Summary
To teknikker for å isolere celle lipid dråper fra 1) gjær-celler og 2) humane placentas presenteres. Midtpunktet i begge fremgangsmåter er tetthetsgradient-sentrifugering, der den resulterende flytende lag som inneholder dråpene kan lett visualiseres ved øyet, ekstrahert og kvantifisert ved Western Blot analyse for renhet.
Abstract
Lipid dråper er dynamiske organeller som finnes i de fleste eukaryote og enkelte prokaryote celler. Strukturelt dråpene består av en kjerne av nøytrale lipider som er omgitt av et fosfolipid monolayer. En av de mest nyttige metoder for å bestemme den cellulære rollene til dråper har vært proteomikk identifisering av bundne proteiner, som kan bli isolert sammen med dråpene. Her er to metoder beskrevet å isolere lipid dråper og deres bundne proteiner fra to omfattende eukaryoter: fisjon gjær og menneskelige placenta villous celler. Selv om begge metoder har forskjeller, den viktigste metode - densitetsgradient sentrifugering - er felles for begge preparater. Dette viser den brede anvendbarhet av de presenterte dråpeisolasjonsteknikker.
I den første protokollen, er gjærceller omdannet til sfæroplaster ved enzymatisk fordøyelse av celleveggene. De resulterende sfæroplaster blir deretter gently lysert i en løstsittende homogenisator. Ficoll tilsettes til lysatet for å tilveiebringe en densitets-gradient, og blandingen ble sentrifugert tre ganger. Etter den første sentrifugering, blir lipid dråper lokalisert til hvitfarget flytende sjikt av sentrifugerør sammen med det endoplasmatiske retikulum (ER), plasmamembranen, og vakuoler. To påfølgende spinn brukes til å fjerne disse tre andre organeller. Resultatet er et lag som bare har små dråper og bundne proteiner.
I den andre protokollen, placental villous celler isoleres fra humant sikt placentas ved enzymatisk spalting med trypsin og DNase I. Cellene ble homogenisert i en løstsittende homogenisator. Lav hastighet og middels hastighet sentrifuge trinn brukes til å fjerne ubrutt celler, cellerester, atomkjerner, og mitokondrier. Sukrose blir tilsatt til homogenatet til å tilveiebringe en densitets-gradient, og blandingen sentrifugeres for å separere lipid-dråper fra den andre mobilnettetr fraksjoner.
Renheten av de lipid-dråper i begge protokoller blir bekreftet ved Western Blot analyse. Den dråpe fraksjoner fra begge preps er egnet for etterfølgende proteomikk og lipidomiske analyse.
Introduction
Cellular lipid dråper er dynamiske organeller som viser flere funksjoner i cellene. De er lagrings nav for nøytrale lipider, som kan konverteres til energi eller brukes for fosfolipidsyntese. Dråpene spille sentrale roller i fysiologiske og patologiske tilstander, inkludert aterosklerose, fedme og relaterte metabolske sykdommer, og også smittsomme sykdommer 1,2. I tillegg er de interessante kilder for biodieseldrivstoff.
Mye informasjon om de cellulære roller lipid dråper er innhentet fra proteomikk og lipidomiske analyse av dråper renset fra vidtrekkende organismer 3. Disse organismene har tatt bakterier 4,5, gjær 6-11, planter 12,13, nematoder 14, og flyr 15,16. På grunn av interessen for rollen til lipid dråper i humane metabolske sykdommer, har dråpene også blitt isolert fra dyrkede dyreceller og enNimal vev. Dyrkede cellelinjer har tatt 3T3-L1 celler 17, kinesisk hamster eggstokk (CHO) K2 celler 18, menneskelige hepatocyes 19,20, og epiteliale cellelinjer 21. Animalsk vev fra hvilke dråper har vært isolert har inkludert mus skjelettmuskulaturen 22, lever-23, og brystkjertlene 23. Som nevnt ovenfor, er målet for de fleste dråpe isolasjon studier for å utføre proteomikk analyser på de bundne faktorer og lipidomiske analyse på den nøytrale og fosfolipider.
