Summary
1つの細胞の脂質滴を単離するための技術）は、酵母細胞および2）ヒト胎盤が提示される。両方の手順は、液滴の中心を含有する得られた浮遊層が容易に、眼によって視覚化抽出し、純度についてウェスタンブロット分析によって定量化することができる密度勾配遠心分離である。
Abstract
脂肪滴は、ほとんどの真核および特定の原核細胞で見つけることができる動的な細胞小器官である。構造的には、液滴は、リン脂質単分子膜に囲まれた中性脂質のコアで構成されています。液滴の細胞の役割を決定する際に最も有用な技術の1つは、液滴と共に単離することができ、結合したタンパク質のプロテオーム同定されている。分裂酵母とヒト胎盤絨毛細胞：ここでは、二つの方法が2幅広い真核生物からの脂肪滴とその結合したタンパク質を分離するために記述されている。両方の技術は、違いがありますが、mainメソッド - 密度勾配遠心分離を - 両方の製剤で共有されている。これは、提示された液滴分離技術の広い適用可能性を示している。
第一のプロトコルにおいて、酵母細胞は、その細胞壁の酵素消化によって、スフェロプラストに変換される。結果としてフェロプラストはその後紳士ですLYゆったりホモジナイザーで溶解。フィコール密度勾配を提供するために、溶解物に添加し、そして混合物を3回遠心分離する。第一のスピンの後、脂質滴は、小胞体（ER）、原形質膜、および液胞と共に遠心分離管の白色フローティング層に局在している。二つの連続スピンはこれらの他の3小器官を除去するために使用される。結果は滴と結合したタンパク質を持っている層である。
第二のプロトコルでは、胎盤絨毛細胞は、細胞がゆったりホモジナイザーでホモジナイズするトリプシンで酵素消化によりヒト満期胎盤から単離され、DNA分解酵素Iをされています。低速·中速遠心分離工程は、未破壊細胞、細胞破片、核、ミトコンドリアを除去するために使用される。スクロース密度勾配を提供するために、ホモジネートに添加し、混合物を他の蜂巣から脂質滴を分離するために遠心分離されるR画。
両方のプロトコルにおける脂肪滴の純度は、ウェスタンブロット分析によって確認される。両方の調製物からの液滴画分は、その後のプロテオームとlipidomic分析に適している。
Introduction
細胞の脂質滴は、細胞内で複数の機能を果たす動的小器官である。それらはエネルギーに変換またはリン脂質合成のために使用することができる中性脂質の貯蔵のハブである。液滴は、アテローム性動脈硬化症、肥満症および関連する代謝疾患を含む生理学的および病理学的状態において中心的役割を果たし、また、感染症1,2。さらに、それらは、バイオディーゼル燃料のための魅力的な供給源である。
脂肪滴の細胞の役割に関する多くの情報は、幅広い生物3から精製された液滴のプロテオミクスおよびlipidomic分析から得られている。これらの生物は、細菌4,5、酵母6-11含ま12,13植物、14を線虫、そして15,16飛ぶました。ヒトの代謝性疾患における脂肪滴の役割への関心を考慮すると、液滴はまた、培養動物細胞であり、aから単離されているニマル組織。培養細胞株は、3T3-L1脂肪細胞17、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞K2 18、ヒトhepatocyes 19,20、および上皮細胞系21が含まれている。液滴が単離されたから動物組織は、マウス骨格筋22、肝臓23、及び乳腺23が含まれている。上述したように、ほとんどの液滴の分離の研究の目標は、中性およびリン脂質に結合した因子およびlipidomic分析プロテオーム解析を実行することである。
中性脂質以来 - 脂質滴の最も多い成分は - ほとんどの他の細胞材料よりも緻密であり、液滴の分離は、従来、密度勾配遠心分離を用いて行われた。その手法は、ここで紹介するの両方プレップの目玉です。従来の技術は、培養6,24分裂酵母細胞からの液滴の分離を視覚的に結合され、変更されたおよび胎盤組織から得られたヒト細胞をnoncultured。目標は、液滴分離のための出発点に、2つの非常に異なる細胞型を選択することによって、この技術の広い適用可能性を示すことである。この手法は、ほとんどの生物からの液滴を分離したい方のために有用であるはずである。
