Summary
Se describe un procedimiento paso a paso para la creación de la sobrecarga de presión e hipertrofia del ventrículo izquierdo en ratas Wistar por la constricción de la aorta ascendente mediante un pequeño clip metálico. Este modelo se utiliza ampliamente para el estudio de los cambios de remodelación durante la hipertrofia cardíaca y para la identificación y evaluación de las estrategias para la regresión de dichos cambios.
Abstract
Ascendente constricción de la aorta es el modelo quirúrgico más común y exitoso para la creación de la sobrecarga de presión inducida por la hipertrofia cardíaca y la insuficiencia cardíaca. Aquí se describe un procedimiento quirúrgico detallado para la creación de la sobrecarga de presión e hipertrofia cardiaca en ratas mediante la constricción de la aorta ascendente mediante un pequeño clip metálico. Después de la anestesia, la tráquea se intuba mediante la inserción de una cánula a través de una incisión media manera hecha entre dos anillos de cartílago de la tráquea. A continuación, una incisión en la piel se hace a nivel del segundo espacio intercostal en la pared torácica izquierda y capas musculares se borran hasta encontrar la parte ascendente de la aorta. La aorta ascendente se estrecha a 50-60% de su diámetro original mediante la aplicación de un pequeño clip de titanio de tamaño. Después de constricción de la aorta, las segunda y tercera costillas son aproximadas con suturas de prolene. Se restableció Se retira la cánula traqueal respiración espontánea una vez. Se deja que el animal pueda recuperarse On el cojín de calefacción mediante la reducción gradual de la anestesia. La intensidad de la sobrecarga de presión creada por la constricción de la aorta ascendente se determina mediante el registro de la gradiente de presión utilizando transtorácica bidimensional ecocardiografía Doppler. En general, este protocolo es útil para estudiar los eventos de remodelación y las propiedades contráctiles del corazón durante la aparición gradual y la progresión de la hipertrofia cardiaca compensada a la etapa de la insuficiencia cardíaca.
Introduction
Pequeños modelos animales son los instrumentos preferidos para el estudio de los cambios crónicos en el desarrollo de hipertrofia cardiaca y su progresión a la insuficiencia cardíaca. Modelos de insuficiencia cardíaca por métodos quirúrgicos fueron desarrollados originalmente en ratas ya que estos animales son los más adecuados para los procedimientos quirúrgicos del pecho abierto, la ecocardiografía y la evaluación de los parámetros hemodinámicos. También proporcionan muestras post mortem adecuados para estudios de nivel 1 moleculares del tejido, celular y. La constricción de la aorta ascendente es uno de los modelos quirúrgicos más comunes y exitosos para la creación de la sobrecarga de presión insuficiencia cardíaca 2, 3. Este modelo es muy adecuado para estudiar los eventos de remodelación celular celulares y sub y las propiedades contráctiles del corazón durante la transición de hipertrofia a la insuficiencia cardiaca 4.
Una ventaja importante de este modelo es la aparición gradual de la sobrecarga de presión sobre el corazón 5, </ Sup> 6. Este modelo es clínicamente relevante debido a su lenta pero constante progresión de la hipertrofia cardiaca compensada a la fase descompensada y finalmente a la etapa de la insuficiencia cardíaca. La duración para la progresión de la hipertrofia cardíaca a la insuficiencia cardíaca y los cambios fisiológicos asociados están influenciados principalmente por el grado de estenosis producido 7. Ascendente constricción de la aorta se puede realizar de dos maneras, ya sea mediante el uso de suturas o por aplicación de clips metálicos 8, 9. La principal ventaja de utilizar un clip metálico para constricción de la aorta es que los procedimientos quirúrgicos son menos complicados. En este método se tiene que localizar la aorta ascendente supra valvular e inserte la pinza alrededor de la aorta para obtener el nivel deseado de constricción. Un retractor de pecho no es necesario en este procedimiento. Aórtica mediante sutura requiere manipulaciones más quirúrgicas para la colocación de la aguja de calibre al lado de la aorta ascendente y la sutura alrededor de ella paraproducir el nivel deseado de constricción de la aorta. La última técnica es más lento en comparación con el uso de clips metálicos para la constricción de la aorta. El método descrito en este video demuestra el procedimiento quirúrgico para la constricción de la aorta ascendente en ratas que permite la creación de presión modelo de hipertrofia ventricular izquierda sobrecargado.
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Protocol
Los experimentos con animales se realizaron después de obtener la aprobación del Comité de Ética Animal Institucional. Ratas Wistar fueron alojados bajo una oscuridad de 12 horas para el ciclo de luz, temperatura constante (24 ± 2 ° C) con comida y agua ad libitum (según las directrices CPCSEA).