Siden nøytrale lipider - den mest tallrike komponent av lipid dråper - er mindre tett enn de fleste andre cellulære materialer, og isolering av dråper tradisjonelt blitt utført ved hjelp av tetthetsgradient-sentrifugering. At teknikken er midtpunktet i begge forbereder presenteres her. Tidligere teknikker 6,24 kombineres og modifiseres på en visuell presentasjon av isolering av dråper fra dyrkede fisjonsgjærcelleneog noncultured menneskelige celler hentet fra placenta vev. Målet er å vise den brede anvendelsen av denne teknikken ved å velge to vidt forskjellige celletyper som startpunkter for dråpe isolasjon. Denne teknikken bør være nyttig for de som ønsker å isolere dråper fra de fleste organismer.
Protokoll 1 beskriver isolering av lipid-dråper fra fisjons gjær, Schizosaccharomyces pombe, som har blitt benyttet som en modell for å observere dråpedannelse under eukaryot celledelingen 25.. Den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae har blitt brukt mye som modellorganisme for å studere oljedråpe biologi. Protokoll 1 er gjeldende for både organismer og forskjeller i forberedelsene er uthevet.
Protokoll 2 beskriver isolering av lipid-dråper fra placenta villous celler, som er i sin tur oppnådd fra human sikt placentas. Densamling av begrepet placentas gir en unik mulighet til trygt og etisk få 200-250 g lett tilgjengelig menneskelig vev 26, som inneholder betydelige mengder lipid dråper. Dette er i motsetning til de fleste oljedråpe isoleringsarbeidet i høyere eukaryoter, hvor dråpene kommer fra dyrkede celler. I disse studiene, blir fettsyrene ofte tilsatt til kulturen for å fremme syntesen av nøytrale lipider og dermed vekst av små dråper. Dette er i motsetning til det arbeide her, hvor lipid-dråper blir dannet i henhold til opprinnelige betingelser i placenta-vev.
Renheter av lipid dråpe fraksjoner bestemmes av Western Blot analyse ved hjelp av organelle markør antistoffer. Disse to protokollene vil gi oljedråpe fraksjoner som er egnet for senere proteomikk og lipidomiske analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Isolere lipid dråper fra (fisjon) gjærceller
Isolering av dråper fra den populære modellorganisme spirende gjær Saccharomyces cerevisiae er nesten identisk med følgende protokoll seks. Forskjeller i forberedelsene er notert.
En. Økende gjærceller
- Klargjør media. Kombiner 36 g YE5S pulver per liter dH 2 O i glassflasker eller kulturflasker. Om to L av media vil være nødvendig. Autoklaveres mediet ved 121 ° C i 20 min. Tillat media for å avkjøles til romtemperatur. For S. cerevisiae erstatte YE5S med YPD.
- Plasser 10 til 20 ml av den avkjølte YE5S mediet i en 250 ml kultur kolbe ved hjelp av sterile teknikker. Inokuler mediet med en liten mengde gjær-celler fra en agar-plate ved hjelp av en steril trepinne eller tilsvarende. La cellene vokse til den ønskede optiske tetthet ved 30 ° C. Måle den optiske tetthet ved enbølgelengde på 595 nm ved hjelp av et spektrofotometer.
- Plasser de resterende mediene i 2,8 L flasker. Bruk ikke mer enn 1 liter medium per 2,8 L kolbe for å sikre riktig blanding i løpet av celleveksten i risteinkubator. Den endelige utbytte av våte celler bør være ca 10 g for å være i stand til å tilegne seg nok lipid dråper for proteomikk og lipidomiske analyse.
- Introduser cellene fra trinn 1,2 til 2,8 l kolber som hver har en L av media som ble utarbeidet i trinn 1.1.
- Dyrke cellene til den ønskede densitet ved 30 ° C.
- Sørg for at cellene har lipid dråper. Reserve 1 ml av cellene. Måle den optiske tetthet (OD) av prøven. Til 0,1 ml av en 100 mM stam av BODIPY 493/503 i etanol per OD av celler til prøven. Plasser 3 mL av prøven mellom et glass lysbilde og et glass dekkglass. Visual under et fluorescerende mikroskop med en GFP filter (figur 1A).