プロトコル1は、真核細胞分裂の間に25滴形成を観察するためのモデルとして使用されてきた分裂酵母、 シゾサッカロミセス·ポンベから脂質滴の単離が記載されている。出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、脂質滴生物学を研究するためのモデル生物として広く使用されている。プロトコル1は、生物や強調されている準備の違いの両方に適用可能である。
プロトコル2は、ヒト満期胎盤から得た順にある胎盤絨毛細胞から脂肪滴の単離を記載している。ザ·満期胎盤のコレクションは、安全かつ倫理的に脂肪滴のかなりの数が含まれ、容易に入手可能なヒト組織26、200〜250を得するユニークな機会を提供します。これは、液滴が培養された細胞に由来高等真核生物における最も脂肪滴分離作業とは対照的である。これらの研究では、脂肪酸は、多くの場合、中性脂質の合成、従って、液滴の成長を促進する培養物に添加される。これは、脂質滴を、胎盤組織中の天然の条件下で形成される、ここでの作業とは対照的である。
脂肪滴の画分の純度は、細胞小器官マーカー抗体を用いたウェスタンブロット分析によって決定される。これら2つのプロトコルが、後続のプロテオームとlipidomic分析するのに適した脂肪滴画分が得られる。
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Protocol
1。 （分裂）酵母細胞から脂肪滴を分離
酵母サッカロミセス·セレビシエ 、 出芽人気のモデル生物からの液滴の単離は、以下のプロトコル6とほぼ同じです。調剤の違いに注目している。
1。成長している酵母細胞
- メディアを準備します。ガラス瓶や培養フラスコ中のdH 2 Oリットル当たりYE5Sの粉末36グラムを兼ね備えています。メディアの約2 Lは必要とされるであろう。 20分間121℃でオートクレーブ媒体。媒体を室温まで冷却させる。 S.のためのcerevisiaeの YPDでYE5Sを交換してください。
- 無菌技術を使用して、250ミリリットルの培養フラスコに冷却YE5Sメディアの10〜20ミリリットル入れます。無菌木の棒または同等を使用した寒天プレートからの酵母細胞の少量のメディアを接種する。細胞は30℃で所望の光学密度まで成長させAでの光学密度を測定する分光光度計を用いて波長595nm。
- 2.8 Lのフラスコ内に残っているメディアをセットします。振盪インキュベーター中で細胞増殖の間に適切な混合を確実にするために2.8 Lのフラスコあたり培地1 L以下で使用しない。湿った細胞の最終収率は、プロテオミクスとlipidomic分析のための十分な脂肪滴を取得することができるように約10グラムである必要があります。
- 各ステップ1.1で調製した培地を1リットルた2.8 Lのフラスコにステップ1.2から細胞を紹介する。
- 30℃で所望の密度まで細胞を増殖させる
- 細胞は脂肪滴があることを確認してください。準備金の細胞の1ミリリットル。試料の光学密度（OD）を測定する。サンプルに細胞のODあたりのエタノールにBODIPY 503分の493の100 mMストックの0.1ミリリットルを追加します。ガラススライドとカバーガラスの間にサンプルを3μLを配置します。 GFPフィルター（ 図1A）と蛍光顕微鏡下で可視化する。
- 4＆＃でステップ1.5から細胞をペレット化176、C 10分間3800×gで。遠心管の容量に応じて、バッチで動作します。
- YE5Sメディアを捨て、ソルビトール、EMM + 600 mMの緩衝液で細胞を洗浄。ソルビトールは、浸透サポートを提供します。
- 無菌の50ml遠心チューブに細胞を移し、10分間、2,000×gで4℃で細胞をペレット化。上清を取り除きます。湿潤細胞を秤量する。細胞1グラムあたり（EMM + 600mMのソルビトール）緩衝液2mlで細胞を再懸濁する。
2。スフェロとその後の溶解に分裂酵母細胞への変換
- ）酵母溶解酵素を5 mgの1をそれぞれ追加し、2）酵母トリコデルマハルジアナムあたりのグラムステップ1.9で計量した湿った細胞の由来の酵素を溶解する。 S.のためのセレビシエはザイモリアーゼ同量のこれらの酵素を増強する。
- 60分間、100rpmで穏やかに振とう下、30℃で細胞をインキュベートする。
- スフェロ脂質DRを持っていることを確認してくださいoplets。ステップ1.6（ 図1B）を繰り返すことにより。
3。密度勾配遠心
- 5分間、2,000×gで4℃で遠心分離することにより、スフェロプラストをペレット化。
- 慎重にプラスチック製のトランスファーピペットを用いて上清を除去します。
