Summary
אנו מתארים הליך בשלבים ליצירת עומס יתר לחץ והיפרטרופיה של חדר שמאלי בחולדות Wistar ידי התכווצות של אב העורקים עולים באמצעות קליפ מתכתי קטן. דגם זה נעשה שימוש נרחב ללימוד שינויי שיפוץ במהלך היפרטרופיה לבבית ולזיהוי והערכה של אסטרטגיות לנסיגה של שינויים כאלה.
Abstract
עולה התכווצות של אב העורקים הוא המודל כירורגית השכיח והמוצלח ביותר ליצירת עומס יתר לחץ המושרה היפרטרופיה של הלב ואי ספיקת לב. כאן אנו מתארים הליך כירורגי מפורט ליצירת עומס יתר לחץ והיפרטרופיה לבבית בחולדות על ידי התכווצות של אב העורקים עולים באמצעות קליפ מתכתי קטן. לאחר הרדמה, קנה הנשימה היא מחוברת לצינורות על ידי החדרת צינורית דרך חתך חצי דרך בין שתי טבעות סחוס של קנה הנשימה. לאחר מכן חתך בעור הוא עשה ברמה של מרחב הצלע השני על בית החזה מהשמאל ושכבות שרירים נמחקות כדי לאתר את החלק העולה של אב העורקים. אב העורקים עולים הוא מכווץ כדי 50-60% מהקוטר המקורי שלה על ידי יישום של קליפ טיטניום בגודל קטן. בעקבות התכווצות של אב העורקים, הצלעות השניה ושלישית נאמדו עם תפרי prolene. נשימה אחת ספונטנית הצינורית לקנה הנשימה מוסרת הוקמה מחדש. בעלי החיים מותר להתאושש on כרית החימום על ידי הפחתת הרדמה בהדרגה. האינטנסיביות של עומס יתר לחץ שנוצר על ידי התכווצות של אב העורקים עולים נקבעת על ידי הקלטת הפרש לחצים באמצעות שני דופלר-אקו ממדי טרנס בית החזה. בסך הכל פרוטוקול זה שימושי ללמוד את אירועי שיפוץ ותכונות התכווצות של הלב במהלך ההופעה ההדרגתית וההתקדמות מהיפרטרופיה לב מפוצית לבמה אי ספיקת לב.
Introduction
מודלים של בעלי חיים קטנים הם הכלי המועדף ביותר לחקר שינויים כרוניים בפיתוח של היפרטרופיה לבבית וההתקדמות שלה לאי ספיקת לב. מודלים אי ספיקת לב על ידי שיטות כירורגיות פותחו במקור בחולדות כבעלי חיים אלה הם מתאימים ביותר לניתוחי חזה פתוח, אקו והערכה של פרמטרים המודינמית. הם גם מספקים דגימות שלאחר המוות נאותים לרקמה, סלולרית ומחקרים ברמה מולקולריים 1. היצרות של אב העורקים עולים היא אחד הדגמים כירורגית השכיחים והמוצלחים ביותר ליצירת עומס יתר לחץ אי ספיקת לב 2, 3. מודל זה מתאים גם ללמוד את אירועי שיפוץ סלולארי הסלולריים ומשנה ותכונות התכווצות של הלב במהלך המעבר מהיפרטרופיה לאי ספיקת לב 4.
יתרון עיקרי של מודל זה הוא ההתחלה ההדרגתית של עומס יתר לחץ על הלב 5, </ Sup> 6. מודל זה הוא רלוונטי מבחינה קלינית בגלל ההתקדמות האיטית אך יציבה שלה מהיפרטרופיה לבבית פיצוי לשלב מפוצה וסופו של דבר לבמה אי ספיקת הלב. המשך להתקדמות של היפרטרופיה לב לאי ספיקת לב ושינויים הפיסיולוגיים הקשורים מושפע בעיקר ממידת היצרות הפיק 7. התכווצות אב העורקים עולה יכולה להתבצע בשתי דרכים, או על ידי שימוש בתפרים או על ידי יישום של קליפים מתכתיים 8, 9. היתרון העיקרי של שימוש קליפ מתכתי להתכווצות של אב העורקים הוא שההליכים כירורגיים מורכבים פחות. בשיטה זו יש לאתר את אב העורקים עולים מסתמית הנ"ל ולהכניס את הקליפ סביב אב העורקים כדי להשיג רמה רצויה של התכווצות. מפשק חזה אין צורך בהליך זה. פסים של אב העורקים על ידי תפירה דורש יותר מניפולציות כירורגית להצבת מחט מד לצד אב העורקים עולים ותפירה סביבו כדילייצר את הרמה הרצויה של התכווצות של אב העורקים. הטכניקה האחרונה היא זמן רב יותר בהשוואה לשימוש בקליפים מתכתיים להתכווצות של אב העורקים. השיטה המתוארת בסרטון זה מדגימה את ההליך הניתוחי לעולה התכווצות של אב העורקים בעכברים המאפשרת יצירה של לחץ מודל היפרטרופיה של חדר השמאלי יתר על המידה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים בוצעו לאחר קבלת אישור מוועדת האתיקה בבעלי חיים המוסדית. חולדות Wistar שוכנו תחת אפל שעות 12 למחזור אור, טמפרטורה קבועה בחדר (24 ± 2 ° C) עם אוכל ומים כרצונך (כמו לכל הנחיות CPCSEA).