- Pellet cellene fra trinn 1,5 på 4 & #176, C ved 3800 x g i 10 min. Arbeid i grupper avhengig av kapasiteten på sentrifugerør.
- Hell av de YE5S media og vaske cellene med en buffer på EMM + 600 mM sorbitol. Sorbitol gir osmotisk støtte.
- Overfør cellene til et sterilt 50 ml sentrifugerør og pelletere cellene ved 4 ° C ved 2000 x g i 10 min. Fjern supernatanten. Veie våte celler. Resuspender cellene i 2 ml (EMM + 600 mM sorbitol) buffer per gram av celler.
2. Konvertering fisjonsgjærceller i sfæroplaster og påfølgende lysis
- Tilsett 5 mg hver av 1) gjær-lytisk enzym og 2) gjær lyse enzymer fra Trichoderma harzianum per gram våte celler som ble veid i trinn 1.9. For S. cerevisiae forsterke disse enzymene med den samme mengde av Zymolyase.
- Inkuber cellene ved 30 ° C under forsiktig rysting ved 100 rpm i 60 min.
- Sjekk for å være sikker på at de sfæroplaster har lipid droplets. Ved å gjenta trinn 1,6 (Figur 1B).
Tre. Tetthetsgradient-sentrifuge
- Pellet sfæroplaster ved sentrifugering ved 4 ° C ved 2000 x g i 5 min.
- Fjern forsiktig supernatanten med en plast overføring pipette.
- Forsiktig resuspendere pelleted sfæroplaster med iskald 10 mM Tris-HCl, 600 mM sorbitol, og 200 mM EDTA. Husk at de sfæroplaster er svært skjøre.
- Pellet sfæroplaster igjen med de samme innstillingene som i trinn 3.1. Fjern forsiktig supernatanten og resuspender sfæroplaster ved hjelp av en plast overføringspipetten i 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl og 200 mM EDTA i en konsentrasjon på 2 ml / g-celler.
- Overfør de resuspenderte sfæroplaster til en glass-homogenisator og forsiktig homogen på is, 20-30 slag, med løstsittende stampe av glass homogenisator.
- Overfør lyserte sfæroplaster til sentrifugerør og overlappe med samme volume 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl og 200 mM EDTA-buffer. Velg antall sentrifugerør å bruke, slik at hvert rør er omtrent to tredjedeler full.
- Sentrifuger ved 4 ° C ved 100.000 x g i 1,5 timer i en SW28 rotor eller tilsvarende. Tillat rotor til kysten til en stopp (rotor retardasjon = 0).
- Forsiktig overføre den øverste flytende hvitt lag (figur 2A), som inneholder små dråper, i et nytt sentrifugerør (e) ved hjelp av enten en pipette eller et bøyd Pasteur pipette. Legg tilstrekkelig volum av 12% Ficoll, 10 mM Tris-HCl og 200 mM EDTA-buffer til prøven, slik at det fyller omtrent en tredjedel av sentrifugerøret.
- Til det tilsvarende volum av 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl og 200 mM EDTA-buffer til toppen av prøven (e) i den nye sentrifugerør (e). Etter tillegg av denne bufferen rørene bør være om lag to tredjedeler fulle.
- Sentrifuger ved 4 ° C ved 100.000 x g i 1 time i en SW28 rotor eller tilsvarende. Tillat rotor til kysten til en stopp (rOTOR retardasjon = 0).
- Forsiktig overføre den øverste flytende hvitt lag (figur 2B), som vil inneholde små dråper, i et nytt sentrifugerør (e) ved hjelp av enten en pipette eller et bøyd Pasteur pipette. Legg 600 mM sorbitol, 8% Ficoll, 10 mM Tris-HCl og 200 mM EDTA-buffer til prøven, slik at det fyller omtrent en tredjedel av sentrifugerøret.