- 優しくソルビトールの氷冷10mMトリス-HCl、600 mmのペレット状のスフェロプラストを再懸濁し、200μMのEDTA。スフェロは非常に脆弱であることに留意してください。
- ステップ3.1と同じ設定を使用して、もう一度フェロプラストをペレット化。慎重に上清を除去し、2ミリリットル/ G-細胞の濃度で12％のFicoll、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA中のプラスチックトランスファーピペットを使用してスフェロ再懸濁します。
- ガラスホモジナイザーに再懸濁フェロプラストを移し、ゆっくりとガラスホモジナイザーのゆったり乳棒を用いて、氷の上で、20〜30ストロークを均質化する。
- 遠心管に溶解したスフェロプラストを転送し、同じVOオーバーレイ12％フィコール、10mMトリス-HCl、および200μMEDTA緩衝液LUME。各チューブは、約3分の2杯になるように使用する遠心管の数を選択してください。
- SW28ローターまたは同等の中で1.5時間、100,000×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。
- 優しくピペッターまたは曲がっパスツールピペットのいずれかを使用して、新しい遠心管（複数可）に、液滴を含む最白浮き層（ 図2A）、転送します。それは大まかに遠心管の3分の1を満たすように、試料に12％の十分な容量のFicollを追加し、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA緩衝液。
- 新しい遠心管（S）のサンプル（S）の先頭に8％のFicoll相当ボリュームを追加し、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA緩衝液。この添加後、チューブをバッファフルの三分の二程度にする必要があります。
- SW28ローターまたは同等の中で1時間、100,000×gで4℃で遠心します。 R（停止するまで惰性ローターを許可するotor減速= 0）。
- 優しくピペッターまたは曲がっパスツールピペットのいずれかを使用して、新しい遠心管（複数可）に、液滴を含むことになるトップ浮遊白層（ 図2B）を 、転送します。それは遠心管の約3分の1を満たすように600mMのソルビトールを追加し、8％フィコール、10mMトリス-HCl、試料200μMEDTA緩衝液。
- 新しい遠心管（S）のサンプル（S）のトップにソルビトール250 mMと同等のボリュームを追加し、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA緩衝液。この添加後、チューブをバッファフルの三分の二程度にする必要があります。
- SW28ローターまたは同等の中で1時間、100,000×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。
- 透析管に、唯一の脂質小滴と結合したタンパク質を含有し、そしてフィコールを排除するために10mMトリス-HCl及び200μMEDTA緩衝液中にO / Nを透析する必要があり頂白色層（ 図2C）を転送する。
胎盤は、シングルトン妊娠前任期で自然分娩の発症に選択的帝王切開の配信を受けている健康な女性から採取した。被験者は、自分の胎盤を収集するための書面によるインフォームドコンセントを与えた。胎盤の収集、およびその後の使用は、テネシー大学からの承認を得て行われ、ノックス治験審査委員会の医学のテネシー大学大学院（＃の8757Bと＃3338、それぞれ）した。
1。ヒト胎盤絨毛細胞を単離する
プロトコルの第1部では、ペトロフらの以前公開されたプロトコルの変形である。26
次の解決策を準備します。
- NaCl水溶液（1 L）：1 Lの溶液を得たのdH 2 O 9のNaCl（M 58.4グラム/モル）を溶解する。濾過滅菌（0.2;の膜）。
- 10倍ハンクス液（10×HBSS）（1 L）：4のKCl（M 74.5グラム/モル）、0.6グラムのKH 2 PO 4（M 136.086グラム/モル）、80グラムのNaCl（M 58.44グラム/モル）; 10gのD-グルコース（M 180.16グラム/モル）、2 HPO 4（M 141.96グラム/モル）のNa。 1 Lの溶液を得たのdH 2 O中の成分の各々を溶解する。濾過滅菌（0.2μmの膜）。
