Summary
Мы описываем процедуру поэтапного создания перегрузки давления и гипертрофию левого желудочка у крыс Вистар сужением восходящей аорты с помощью небольшого металлического клип. Эта модель широко используется для изучения изменений ремоделирования во гипертрофии сердца и для выявления и оценки стратегий для регрессии таких изменений.
Abstract
Возрастанию сужением аорты является наиболее распространенным и успешным хирургическое модель для создания перегрузки давления, индуцированного гипертрофию сердца и сердечной недостаточности. Здесь мы описываем подробный хирургическую процедуру для создания перегрузки давления и гипертрофию сердца у крыс сужения восходящей аорты с помощью небольшого металлического клип. После анестезии, трахея интубируют, вставив канюли через полпути разрез, сделанный между двумя хрящевых колец трахеи. Тогда разрез кожи производится на уровне второго межреберья на левом грудной стенки и мышечный слои удаляются, чтобы найти возрастанию часть аорты. Восходящей аорты сжимается до 50-60% от ее первоначальной диаметром путем применения небольшой клип размера титана. После сужением аорты, второй и третий ребра аппроксимированы PROLENE швов. Была восстановлена трахеи канюли сняты, как только спонтанное дыхание. Животное разрешено восстановить Oп грелку путем постепенного снижения анестезии. Интенсивность перегрузки давления, создаваемого сужения восходящей аорты определяется путем регистрации градиента давления с использованием транс-грудной двухмерную Допплер-эхокардиография. Общая этот протокол полезно изучить ремоделирования события и сократительные свойства сердца во время постепенного возникновения и прогрессирования от компенсированной гипертрофии сердца к сердцу стадии разрушения.
Introduction
Небольшие животные модели являются наиболее предпочтительными инструментами для изучения хронических изменений в развитии гипертрофии сердца и его прогрессирования сердечной недостаточности. Модели Сердечная недостаточность хирургическими методами первоначально были разработаны в крысах, как эти животные являются наиболее подходящими для открытой грудной хирургических процедур, эхокардиография и оценки параметров гемодинамики. Они также обеспечивают соответствующие пробы Post Mortem для ткани, клеточном и исследований на молекулярном уровне 1. Сужение восходящей аорты является одним из наиболее распространенных и успешных хирургических моделей для создания перегрузки давления сердечной недостаточности 2, 3. Эта модель хорошо подходит для изучения клеточных и субклеточных ремоделирования события и сократительные свойства сердца во время перехода от гипертрофии сердечной недостаточности 4.
Основным преимуществом этой модели является постепенное начало перегрузки давления на сердце 5, </ Ужинать> 6. Эта модель является клинически значимым из-за его медленный, но неуклонный прогрессии от компенсированной гипертрофии сердца к декомпенсации фазе и, наконец, на сцену сердечной недостаточности. Продолжительность прогрессирования гипертрофии сердца к сердечной недостаточности и связанных с физиологическими изменениями в основном зависит от степени стеноза производится 7. Восходящей аорты сужение может быть выполнена в двух направлениях, либо с помощью швов или путем применения металлических зажимов 8, 9. Основное преимущество использования металлический зажим для сужением аорты является то, что хирургические процедуры являются менее сложными. В этом способе нужно найти выше клапанную восходящую часть дуги аорты и вставить зажим вокруг аорты, чтобы получить желаемый уровень сужения. Грудь втягивающее не надо в этой процедуре. Аорты диапазонов наложением швов требует больше хирургические манипуляции для размещения иглы рядом с восходящей аорты и ушивание вокруг него, чтобыпроизвести желаемый уровень сужением аорты. Последний метод является более трудоемким по сравнению с использованием металлических зажимов для сужением аорты. Метод, описанный в этом видео демонстрируются хирургическую процедуру для восходящей аорты сужение у крыс, что позволяет создавать давление перегруженный гипертрофии модель левого желудочка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных были проведены после получения одобрения от Комитета по Институциональные животных этике. Крысы линии Вистар были размещены под 12 ч темноты к свету цикла, постоянное комнатной температуре (24 ± 2 ° С) с пищей и воде (в соответствии с руководящими принципами CPCSEA).
1) Предоперационная Уход и Анестезия
- Хранить крысы (примерно 200 г массы тела) при антибактериальной зонтик 24 ч до операции путем введения перорально амоксициллин (доза: 500 мг / л воды).
- Стерилизовать все хирургические инструменты (например, ножницы, щипцы, клип аппликатора, шовных иглы и иглодержатель) в автоклаве при температуре 121 ° С в течение 15 мин.
- Используйте грелку для поддержания температуры тела животных вокруг 37 ° С, чтобы избежать быстрое уменьшение частоты сердечных сокращений.
- Позаботьтесь, чтобы избежать обезвоживания животного до и во время операции.
- Обезболить крысу в индукционной камере с 3% изофлуран в смеси с0,5-1,0 л / мин 100% кислородом; поддержания анестезии с 1,5% изофлуран.