- Til det tilsvarende volum av 250 mM sorbitol, 10 mM Tris-HCl og 200 mM EDTA-buffer til toppen av prøven (e) i den nye sentrifugerør (e). Etter tillegg av denne bufferen rørene bør være om lag to tredjedeler fulle.
- Sentrifuger ved 4 ° C ved 100.000 x g i 1 time i en SW28 rotor eller tilsvarende. Tillat rotor til kysten til en stopp (rotor retardasjon = 0).
- Overfør øverste hvitt lag (figur 2C), som bør inneholde bare de lipid-dråper og bundne proteiner, til dialyserør og dialyser O / N i 10 mM Tris-HCl og 200 mM EDTA-buffer for å eliminere Ficoll.
Placentas ble samlet fra friske kvinner med Singleton svangerskap gjennomgår elektiv keisersnitt levering før utbruddet av spontan arbeidskraft på sikt. Emner ga skriftlig, informert samtykke til uttak av sin morkake. Samlingen, og påfølgende bruk, av placentas ble utført med godkjenning fra University of Tennessee og University of Tennessee Graduate School of Medicine i Knoxville Institutional Review Board (# 8757B og # 3338, henholdsvis).
En. Isolere menneskelige placenta villous celler
Del 1 av protokollen er en modifikasjon av en tidligere publiserte protokollen ved Petroff et al. 26
Forbered følgende løsninger:
- NaCl (1 L) oppløses 9 g NaCl (M 58.4 g / mol) i dH 2 O for å gi en 1 L-løsning. Filter sterilisere (0,2; Mikrometer membran).
- 10x Hanks balanserte saltløsning (10x HBSS) (1 L): 4 g KCl (M 74.5 g / mol), 0,6 g KH 2 PO 4 (M 136,086 g / mol), 80 g NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol), 10 g D-glukose (M 180,16 g / mol). Oppløs hver av bestanddelene i dH 2 O for å gi en 1 L-løsning. Filter sterilisere (0,2 mikrometer membran).
- Enzym fordøyelse buffer (0,6 ml): Kombiner 70 ml 10 x HBSS med 3,3 ml 7,5% Na Biscarbonate, 17,5 ml 1 M HEPES, og 266,1 ml dH 2 O; filtersteriliser (0,2 um membran). Oppbevar ved 4 ° C.
- DNase I: like før bruk, tilsett 5 ml steril 0,9% NaCl til en ampulle med DNase. Hold på is inntil bruk eller oppbevar ved -20 ° C.
- Forbereder placenta for disseksjon
- Skaff et humant placenta-og prosess som i nærheten av leveringstidspunktet som mulig. Bruk en forseglet beholder slik som en kjøler for å transportere placenta. Utvis alltid forsiktighet når håndling humant biologisk materiale.
- I den biologiske vernedeksel, overfører placenta til en steril beholder autoklaveres, og omhyggelig vask blod fra placenta og membraner ved hjelp av steril 0,9% NaCl (saltoppløsning) oppløsning. Kast blodig saltvann i en L begeret som flytende biologisk avfall.
- Plasser placenta på et sterilt område, med den glatte overflaten som bærer navlestreng vendt opp. Med skarpe, fine-punkts saks og pinsett fjerne fosterhinnene og navlestreng.
- Vend morkaken over slik at morens overflate (ru overflate) vender opp. Fjern det overliggende basalplaten vev, ca 3 mm fra overflaten.
- Dissekere morkaken
- Dissekere en cotyledon samtidig unngå chorionic plate. Samle villous vev inn i et 250 ml begerglass med saltoppløsning.
- Skyll vevet flere ganger i et separat begerglass med 0,9% NaCl ved å svinge med tang, ved hjelp av en L begerglass for flytende avfall.
- Overfør ett frøblad om gangen til en 150 mm petriskål. Hold med pinsett og skrape vev med barberblad fra skip på petriskål. Plasser skrapt vevet inn i separate begerglass inneholdende 0,9% NaCl. Gjenta for alle vev stykker.
- Overfør liten del av vevet til cellen dissosiasjon sil og skyll med 0,9% NaCl i stor utstrekning inntil eluatet blir klart. Gjenta for alle vev.