- 酵素消化緩衝液（0.6ミリリットル）：3.3ミリリットル、7.5％のNaビスカーボネート、17.5ミリリットルの1MのHEPES、及び266.1ミリリットルのdH 2 Oで70ミリリットル10倍のHBSSを組み合わせ、濾過滅菌（0.2μm膜）。 4℃で保存する
- DNアーゼ私は：使用直前に、DNA分解酵素のバイアルに5ミリリットルの無菌の0.9％NaClを追加します。 -20℃での使用·保管まで氷上に保つ
- 解剖の準備胎盤
- できるだけ配達時に近いヒト胎盤およびプロセスを取得します。このような胎盤を輸送する冷却器として密封容器を使用してください。とき手は、常に十分注意してください玲人間の生体物質。
- 生物学的安全フード、滅菌オートクレーブ容器に胎盤を転送し、慎重に無菌の0.9％NaCl（生理食塩水）溶液を用いて、胎盤および膜から血を洗う。液体生物学的廃棄物として1リットルのビーカーに血まみれの生理食塩水を捨てる。
- 滑らかな表面を上に向け臍帯を保有して、無菌領域に胎盤を置きます。シャープ、ファインポイントハサミとピンセットで胎児の膜および臍帯を削除します。
- 母体の表面（粗面）が上を向いているように、胎盤を裏返し。上層基板組織、表面から約3ミリメートルを削除します。
- 胎盤を解剖
- 絨毛膜板を避けて一度に1子葉を解剖。生理食塩水250ミリリットルビーカーに絨毛組織を収集しています。
- 液体廃棄物の1リットルのビーカーを使用して、ピンセットで回転させることによって、0.9％NaClを別のビーカー内の組織数回すすいでください。
- 150ミリメートルペトリ皿に一度に1子葉を転送します。ピンセットで保持し、シャーレ上の血管からかみそりの刃で組織をこすり。 0.9％NaClを含む別のビーカー中に掻き組織を置きます。すべての組織片について、この手順を繰り返します。
- 細胞解離ふるいに組織の一部を転送し、溶出液が透明になるまで徹底的に0.9％NaClですすいでください。全ての組織に対して、この手順を繰り返します。
- 細胞解離ふるいに掻き組織をすすいだ後、余分な液体と重さ、それを排出します。
この時点で、組織は、O / N DMEM中で4℃で無菌三角フラスコ内に格納することができる。
- 胎盤組織の酵素消化
- あらかじめ温めておいた酵素希釈緩衝液100ml、1ミリリットルのDNase Iと20ミリリットル2.5％10Xトリプシン：組織消化液を調製する。
- 500ミリリットルの滅菌三角フラスコに総採取した組織（通常は約250〜300グラム）から60グラムを転送する、組織を分割する。
- 解離した細胞を回収する
- 組織が安定するまで最初の45分解離した後、傾斜で消化フラスコを設定します。
- 未解離組織を収集しないように注意しながら、上清を集める。回収した上清に、HBSSを同量を追加し、滅菌15mL遠心管に移す。解離していない組織の追加部分については、解離していない組織とステップ3.2から始まる手順を繰り返してください。
- 遠心分離機で15分間、1,000×gで4℃でホモジネート。
- 各バッチには、遠心分離後、ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去する。胎盤絨毛細胞は赤血球の上にある、ペレットの白い部分に主にある。
- STに絨毛細胞（ペレットの白い部分）を転送erile 50ミリリットルコニカル遠心管、氷上に保つ。
- 3つ全ての消化段階から細胞を収集した後、滅菌50mlコニカル遠心管の最上部に挿入さ100μmナイロン細胞ストレーナーを用いて懸濁液を濾過する。細胞懸濁液の濾過が遅くなる場合は、チューブ内に真空を引くために、フィルタを上に持ち上げる。
- 10分間1,000×gで4℃で遠心。慎重にペレットを乱すことなく、上清を除去します。
2。胎盤絨毛細胞をホモジナイズ
- 分離プロセスを開始する前に、20mMのトリス-HCl、pH7.4および1mMのEDTAを含有する低張溶解培地（HLM）を50mlを調製する。使用直前に、HLMにプロテアーゼ阻害剤を添加し、氷上でメディアを保持します。
- 生物学的安全フード内で、細胞への氷冷HLMの4倍の細胞ペレットの量を追加します。やさしく、徹底的に細胞をピペッティングして細胞を再懸濁アップANを10mlピペットを用いてdをダウン。
- 10分間氷上に懸濁した細胞をインキュベートします。
- 氷の上でなければなりませんダウンスホモジナイザーに細胞を移す。ゆっくりホモジナイザーのゆったりした乳棒で20〜25穏やかなストロークを適用することにより、細胞を均質化する。