1) טיפול טרום ניתוחי והרדמה
- שמור על עכברוש (משקל גוף כ 200 ג') תחת מטריית שעה 24 אנטיביוטיקה לפני הניתוח על ידי מתן דרך הפה אמוקסיצילין (מינון: 500 מ"ג / ליטר מים).
- לעקר את כל כלים כירורגיים (כמו מספריים, מלקחיים, המוליך קליפ, מחטי תפר, ובעל מחט) על ידי מעוקר ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- השתמש בכרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעלי חיים ברחבי 37 ° C כדי למנוע ירידה מהירה בקצב לב.
- תשמור על עצמך כדי למנוע התייבשות של בעלי החיים לפני ובמהלך ניתוח.
- להרדים את העכברוש בחדר אינדוקציה עם isoflurane 3% מעורבבים עם0.5-1.0 ליטר / דקה 100% חמצן; לשמור על הרדמה עם isoflurane 1.5%.
- בדוק את רפלקס הדוושה כדי לאשר הרדמה מוצלחת.
2) הכנה של האתר כירורגית
- שמור את העכברוש על גבי כרית חימום בטמפרטורה מבוקרת במצב שכיבה.
- מקם גומייה על השיניים הקדמיות של החולדה כדי לשמור על בעלי החיים בעמדה, תוך שמירה על הרדמה עם חרטומו.
- הסרת פרווה מהצוואר והשארתי את אזור החזה של העכברוש (רצוי בעזרת מכונת גילוח חשמלי).
- לחטא את האתר כירורגית עם פתרון povidone-יוד ואז עם 70% אתיל אלכוהול.
- השתמש בוילון סטרילי כדי לחשוף את האתר כירורגית רק במהלך ההליך הניתוחי.
הערה: כאופציה נוספת לטיפול בבעלי החיים, 0.25% Bupivicaine מזהה (2.5 מ"ג / קילוגרם) יכול להיות משולב לפני חריטה בכל אתר חתך להרדמה / אלחוש מקומי.
3) קנו הנשימה אינטובציה בחולדה
- לעשות חתך קטן בעור במקביל לקנה הנשימה באמצעות להב כירורגי סטרילי ולהפריד בזהירות את הרקמה הבסיסית במטרה לחשוף את קנה הנשימה.
- החל עניבה של 4-0 חוט תפר משי מתחת לקנה הנשימה ובעדינות להעלות את העניבה כלפי מעלה.
- לעשות חתך חצי דרך בין שתי טבעות סחוס והכנס את הצינורית לקנה הנשימה לתוך קנה הנשימה של החולדה.
- חבר הסר את הבלוטות לקנה הנשימה לנשמת מכרסמים לשמירה על קצב נשימה של 50 נשימות / דקה, נפח גאות של 1.70 מיליליטר וזמן השראה של 0.60 שניות (לעכברוש עם משקל גוף 200 ג').
4) היצרות של אב עורקים עולה
- לאחר שחש את המיקום של הצלעות עם אצבעות, לעשות חתך בעור של כ 2 סנטימטר על קיר החזה השמאלי בין הצלעות השניה ושלישית.
- הפרד את שכבת השרירים הבינה אחר שכבה ועושה חתך ארוך על 1.5 סנטימטר בין הצלעות השניה ושלישית. (טיפול צריך להיות לקחתn, כדי למנוע כל פגיעה הריאות בעת ביצוע חתך בין הצלעות)
- לחזור בו הצלעות ולאתר את החלק העולה של אב העורקים.
- הנח קליפ טיטניום בגודל קטן סביב האאורטה עולה בעזרת המוליך לפי הצרת אב העורקים ל50-60% מהקוטר המקורי.
- בעקבות ההתכווצות של אב העורקים, בקירוב את הצלעות השניה ושלישית עם 3.0 prolene בדפוס תפר קטע. במקביל, להשהות את מכונת ההנשמה למשך כ 2-4 שניות כדי מחדש לנפח את הריאות.
