीकी से लेबर एट अल. 6 और प्रोटोकॉल 2 के भाग 1 Petroff एट अल. 26 से पहले के एक प्रकाशित प्रोटोकॉल के एक संशोधन है के आधार पर काम कर रहा है
ऐप्लकेशन
लिपिड छोटी बूंद अलगाव बाध्य प्रोटीन, तटस्थ लिपिड और phospholipids के बाद प्रोटिओमिक और lipidomic विश्लेषण के लिए सबसे उपयोगी है. लिपिड छोटी बूंद जुड़े प्रोटीन और लिपिड के इन्वेंटरी 4,6-17,19,20,22,23,28 संकलित किया गया है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.
Acknowledgments
इस काम के पीडी को पीडी को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पुरस्कार 13SDG14500046, एक सतत ऊर्जा शिक्षा एवं रिसर्च सेंटर अवार्ड (टेनेसी Univ.) द्वारा समर्थित है, और जेएम को 'डॉक्टरों चिकित्सा शिक्षा एवं अनुसंधान फाउंडेशन (टेनेसी Univ.) द्वारा पुरस्कार दिया गया था उसकी मिलाते इन्क्यूबेटरों, tabletop अपकेंद्रित्र, और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण उपकरणों के उपयोग के लिए एरिक टी. Boder (टेनेसी Univ.); लेखकों स्फेरोप्लास्ट को विखंडन खमीर परिवर्तित करने के लिए प्रोटोकॉल के लिए कैरोलीन Leplante (. येल यूनिवर्सिटी) धन्यवाद और के लिए केंद्र अपने अल्ट्रा अपकेंद्रित्र के उपयोग के लिए पर्यावरण जैव प्रौद्योगिकी (विश्वविद्यालय टेनेसी), खमीर एंटीबॉडी के लिए गुंठर Daum (ग्राज़ विश्वविद्यालय प्रौद्योगिकी, ऑस्ट्रिया की.), तकनीकी सहायता के लिए प्रसूति और स्त्री रोग (विश्वविद्यालय टेनेसी मेडिकल सेंटर) विभाग के कर्मियों .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
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