- 遠心未破壊細胞、核および細胞破片を除去するために10分間3,000×gで4℃で細胞溶解物。
- 上清を回収し、（25,000×gで遠心分離することができるまたは代替）SW28チューブに移す。ミトコンドリアを除去するために20分間25000×gで4℃で遠心します。
3。超遠心分離によって脂質小滴を単離する
- 100mMの炭酸ナトリウム（M 106グラム/モル）緩衝液（pH 11.5）および60％スクロース（w / w）の溶液50mlを50mlを調製する。使用直前に炭酸ナトリウム緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を添加し、氷上に保つ。
- 50ミリリットル遠心管にステップ2.6から上清を回収し、調整SW28ローター、または同等のための超遠心管の底部へのスクロースおよび転写の20％。 〜氷冷100mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH 11.5）を10mlのチューブに充填するために、氷冷HLM 0.5〜1 mlの密度に調整オーバーレイ上清。
- SW28スイングバケットローターを使用して45分間13万×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。
- 浮遊層を集め、10％ショ糖に調整し、SW41Tiローター用13.2ミリリットル超遠心管の底部、または同等に移す。オーバーレイ密度約5mlの氷冷100mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH 11.5）を、0.5mlの氷冷HLMの上清を用いて調整した。
- SW41Tiスイングバケットローターを用いて60分間274,000×gで4℃で遠心します。脂肪滴層の破壊を最小限にするために、停止（ロータ減速= 0）に海岸にローターを許可します。
- 慎重に含む最浮動層（ 図2D）を収集1ミリリットルピペットを繰り返しステップ3.4に脂肪滴。
- SW41Tiスイングバケットローターを用いて30分間274,000×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。
- 慎重に100μlのHLMを含む3 1.5mlチューブに曲げたパスツールピペットで脂肪滴を含むトップ白色浮動層を収集します。
特徴付ける脂質滴画分（プロトコール1及び2）
脂肪滴画分の回収および純度は、光又は電子顕微鏡と組み合わせてウエスタンブロットによって検証することができる。さらに、異なる遠心分離工程後のアリコートを収集することができ、浄化効率を決定するために保持される。ウェスタンブロッティングでは、tは上に他の膜画分に脂肪滴を比較するよりも、全細胞溶解物の当量を表し、脂肪滴の体積分率を比較することがより適切である総タンパク質含有量24の彼が根拠。
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Representative Results
期待通りに密度勾配遠心分離が働いていた場合、浮動層が脂肪滴が含まれている必要があり、高速スピンの進行を通じて、他の細胞小器官が枯渇する。
プロトコル1は、ウェスタンブロット、マーカー脂肪滴（Erg6p）に対する抗体、および酵母、ER（Dpm1p）、ミトコンドリア（Por1p）中の脂質滴と相互作用することが見出されている細胞小器官を用いて行った、原形質膜（Pma1p）、および液胞（Vma1p）。
各3スピンの浮遊層（ステップ3.7、3.10、及び3.13）を集め、等量のは、トリクロロ酢酸（15％最終濃度）で沈殿させ、水に可溶化した。各3スピンの細胞溶解物（ 図3A、「リジン」）およびタンパク質プレップ13mlの（ 図3A、「Spin1」、「Spin2」、および「Spin3」）をニトロセルロースに移し、12％SDS-PAGE上で分離した膜、およびオルガネラ仕様でイムノブロットFIC抗体。予想されたように、脂肪滴マーカータンパクErg6pは3スピン（ 図3A）のそれぞれの後に浮遊層に存在する。Por1pは（ 図3A）Spin1後、浮遊層には存在しない。Vma1pはSpin2後に浮遊層から枯渇される（ 図3A）、およびDpm1pとPma1pはSpin3（ 図3A）の後、浮遊層には存在しない。