- Etter skylling av skrapet vev i cellen dissosiasjon sil, tøm det av overskytende væske og vekt.
På dette punktet i vevet kan lagres O / N i en steril Erlenmeyerkolbe ved 4 ° C i DMEM.
- Enzymatisk fordøyelse av morkakevevet
- Forbered vevet fermenteringsblandingen: 100 ml prewarmed enzym fortynningsbuffer, 1 ml DNase I og 20 ml 2,5% 10x trypsin.
- Del vev, overfører 60 g av totalt oppsamlet vev (vanligvis omtrent 250 til 300 g) til en 500 ml steril Erlenmeyer-kolbe.
- Samle dissosiert celler
- Etter den første 45 min dissosiasjon, setter fordøyelsen kolbe på en tilt til vev legger seg.
- Samle supernatanten, tar seg ikke å samle undissociated vev. Til en lik mengde av HBSS til det oppsamlede supernatant og overfør til sterile 15 ml sentrifugerør. For ytterligere deler av undissociated vev, gjenta prosedyren fra trinn 3.2 med undissociated vev.
- Sentrifuger homogenatet ved 4 ° C ved 1000 x g i 15 min.
- For hver batch, etter sentrifugering, suge supernatanten uten å forstyrre pelleten. Den placentale villous cellene er hovedsakelig i den hvite delen av pelleten, ligger over de røde blodlegemer.
- Overfør villous celler (hvite delen av pellet) til en sterile 50 ml konisk sentrifugerør og holde på is.
- Etter oppsamling av cellene fra alle tre nedbrytnings stadier, filtrerer suspensjonen ved hjelp av en 100 pm nylon celle sil inn i toppen av et sterilt 50 ml konisk sentrifugerør. Ved filtrering av cellesuspensjonen avtar, løftes oppover på filteret for å trekke et vakuum i røret.
- Sentrifuger ved 4 ° C ved 1000 x g i 10 min. Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten.
2. Homogenisere placenta villous celler
- Før man starter med isoleringsprosessen klar 50 ml Hypoton Lysis Medium (HLM) inneholdende 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 og 1 mM EDTA. Legg proteasehemmere til HLM like før bruk og oppbevar den medium på is.
- I den biologiske vernedeksel, tilsett 4 ganger cellepelleten volum av iskald HLM til cellene. Forsiktig og grundig resuspender cellene ved pipettering av celler opp-and-ned ved hjelp av en 10 ml pipette.
- Inkuber de suspenderte cellene på is i 10 minutter.
- Overfør cellene til Douce-homogenisator, som skal være på is. Sakte homogen cellene ved å bruke 20-25 milde slag med løstsittende stampe i homogenisatoren.
- Sentrifuger cellelysat ved 4 ° C ved 3000 x g i 10 min for å fjerne ubrutte celler, cellerester og kjerner.
- Samle supernatanten og overføre til en SW28-rør (eller alternativt som kan bli sentrifugert ved 25.000 xg). Sentrifuger ved 4 ° C ved 25.000 x g i 20 min for å fjerne mitokondriene.
Tre. Isolere lipid dråper etter ultracentrifugation
- Forbered 50 ml av 100 mM natriumkarbonat (M 106 g / mol) buffer (pH 11,5) og 50 ml av 60% sukrose (vekt / vekt) oppløsning. Legg proteaseinhibitorer med natriumkarbonat-buffer rett før bruk, og å holde på is.
- Samle supernatanten fra trinn 2,6 i en 50 ml sentrifugerør, juster20% av sakkarose og overføring inn i bunnen av et ultrasentrifugerør for en SW28 rotor, eller tilsvarende. Overlay densitet justeres supernatant med ~ 10 ml is-kald 100 mM natrium-karbonat-buffer (pH 11,5) og 0,5-1 ml iskald HLM for å fylle røret.
- Sentrifuger ved 4 ° C ved 130.000 xg i 45 min ved å bruke SW28 svingende spannrotor. Tillat rotor til kysten til en stopp (rotor retardasjon = 0).