- Проверьте педали рефлекс для подтверждения успешного анестезии.
2) Получение хирургической сайта
- Держите крысу сверху с регулируемой температурой грелку в положении лежа на спине.
- Установите резиновую ленту над передними зубами крысы держать животное в положении, сохраняя при этом анестезии с носовым обтекателем.
- Удалить мех от шеи и левой груди область крысы (предпочтительно с использованием электробритвы).
- Лечить хирургическое место повидоном-йода, а затем с 70% этилового спирта.
- Используйте стерильную салфетку, чтобы выставить только место операции во время оперативного вмешательства.
Примечание: В качестве дополнительной опции для ухода за животными, 0,25% бупивакаина ID (2,5 мг / кг) могут быть включены до надрезание на каждом разреза для местной анестезии / анальгезии.
3) интубации трахеи у крыс
- Сделайте небольшой надрез на параллельно кожи к трахее, используя стерильные хирургические лезвия и тщательно отделить основной ткани, чтобы разоблачить трахеи.
- Нанесите галстук 4-0 шелковой нити нити под трахею и осторожно поднять галстук вверх.
- Сделайте на полпути разрез между двумя хрящевых колец и вставьте трахеи канюли в трахею крысы.
- Подключение трахеи канюли в грызуна вентилятора для поддержания дыхания 50 вдохов / мин, дыхательный объем 1,70 мл и времени вдохновение 0,60 сек (для крыс с 200 г массы тела).
4) Сужение восходящей аорты
- После определения положения ребер с пальцами, сделать разрез кожи около 2 см на левом грудной стенки между вторым и третьим ребрами.
- Отделите межреберных мышц слой за слоем и сделать надрез длиной около 1,5 см между вторым и третьим ребрами. (Уход должен быть принятьн, чтобы избежать травм в легкие, делая разрез между ребрами)
- Уберите ребра и найдите возрастанию часть аорты.
- Нанесите небольшое размера титана клип вокруг восходящей аорты с помощью аппликатора которой сжимает аорту до 50-60% от исходного диаметра.
- После сужением аорты, приблизительно во втором и третьем ребра с 3,0 проленовой в прерванного форму шва. Одновременно, пауза вентилятор около 2-4 сек для того, чтобы вновь раздувать легкие.
- Соединять мышечные слои с 3,0 PROLENE швов и кожи с 4,0 шелковыми швами в прерванного форму шва. Синтетические не являющиеся рассасывающиеся нити может быть использован вместо шелка для сшивания кожи.
- Удалить трахеи канюли от крысы, как только спонтанное дыхание восстанавливается.
- Закрыть отверстие трахеи с 3,0 PROLENE швов и скин-слоя с 4,0 шелковыми швами.
- Разрешить животное восстановить на тон грелку путем постепенного снижения анестезии и искусственной вентиляции легких искусственного дыхания.
- В подобранных по возрасту контрольных обман животных, выполните трахеотомию и торакотомии без сужения восходящей аорты.
5) Послеоперационный уход
- Лечить хирургическую область повидоном-йода.
- Как послеоперационного обезболивания, вводят трамадол внутрибрюшинно (10 мг / кг массы тела / день) в течение 1 недели.
- Введите стерильный физиологический раствор внутрибрюшинно если признаки обезвоживания появляются после операции (примерно 1 мл).
- Администрирование амоксициллин перорально, смешанный с питьевой водой, в течение семи дней (доза: 500 мг / л воды).
- Удалите все оставшиеся шелковые швы с кожи сообщению 10 дней после операции под ингаляционной анестезии.
6) Подтверждение успешного сужение восходящей аорты
- Выполните транс-грудной двухмерную Допплер-эхокардиография для определения интенсивплотность от перегрузки давления производимого сужения восходящей аорты.
- Обезболить крысы одну неделю после операции, как описано выше (шаг 1.5)
- Поместите датчик ультразвука на наднациональном грудины положение для записи градиент давления через суженные части восходящей аорты.
Примечание: Крысы с градиентом давления около 60 мм ртутного столба при аорты суженной сайте будет развиваться серьезные гипертрофию сердца примерно на 8-10 недель после операции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В наших экспериментах мы способны достичь выживаемости более 80%. Эффективность сужением аорты была подтверждена путем осуществления ДЭХОКГ. Крысы (N = 6) с градиентом давления около 60 мм рт.ст. при аорты суженной сайта наблюдались в течение 8 недель и умерщвляли для анализа для развития гипертрофии сердца (рис. 1). После 8 недель оценка эхокардиографии после операции выявлено значительное увеличение левого желудочка параметров, таких как, в числе толщины межжелудочковой перегородки, желудочковая задней толщины левой стенки и уменьшением левого желудочка внутренним диаметром в диастолического государства, в животных, подвергавшихся сужением аорты, по сравнению с ложнооперированных управления (табл. 1, рис 2). Значительное увеличение сердечных вес / тела весовых соотношениях и желудочковой вес / тела соотношениях левых веса наблюдались у крыс с сужением аорты (табл. 2, рис 3). Эти данныепоказывают, что 8 недель после операции крыс с сужением аорты развивать значительный уровень гипертрофии сердца, по сравнению с ложнооперированных управления.