プロトコル2は、ヒト胎盤絨毛用語細胞から単離した脂質滴の存在は、中性脂質特異的蛍光色素、BODIPY 503分の493で染色することにより確認した。液滴は、次いで、蛍光顕微鏡（ 図3B）の下で可視化した。単離された脂肪滴画分の純度は、（2ペリリピン）脂質滴のマーカータンパク質を用いたウェスタンブロッティングによって評価した、ER（カルネキシン）、ゴルジ（GM130）、ミトコンドリア（COX IV）および原形質膜（MEK1）（ 図3C）。脂質DRopletsを冷アセトンで脱脂質化し、タンパク質を抽出した。等しいポスト核上清（PNS）の割合は、最後のスピン（ 図3Cの手順3.6「Spin4」）の浮遊層の下分、その後の洗浄ステップ（ 図3Cの手順3.8「Spin5」）、およびフローティング脂質滴層（ステップ3.8、 図3Cの「LD」）の脱脂質化タンパク質準備が指示された抗体を用いて移し、免疫ブロットし、12％SDS-PAGE上で分離した。 （またADRPとしても知られる）ペリリピン2、脂肪滴タンパク質は、ポスト核上清および脂肪滴を含有する単離された白色浮遊層で検出された。原形質膜（MEK1）に特異的およびゴルジ（GM130）タンパク質はSpin4とSpin5フローティング層の下のいずれかの層に脂肪滴画分に検出されなかった。既報の通り、ERタンパク質のカルネキシン18,27,28とミトコンドリアの膜タンパク質のCOX IVの弱い染色は、DETEてきた脂肪滴分22内の他の場所CTED。これらの結果は、脂肪滴が29哺乳動物細胞における小胞体30,31とミトコンドリアと相互作用することを示した以前の報告と一致している。
図1。分裂酵母の細胞における細胞脂肪滴（A）明視野（BF）と広い視野蛍光脂肪滴がBODIPY 503分の493で染色された6つの代表的分裂酵母細胞の（Fluor.）の画像。（B）明視野（BF ）と、脂肪滴がBODIPY 503分の493で染色された代表的なフェロプラストの広視野蛍光（Fluor.）のイメージ。スケールバーは1mmである。 拡大版Oを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図F。
図2。密度勾配遠心分離後の浮遊層 。 （A）Spin1（ステップ3.8）、（B）Spin2（ステップ3.11）、およびプロトコル1の（C）Spin3（ステップ3.14）の後に遠心管（D）遠心管プロトコル2のSpin4（ステップ3.6）の後。脂肪滴を含有するフローティング層が矢印で示されている。
図3。単離された脂肪滴の純度の分析。プロトコール1における重要なステップの（A）ウエスタンブロット。各タンパク質準備等容量（Spin1 - ステップ3.7、Spin2 - ステップ3.10、およびSPI n3は - 工程3.13）は、SDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、Erg6p（LD、脂質滴）、Dpm1p（ER）、Por1p（MT、ミトコンドリア）、Pma1p（PM、原形質膜）に対する抗体で免疫ブロットしたおよびBODIPYのVma1p（液胞）、（B）位相コントラスト（PC）と広視野蛍光（Fluor.）画像は、ヒト胎盤絨毛細胞から単離された脂肪滴を493/503-stained。キー工程（C）ウェスタンブロット議定書2にある。イコールパーセントPF PNS（ポスト核上清）、最後のスピン（Spin4 - ステップ3.6）の後、浮遊層の下の上澄み、その後の洗浄（Spin5 - ステップ3.8）、浮動層（LDが）に転送、SDS-PAGEで分離した膜および2（LD、脂質滴）をペリリピンに対する抗体で免疫ブロットし、カルネキシン（ER）、GM130（ゴルジマトリックスタンパク質、ゴルジ）、COX IV（シトクロムcオキシダーゼ、MT、ミトコンドリア）、およびMEK1（MAPKキナーゼ、PM、血漿メンブレン）。ad/50981/50981fig3highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの中の重要なステップ
培養細胞の成長中のメディアと細胞密度と一致していることを確認します。細胞の脂質滴はそれらに関連するタンパク質は、細胞が17培養された環境に大きく依存している点で独特である。したがって、細胞が成長する培地と細胞の密度は、密接に溶解する前に監視されるべきである。