- Samle det flytende sjikt, juster til 10% sukrose og overføre inn i bunnen av en 13,2 ml ultrasentrifugerør for en SW41Ti rotor, eller tilsvarende. Overlay densitet justeres supernatant med omtrent 5 ml iskald 100 mM natrium-karbonat-buffer (pH 11,5) og 0,5 ml av iskald HLM.
- Sentrifuger ved 4 ° C ved 274.000 xg i 60 min ved å bruke SW41Ti svingende spannrotor. Tillat rotoren til kysten til en stopper (rotor retardasjon = 0) for å minimere forstyrrelse av oljedråpe-laget.
- Samle forsiktig toppen flytende lag (figur 2D) som inneholderlipid dråper med en 1 ml pipette og gjenta trinn 3.4.
- Sentrifuger ved 4 ° C ved 274.000 xg i 30 min ved å bruke SW41Ti svingende spannrotor. Tillat rotor til kysten til en stopp (rotor retardasjon = 0).
- Samle forsiktig den øverste hvite-farget flytende lag som inneholder lipid dråper med en bøyd Pasteur pipette i tre 1,5 ml rør som inneholder 100 mL HLM.
Karakterisering av lipid dråper fraksjon (Protocols 1 og 2)
Den utvinning og renhet av oljedråpe fraksjonen kan verifiseres ved Western Blot kombinert med lys-eller elektronmikroskopi. I tillegg kan forskjellige alikvoter etter sentrifugeringsfremgangsmåten samles og oppbevares for bestemmelse av renseeffekt. I Western Blotting, er det mer hensiktsmessig å sammenligne et volum av oljedråpe fraksjonen som representerer en ekvivalent av hele cellelysat enn å sammenligne lipid dråper til andre membranfraksjoner på tHan basis av den totale proteininnhold 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dersom tetthetsgradient-sentrifugering virket som forventet, bør det flytende lag inneholder lipid dråper og bli tømt fra andre organeller i hele utviklingen av høyhastighets-spinn.
For protokoll 1, ble Western avsetninger utført med markør antistoffer mot lipid dråper (Erg6p), og organeller som har blitt funnet å samhandle med lipid dråper i gjær, ER (Dpm1p), mitokondrier (Por1p), plasma membran (Pma1p), og vacuoles (Vma1p).
Like volumer av det flytende lag av hver tre spinn (trinn 3.7, 3.10, og 3.13), ble oppsamlet, utfelt med trikloreddiksyre (15% endelig konsentrasjon), og solubilisert i vann. 13 ml av cellelysat (figur 3A, "Lys") og protein prep av hvert tre spinn (figur 3A, "Spin1", "Spin2", og "Spin3") ble separert på 12% SDS-PAGE, overført til nitrocellulose membran, og immunoblotted med organelle spesiFIC antistoffer. Som forventet, er den oljedråpe markørprotein Erg6p til stede i det flytende sjikt etter hver av de tre spinn (figur 3A); Por1p ikke er tilstede i det flytende lag etter Spin1 (fig. 3A); Vma1p er oppbrukt fra den flytende lag etter Spin2 (figur 3A), og Dpm1p og Pma1p ikke er til stede i den flytende lag etter Spin3 (figur 3A).