- Appose שכבות השריר עם 3.0 תפרי prolene ועור עם 4.0 תפרי משי בדפוס תפר קטע. ניתן להשתמש בם תפרים נספגים שאינם סינטטיים במקום משי לתפירת העור.
- הסר את הצינורית לקנה הנשימה מעכברוש נשימה אחת ספונטנית הוא הוקם מחדש.
- לסגור את הפתח קנה הנשימה עם 3.0 תפרי prolene ואת שכבת העור עם 4.0 תפרי משי.
- לאפשר לבעלי החיים כדי להתאושש על tהוא חימום כרית ידי הורדת ההרדמה והנשמה סייעה הנשמה בהדרגה.
- אצל בעלי חיים שליטת דמה גיל בהתאמה, לבצע הנשמה ופתיחת בית חזה ללא היצרות של אב העורקים עולים.
5) טיפול שלאחר הניתוח
- לחטא את אזור ניתוח עם פתרון povidone-יוד.
- כשיכוך כאבים שלאחר ניתוח, מזריק tramadol התוך peritoneally (משקל גוף 10 מ"ג / קילוגרם / יום) במשך שבוע 1.
- הזרק התוך peritoneally מלח רגיל סטרילי אם מופיעים סימני ההתייבשות לאחר הניתוח (כ 1 מיליליטר).
- לנהל amoxycillin דרך הפה, מעורבב עם מים לשתייה, לשבעה ימים (מינון: 500 מ"ג / ליטר מים).
- הסר את כל תפרי משי שנותרו מעור הודעה 10 ימים מניתוח תחת הרדמה משאיפת.
6) אישור על תעוקה מוצלחת של עולה אב עורקים
- בצע שני דופלר-אקו ממדי טרנס בית החזה כדי לקבוע את כוונותsity של עומס יתר לחץ המיוצר על ידי ההתכווצות של אב העורקים עולים.
- להרדים את חולדות שבוע אחד לאחר ניתוח כפי שתואר קודם לכן (שלב 1.5)
- מניחים את מתמר אולטרסאונד במיקום של עצם החזה לעיל כדי להקליט את מפל לחץ על פני החלק המכווץ של אב העורקים עולים.
הערה: חולדות עם שיפוע לחץ של כ -60 מ"מ של כספית באתר המכווץ אב העורקים יהיו לפתח היפרטרופיה לבבית חמורה בכ 8-10 שבועות לאחר ניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסויים שלנו שאנחנו מסוגלים להשיג שיעורי הישרדות יותר מ -80%. היעילות של התכווצות אב העורקים אושרה על ידי ביצוע אקו דופלר. חולדות (n = 6) עם שיפוע לחץ של כ -60 מ"מ של כספית באתר המכווץ אב העורקים נצפו במשך 8 שבועות והקריב כדי לנתח לפיתוח של היפרטרופיה לבבית (איור 1). לאחר 8 שבועות הערכת אקו לאחר הניתוח גילתה גידול משמעותי בפרמטרים של חדר שמאל כגון עובי מחיצה הבינה חדרית השאר, עובי קיר חדר שמאלי אחורי וירידה בקוטר הפנימי של חדר שמאל במדינת דיאסטולי, בבעלי חיים שעברו התכווצות של אב העורקים, בהשוואה לדמה פעל פקדים (טבלה 1, איור 2). גידול משמעותי ביחסי לב משקל / משקל גוף ויחס משקל של חדר שמאלי במשקל / גוף נצפה בחולדות עם התכווצות של אב העורקים (טבלה 2, איור 3). נתונים אלהמראים כי חולדות 8 שבועות שלאחר ניתוח עם התכווצות של אב העורקים לפתח רמה משמעותית של היפרטרופיה לבבית, בהשוואה לדמה פעלו בקרות.
איור 1. אקו בחולדות המייצגות את מפל לחץ על פני אב העורקים עולים. Aa) אקו הנציג מעכברוש עם היצרות של אב העורקים ויש פרש לחצים של 63.0 מ"מ של כספית וAb מייצג הד דופלר הצבע של האתר על פני אב העורקים שבו שיפוע לחץ נמדד. Ba) אקו הנציג מאחיזת עיניים המופעל על שליטה עכברוש שיש פרש לחצים של 2.86 מ"מ של כספית וBb מייצג הד דופלר הצבע של האתר על פני אב העורקים שבו שיפוע הלחץ היה מידה ד. עלייה בשיפוע לחץ זה מצביעה על פסים מוצלחים של אב העורקים בחולדות שעברו התכווצות אב העורקים עולים חלקית.