脂肪滴のタンパク質組成物は、酵母細胞の増殖期の関数である。一部のタンパク質は、固定相に対する対数増殖期に小滴に結合される。また、効率のスフェロプラストは、酵母細胞の増殖期の関数である。後者は酵素処理に対してより耐性であるため、対数増殖期の細胞を静止期の細胞よりフェロプラストの高い収率を有するであろう。
10トン ">細胞をオープン破る優しい技術を使用してください。酵素消化により酵母細胞壁を破壊する技術が加えられた力によって、細胞壁を破壊する技術よりも好ましい。後者の方法は、結合したタンパク質又は脂質の損失をもたらす液滴の構造的完全性を破壊することができる。
それが結合したタンパク質や脂質が失われ、その構造的完全性に影響を与えることができるので、 細胞が溶解された後、サンプルの凍結を回避する。凍結液滴が推奨されていません。凍結はまた、液滴が24を融合または断片化する可能性があります。液滴が可能である小さなものに断片化又は分裂を受ける生酵母細胞25に、従って、より大きな液滴の破壊が観察されているので、これは特に重要であり得る。フラグメントはFに表示する浮力がない可能性があり、液滴の小品密度勾配遠心分離中loating層。これは、人工的に、液滴表面のタンパク質組成は、液滴サイズ32の関数とすることができるので、この技術によって同定される液滴因子の数を減らすことができる。
脂肪滴に脂肪滴に関連する因子の局在をテストすることを確認します。脂肪滴の特徴の一つは、彼らが他の細胞小器官33-37と相互作用することである。したがって、これらのオルガネラからの因子は、しばしば、脂肪滴画分に見出される。したがって、これらの因子が小滴に局在することを確認するためにさらなる技術を使用することが重要である。脂質小滴を異なる蛍光マーカーで染色された細胞中の目的のタンパク質に連結蛍光融合タンパク質を用いた研究は、共局在15の程度を決定するために使用されるべきである。例えば、タンパク質相関のような技術広報ofilingはさらに、脂質滴画分15の純度を定量するために使用することができる。その戦略では、2つの成分は、各々の異なる同位体含有アミノ酸で標識される。第一成分は、公知の脂肪滴係数であり、第二成分が分析されている画分である。比較は、2つの構成要素の小数位置の間で作られています。
修正とトラブルシューティング
出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から脂肪滴を分離するための議定書1への変更が記載されています。脂肪滴の大きさが大きく異なることに注意してください。密度勾配遠心分離速度は、フローティング層内に蓄積する小さな液滴ために増加される必要があり得る。
技術の限界
などの超遠心機へのアクセスバケットローターを翼状は、細胞の脂質滴の単離のために必須である。機器のこの部分は、ほとんどの細胞生物学および生化学の研究室で標準的であるが、高価である。
既存の方法や他の代替方法に関する技術の重要性
上述したように、プロトコル1と密接レーバーらの研究に基づいています。6およびプロトコル2の第1部では、ペトロフらの以前公開されたプロトコルの変形である。26
アプリケーション
脂肪滴の分離は、結合したタンパク質、中性脂質およびリン脂質のその後のプロテオミクスおよびlipidomic分析に最も便利です。脂肪滴に関連するタンパク質や脂質の在庫が4,6-17,19,20,22,23,28をコンパイルされている。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
この作品は、PDにし、JM低から医師の医療教育研究財団（テネシー大学）賞で持続可能なエネルギー教育研究センター賞（テネシー大）、PDに米国心臓協会賞13SDG14500046によってサポートされていました彼の揺れインキュベーター、卓上遠心、およびウエスタンブロット分析装置の使用のためにエリック·T. Boder（テネシー大学）;、著者らは、フェロプラストに分裂酵母を変換するためのプロトコルのためにキャロラインLeplante（エール大学）に感謝し、センター彼らの超遠心機を使用するための環境バイオテクノロジー（東大テネシー州）、酵母抗体についてのギュンター·ダウム（グラーツ大学技術、オーストリア）;技術支援のための産婦人科（東大テネシー州の医療センター）の職員。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
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