For protokoll 2, var tilstedeværelsen av lipid dråper isolert fra menneskelig sikt placenta villous celler verifisert ved farging med et nøytralt lipid spesifikk fluorescens fargestoff, BODIPY 493/503. Dråpene ble deretter visualisert under et fluorescens-mikroskop (figur 3B). Renheten av de isolerte lipid dråpe fraksjoner ble evaluert ved Western Blotting med markørproteiner for lipid dråper (perilipin 2), ER (calnexin), Golgi (GM130), mitokondrier (COX IV) og plasmamembran (MEK1) (figur 3C). Den lipid droplets ble de-lipidated med kald aceton og proteinene ble hentet. Lik prosentandeler av post-atom supernatant (PNS), fraksjonen under det flytende lag av den siste sentrifugering (trinn 3.6, "Spin4" på figur 3C), den etterfølgende vasketrinn (trinn 3.8, "Spin5" på figur 3C), og de-lipidated protein prep av flytende oljedråpe lag (trinn 3.8, "LD" på figur 3C) ble separert på 12% SDS-PAGE, overført og immunoblotted med angitt antistoffer. Perilipin 2 (også kjent som ADRP), lipid dråpe protein ble påvist i post-atom supernatanten og i det isolerte hvite flytende lag som inneholder lipid-dråper. Proteiner spesifikke for plasma membran (MEK1) og Golgi (GM130) ble ikke oppdaget i oljedråpe fraksjoner i enten laget under den flytende lag for Spin4 og Spin5. Som tidligere rapportert, har ER protein calnexin 18,27,28 og en svak farging av mitokondriemembranen protein COX IV vært detected andre steder i oljedråpe brøkdel 22. Disse resultatene er i samsvar med tidligere rapporter som viser at lipid dråper samhandle med mitokondrier i pattedyrceller 29 og med ER 30,31.
Figur 1. Cellular lipid dråper i fisjonsgjærceller. (A) Bright-feltet (BF) og bredt felt fluorescens (Fluor.) bilder av seks representative fisjonsgjærceller der lipid dråper er farget med BODIPY 493/503. (B) Bright-feltet (BF ) og bredt felt fluorescens (Fluor.) bilder av en representant spheroplast der lipid dråper er farget med BODIPY 493/503. Scale barer er 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon of denne figur.
Figur 2. Flytende lag etter tetthetsgradient-sentrifugering. Sentrifugerør etter (A) Spin1 (trinn 3,8), (B) Spin2 (trinn 3.11), og (C) Spin3 (trinn 3.14) protokoll 1. (D) Sentrifugerør etter Spin4 (trinn 3.6) protokoll 2. De flytende lag som inneholder lipid dråper er angitt ved piler.
Figur 3. Analyse av renhet av de isolerte lipid dråper. (A) Western avsetninger av viktige skritt i protokoll 1. Like volumer av hvert protein prep (Spin1 - trinn 3.7, Spin2 - trinn 3.10, og Spi n3 - steg 3,13) ble separert ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose membraner, og immunoblotted med antistoffer for Erg6p (LD, lipid dråper), Dpm1p (ER), Por1p (MT, mitokondrier), Pma1p (PM, plasma membran), og Vma1p (vakuoler). (B) Fase kontrast (PC) og bredt felt fluorescens (Fluor.) bilder av BODIPY 493/503-stained lipid dråper som har vært isolert fra menneskelige placenta villous celler. (C) vestlige blotter av viktige skritt i protokoll 2. Lik prosent pf PNS (post atom supernatant), supernatant under den flytende lag etter siste spinn (Spin4 - trinn 3,6), etterfølgende vask (Spin5 - steg 3,8) ble, og flytende lag (LD) atskilt med SDS-Page, overføres til membraner og immunoblotted med antistoffer for perilipin 2 (LD, lipid dråper), calnexin (ER), GM130 (Golgi matrix protein, Golgi), COX IV (cytokrom c oksidase, MT, mitokondrier), og MEK1 (MAPK kinase, PM, plasma membran).ad/50981/50981fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinnene i denne protokollen
Sørg for å være i samsvar med media og celletetthet under vekst av dyrkede celler. Cellular lipid dråper er unike i at deres assosierte proteiner er svært avhengig av miljøet der cellene dyrkes 17. Derfor bør mediet hvor cellene er dyrket og tettheten av cellene overvåkes nøye før lysering.
Proteinet sammensetningen av lipid dråper er en funksjon av vekstfasen av gjærcellene. Færre proteiner vil være bundet til dråpene i loggen vekstfase versus stasjonær fase. Også spheroplasting virkningsgrad er en funksjon av vekstfasen av gjærcellene. Celler i logaritmisk vekstfase vil ha høyere utbytter av sfæroplaster enn celler i stasjonær fase, fordi de sistnevnte er mer motstandsdyktige mot enzymatisk behandling.
telt ">Sørg for å bruke milde teknikker for å bryte åpne cellene. Teknikker som bryter ned gjærcelleveggen ved enzymatisk fordøyelse er foretrukket over teknikker som revne celleveggen gjennom anvendt kraft. Den sistnevnte metoden kan forstyrre den strukturelle integriteten til dråpene som resulterer i tap av bundne proteiner eller lipider.