Рисунок 1. Эхокардиограмма у крыс, представляющих градиент давления на восходящей аорты. Аа) Представитель эхокардиография от крыс с сужением аорты и имеющий градиент давления 63,0 мм рт.ст. и Ab представляет цвет Доплера эхо сайте через аорту, где градиент давления измерялась. BA) Представитель эхокардиография с ложнооперированных контроль крыса, имеющий градиент давления 2,86 мм рт.ст. и Bb представляет цвет Доплера эхо сайте через аорту, где градиент давления был мера г. Это увеличение градиента давления указывает на успешное диапазонов аорты у крыс, подвергшихся частичной восходящей аорты сужение.
. Рисунок 2 М-режим эхокардиография левого желудочка у крыс с сужением аорты (А) и контрольных крыс (B), изображающие левые размеры желудочков в момент жертвоприношения 8 недель после операции IVST = между толщиной межжелудочковой перегородки.; LVPWT = желудочка толщина стенки левого заднего; LVID = левого желудочка внутренний диаметр в диастолу. У крыс с сужением аорты значительное увеличение среди толщины межжелудочковой перегородки левого желудочка задней толщина стенки и уменьшение левого желудочка внутренним диаметром в диастолического государства можно наблюдать.
Рисунок 3. Изображения целых сердцах крысы, подвергшихся сужением аорты (А) и обман, эксплуатируемых управления крысу (B) 8 недель после операции. Крыса с сужением аорты имеет значительный гипертрофию сердца по сравнению с ложнооперированных управления.
Таблица 1 М-режим ЭхоКГ параметры сердечного левого желудочка в момент жертвоприношения, 8 недель после операции IVST = между толщина межжелудочковой перегородки..; LVPWT = желудочка толщина стенки левого заднего; LVID = левого желудочка внутренний диаметр в диастолического государства; AAC = восходящей аорты сужение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько хирургических модели для индукции перегрузки давления, а также гипертрофии сердца и сердечной недостаточности. В мелких животных, Lorell и его коллеги разработали модель, которую мы обсудили здесь, и они сообщили, возникновение компенсированной гипертрофии сердца 8 недель после аорты диапазонов 5. Сердечные изменения постепенно идти к декомпенсации состоянии, а затем привести к сердечной недостаточности. Основным преимуществом данной модели является постепенное начало увеличением давления левого желудочка и, таким образом, аналогичен клинических ситуациях при хронической гипертензии. Это также подходит животная модель для изучения влево сердечной недостаточности ассоциированная легочная гипертензия 10.
Другие модели животных для перегрузки давления сердечной недостаточности, такие как Dahl чувствительных крыс, крыс со спонтанной гипертензией и крыс с сужением брюшной аорты, также развивать перегрузки хронический давления. Они, однако, принять длительные периоды времени для прогрессирования ером гипертрофия сердца к сердечной недостаточности. Стоимость подопытных крыс обслуживание поэтому также выше 1. deAlmeida и его коллеги использовали поперечные сужением аорты для стимулирования гипертрофии левого желудочка у мышей 11. Технология предполагает средний стернотомии и втягивание грудины и, следовательно, является более сложным.
Обеспечить быстрое изменение анестезии от носового конуса в интубации трахеи до торакотомии и от интубации трахеи в носовой обтекатель после оперативных процедур. Альтернативный способ интубации трахеи крыс является использование полиэтиленовых труб для эндотрахеальной интубации вместо трахеотомии. Однако этот метод требует соответствующего навыка. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать травм в легкие, делая разрез между ребрами. Применение титановых клипов, достаточных для получения критической сужением аорты для стресса левого желудочка, но не достаточно серьезны, чтобы произвести острой левожелудочковой и рulmonary отек. Использование PROLENE швов для приближения ребер имеет решающее значение для успешного выздоровления животного. Во время приближения ребер, пауза вентилятор около 2-4 сек для того, чтобы вновь раздувать легкие.
У нас было только 20% оперативную смертность у животных и не было никаких послеоперационных осложнений. Методика мы описали здесь, таким образом, эффективным и подходящим инструментом для изучения хронических патофизиологических изменений в сердечной гипертрофии и прогрессирующей сердечной недостаточности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают, Департамент Биотехнологии, правительство Индии за финансовую поддержку данного проекта. Аджит Кумар GS была поддержана с старшим научным общении с Советом по научным и промышленным исследованиям, правительства Индии и Binil Raj с старшим научным общении с Индийским советом по медицинским исследованиям, правительство Индии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