1) Cuidado Pre-operatorio y anestesia
- Mantener la rata (aproximadamente 200 g de peso corporal) en virtud de antibiótico paraguas 24 horas antes de la cirugía mediante la administración de amoxicilina por vía oral (dosis: 500 mg / L de agua).
- Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos (tales como tijeras, pinzas, aplicador de grapas, agujas de sutura, y soporte de la aguja) en autoclave a 121 ° C durante 15 min.
- Utilice una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal del animal alrededor de 37 ° C para evitar una rápida disminución en la frecuencia cardíaca.
- Tenga cuidado para evitar la deshidratación del animal antes y durante la cirugía.
- Se anestesia la rata en una cámara de inducción con 3% de isoflurano mezclado con0,5-1,0 L / min 100% de oxígeno; mantener la anestesia con 1,5% de isoflurano.
- Compruebe el reflejo pedal para confirmar la anestesia exitosa.
2) Preparación del sitio quirúrgico
- Mantenga la rata en la parte superior de una almohadilla térmica de temperatura controlada en la posición supina.
- Coloque una banda de goma sobre los dientes delanteros de la rata para mantener al animal en posición mientras se mantiene la anestesia con un cono de nariz.
- Retire la piel del cuello y región del pecho izquierdo de la rata (preferiblemente usando una máquina de afeitar eléctrica).
- Desinfectar la zona quirúrgica con solución de povidona yodada y luego con 70% de alcohol etílico.
- Utilice un paño estéril para exponer sólo el sitio quirúrgico durante el procedimiento quirúrgico.
Nota: Como una opción adicional para el cuidado de los animales, 0,25% bupivicaína Identificación (2,5 mg / kg) se puede incorporar antes de la incisión en cada sitio de la incisión para la anestesia local / analgesia.
3) Intubación traqueal en rata
- Hacer una pequeña incisión en la piel paralela a la tráquea utilizando una cuchilla quirúrgica estéril y separar cuidadosamente el tejido subyacente con el fin de exponer la tráquea.
- Aplicar un empate de 4-0 seda hilo de sutura debajo de la tráquea y levante suavemente la eliminatoria hacia arriba.
- Hacer una incisión a mitad de camino entre dos anillos de cartílago e insertar la cánula traqueal en la tráquea de la rata.
- Conectar la cánula traqueal a un ventilador de roedor para el mantenimiento de una frecuencia respiratoria de 50 respiraciones / min, volumen de marea de 1,70 ml y el tiempo de inspiración de 0,60 seg (de rata con 200 g de peso corporal).
4) La constricción de la aorta ascendente
- Después de detectar la posición de las costillas con los dedos, hacer una incisión en la piel de alrededor de 2 cm en la pared torácica izquierda entre las segunda y tercera costillas.
- Se separa la capa músculos intercostales por capa y hacer una incisión de aproximadamente 1,5 cm de largo entre las segunda y tercera costillas. (El cuidado debe ser toman para evitar cualquier daño a los pulmones mientras que hace la incisión entre las costillas)
- Repliegue de las costillas y ubique la parte ascendente de la aorta.
- Coloque un pequeño clip de titanio de tamaño alrededor de la aorta ascendente con la ayuda de un aplicador con lo que la constricción de la aorta al 50-60% del diámetro inicial.
- Después de la constricción de la aorta, la aproximación de las segunda y tercera costillas con 3,0 de prolene en un patrón de sutura interrumpida. Al mismo tiempo, poner en pausa el respirador durante unos 2-4 segundos con el fin de volver a inflar los pulmones.
- Aproximar las capas musculares con 3,0 puntos de sutura de prolene y la piel con 4,0 puntos de seda en un patrón de sutura interrumpida. Suturas sintéticas no absorbibles se pueden utilizar en lugar de la seda para suturar la piel.
- Retire la cánula traqueal de la rata se vuelve a establecer la respiración espontánea de una vez.
- Cierre la abertura de la tráquea con 3,0 puntos de sutura de prolene y la capa de la piel con 4,0 puntos de seda.
- Permita que el animal se recupere en tque el calentamiento de la almohadilla mediante la reducción gradual de la anestesia y ventilación respiración asistida.
- En los animales de control simulado de la misma edad, realizar la traqueotomía y la toracotomía y sin constricción de la aorta ascendente.
5) Cuidado post-operatorio
- Desinfectar el área quirúrgica con solución de povidona yodada.
- Como analgesia postoperatoria, inyecte tramadol por vía intraperitoneal (10 mg / kg de peso corporal / día) durante 1 semana.