Unngå å fryse prøver etter at cellene er lysert. Fryse dråper anbefales ikke fordi det kan påvirke deres strukturell integritet som resulterer i tap av bundet protein eller lipider. Frysing kan også føre dråpene til sikring eller fragment 24. Dette kan være særlig aktuelt ettersom dråpene har blitt observert å fragmentere eller gjennomgå fisjon i levende gjærceller 25 og dermed nedbryting av større dråper inn i mindre er mulig. Deler av dråper som fragment ikke kan ha oppdriften skal vises i floating sjikt under tetthetsgradient-sentrifugering. Dette kan kunstig redusere antallet dråpe faktorer som vil bli identifisert ved denne teknikk, siden proteinsammensetningen i dråpeoverflater kan være en funksjon av dråpestørrelsen 32.
Sørg for å teste lokalisering av lipid dråpe tilknyttet faktorer å lipid dråper. Ett av karakteristikkene av lipid dråper er at de samhandler med andre organeller 33-37. Derfor er faktorer fra disse organeller som ofte finnes i oljedråpe-fraksjon. Derfor er det viktig å bruke flere teknikker for å sikre at disse faktorene lokalisere til dråpene. Studier med en fluoriserende fusjonsprotein koblet til proteinet av interesse i celler hvor lipid dråper er farget med en annen fluoriserende fargestoff bør benyttes for å bestemme graden av colocalization 15.. Teknikker slik som protein pr korrelasjonofiling kan brukes for ytterligere å kvantifisere renhet av oljedråpe fraksjon 15.. I denne strategien, er to komponenter hver merket med forskjellige isotop-inneholdende aminosyrer. Den første komponenten er en kjent oljedråpe-faktor, og den andre komponenten er den fraksjonen som blir analysert. Sammenligninger gjøres deretter mellom de fraksjonerte plasseringen av de to komponenter.
Modifikasjoner og feilsøking
Modifikasjoner protokoll 1 for å isolere lipid dråper fra den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae er notert. Merk at størrelsene på lipid dråper kan variere sterkt. Tetthetsgradient-sentrifugering hastigheter kan måtte økes for mindre dråper til å akkumulere i den flytende sjikt.
Begrensninger av teknikken
Tilgang til en ultrasentrifuge med somwinging bøtte rotor er avgjørende for isolering av cellulære lipid dråper. Selv om denne del av utstyret er standard i de fleste cellebiologi og biokjemi laboratorier, er det dyrt.
Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende metoder og andre alternative fremgangsmåter
Som nevnt ovenfor, blir protokollen en tett basert på arbeidet til Leber et al. Del 6 og en protokoll 2 er en modifikasjon av en tidligere publiserte protokoll av Petroff et al. 26.
Søknader
Lipid dråpe isolasjon er mest nyttig for påfølgende proteomikk og lipidomiske analyse av bundne proteiner, nøytrale lipider og fosfolipider. Lager av lipid dråpe assosiert proteiner og lipider er utarbeidet 4,6-17,19,20,22,23,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association award 13SDG14500046 til PD, en Sustainable Energy Education & Research Center Award (Univ. of Tennessee) til PD, og av Physicians 'Medical Education and Research Foundation (Univ. of Tennessee) award til JM Forfatterne takker Caroline Leplante (Yale Univ..) for protokollen for å konvertere fisjon gjær til sfæroplaster, Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) for bruk av hans risting inkubatorer, bordsentrifuge, og Western Blot analyse utstyr, og Senter for Miljø Bioteknologi (Univ. Tennessee) for bruken av sin ultra-sentrifuger, Günther Daum for gjær antistoffer (Graz Univ. of Technology, Østerrike.), personalet på avdelingen for obstetrikk og gynekologi (Univ. Tennessee Medical Center) for teknisk assistanse .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
References
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