. איור 2 אקוקרדיוגרמה M-המצב של החדר השמאלי בחולדות עם התכווצות של אב העורקים () ושליטה חולדות (ב ') המתארות את ממדי חדר שמאלי בזמן ההקרבה 8 שבועות לאחר ניתוח IVST = עובי מחיצה הבינה חדרית היתר.; LVPWT = עובי קיר האחורי של חדר שמאלי; LVID = קוטר פנימי של חדר שמאלי בדיאסטולה. בחולדות עם התכווצות של אב העורקים גידול משמעותי בעובי מחיצה הבינה חדרית היתר, ניתן לראות עובי קיר אחורי של חדר השמאלי וירידה בקוטר הפנימי של חדר שמאל במדינה הדיאסטולי.
איור 3. תמונות של הלבבות שלמים של חולדה שעברו התכווצות של אב העורקים () ודמה פעל חולדה שליטה (ב) 8 שבועות שלאחר ניתוח. העכברוש עם התכווצות של אב העורקים יש היפרטרופיה לבבית משמעותית בהשוואה לאחיזת עיניים המופעלות על שליטה.
טבלה 1 פרמטרים אקו של חדר השמאלי של הלב בעת ההקרבה, שלאחר ניתוח IVST = עובי המחיצה הבין חדרית M-mode 8 שבועות היתר..; LVPWT = עובי קיר האחורי של חדר שמאלי; LVID = קוטר חדר שמאלי פנימי במדינת דיאסטולי; AAC = עולה התכווצות של אב העורקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר דגמים כירורגית לאינדוקציה של עומס יתר לחץ כמו גם היפרטרופיה של הלב ואי ספיקת לב. בבעלי חיים קטנים, Lorell ועמיתיו פיתחו את המודל שתארנו כאן, והם דיווחו על ההתרחשות של היפרטרופיה לב מפוצית 8 שבועות פסים של אב העורקים לאחר 5. שינויי לב להתקדם בהדרגה למצב מפוצה ולאחר מכן לגרום לאי ספיקת לב. היתרון העיקרי של מודל זה הוא ההתחלה ההדרגתית של עלייה בלחץ בחדר שמאל ובכך דומה למצבים קליניים בלחץ דם כרוני. זה גם מודל חיה מתאים ללימוד אי ספיקת לב עזבה קשורים ריאתי יתר לחץ דם 10.
מודלים אחרים של בעלי חיים לאי ספיקת לב עומס לחץ, כגון חולדות דאל רגישות, ספונטני חולדות עם יתר לחץ דם וחולדות עם היצרות של אב העורקים בבטן, גם לפתח עומס יתר לחץ כרוני. הם, לעומת זאת, לוקחים פרקי זמן ממושכים לf התקדמותהיפרטרופיה לבבית rom לאי ספיקת לב. עלות התחזוקה של חולדות ניסוי ולכן הוא גם גבוהה יותר 1. deAlmeida ועמיתים מועסקים התכווצות אב העורקים רוחבית גרימת היפרטרופיה של חדר שמאלי בעכברי 11. הטכניקה כרוכה sternotomy והכחשה של עצם החזה חציון, ולכן היא יותר מאתגר.
להבטיח שינוי מהיר של הרדמה מחרטומו לקנה נשימת אינטובציה לפני פתיחת בית החזה ומאינטובציה לקנה הנשימה לחרטום לאחר ההליכים האופרטיביים. שיטה חלופית לאינטובציה לקנה הנשימה של חולדות היא באמצעות צינור פוליאתילן לאינטובציה endotracheal במקום הנשמה. עם זאת, טכניקה זו דורשת מיומנות מספקת. יש להקפיד להימנע מכל פגיעה לריאות בעת ביצוע חתך בין הצלעות. יישום של קליפים טיטניום מספיק כדי לייצר התכווצות אב העורקים קריטית למתח של חדר שמאלי, אך לא חמור מספיק כדי לייצר כישלון של חדר השמאלי חריף ו-pבצקת ulmonary. שימוש בתפרי prolene לקירוב הצלעות הוא קריטי להתאוששות מוצלחת של בעלי החיים. במהלך קירוב הצלעות, להשהות את מכונת ההנשמה למשך כ 2-4 שניות כדי מחדש לנפח את הריאות.
היו לנו רק 20% תמותה ניתוחית בבעלי החיים ולא היו סיבוכים שלאחר ניתוח. הטכניקה שתארנו כאן היא אפוא כלי יעיל ומתאים ללימוד כרוני שינויי פתיו פיסיולוגיות בהיפרטרופיה של הלב ואי ספיקת לב מתקדמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים מחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו לתמיכה כספית של הפרויקט הזה. Ajith קומאר GS נתמכה במענק מחקר בכיר ממועצה למחקר המדעי ותעשייתי, ממשלת הודו וBinil ראג' עם עמית מחקר בכיר מהמועצה ההודית למחקר רפואי, ממשלת הודו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