- Inyectar estéril salina normal por vía intraperitoneal si aparecen signos de deshidratación después de la cirugía (aproximadamente 1 ml).
- Administrar amoxicilina por vía oral, mezclado con el agua potable, durante siete días (dosis: 500 mg / L de agua).
- Elimine cualquier resto de suturas de seda de la piel después de 10 días de la cirugía bajo anestesia por inhalación.
6) Confirmación de constricción con éxito de aorta ascendente
- Realice una transtorácica bidimensional ecocardiografía Doppler para determinar la intenciónsidad de la sobrecarga de presión producida por la constricción de la aorta ascendente.
- Se anestesia a las ratas una semana después de la cirugía como se describe anteriormente (paso 1.5)
- Coloque el transductor de ultrasonido en la posición esternal supra para registrar el gradiente de presión a través de la parte de constricción de la aorta ascendente.
Nota: Las ratas con un gradiente de presión de aproximadamente 60 mm de Hg en el sitio restringido aórtica desarrollarán hipertrofia cardíaca severa por cerca de 8-10 semanas después de la cirugía.
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Representative Results
En nuestros experimentos podemos lograr más del 80% las tasas de supervivencia. La eficacia de la constricción de la aorta fue confirmada mediante la realización de ecocardiografía Doppler. Las ratas (n = 6) con un gradiente de presión de aproximadamente 60 mm de Hg en el sitio de constricción aórtica se observaron durante 8 semanas y se sacrificaron a analizar para el desarrollo de la hipertrofia cardíaca (Figura 1). Después de 8 semanas de evaluación ecocardiográfica después de la cirugía reveló un aumento significativo en los parámetros del ventrículo izquierdo como el grosor del tabique ventricular entre, espesor del ventrículo izquierdo posterior de la pared y disminución en el diámetro interno del ventrículo izquierdo en estado diastólica, en los animales que se sometieron a constricción de la aorta, en comparación con operación simulada los controles (Tabla 1, Figura 2). Un aumento significativo en relaciones en peso / peso corporal del corazón y relaciones en peso / peso corporal del ventrículo izquierdo se observaron en ratas con constricción aórtica (Tabla 2, Figura 3). Estos datossugieren que las ratas 8 semanas después de la cirugía con constricción aórtica desarrollan un importante nivel de hipertrofia cardiaca, en comparación con el tratamiento simulado controles operados.
Figura 1. Ecocardiograma en ratas que representan el gradiente de presión a través de la aorta ascendente. Aa) El ecocardiograma representante de una rata con la constricción de la aorta y tener un gradiente de presión de 63,0 mm de Hg y Ab representa eco Doppler color de la página a través de la aorta, donde el gradiente de presión se midió. Ba) El ecocardiograma representante de una operación simulada de control rata que tiene un gradiente de presión de 2,86 mm de Hg y Bb representa eco Doppler color del sitio a través de la aorta, donde el gradiente de presión fue medida d. Este aumento de la gradiente de presión indica bandas éxito de la aorta en ratas a las que se sometieron a constricción aórtica ascendente parcial.
. Figura 2 Ecocardiograma en modo M del ventrículo izquierdo en ratas con constricción de la aorta (A) y las ratas (B) que muestran las dimensiones del ventrículo izquierdo en el momento del sacrificio 8 semanas después de la cirugía IVST = espesor entre septal ventricular control.; LVPWT = espesor del ventrículo izquierdo posterior de la pared; DIVI = diámetro interno del ventrículo izquierdo en la diástole. En ratas con constricción aórtica un aumento significativo en el espesor entre septo ventricular, espesor de la pared posterior del ventrículo izquierdo y la disminución de diámetro interno del ventrículo izquierdo en estado diastólica se pueden observar.
Figura 3. Imágenes de todo el corazón de una rata que se sometieron a la constricción de la aorta (A) y una operación simulada de ratas control (B) 8 semanas después de la cirugía. La rata con constricción aórtica tiene hipertrofia cardíaca significativa en comparación con el tratamiento simulado operado control.
Tabla 1 M-mode parámetros ecocardiográficos de ventrículo izquierdo cardíaco en el momento del sacrificio, a 8 semanas después de la cirugía IVST = espesor entre septal ventricular..; LVPWT = espesor del ventrículo izquierdo posterior de la pared; DIVI = diámetro interno del ventrículo izquierdo en el estado diastólica; AAC = constricción de la aorta ascendente.
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Discussion
Hay varios modelos quirúrgicos para la inducción de la sobrecarga de presión, así como la hipertrofia cardíaca y la insuficiencia cardíaca. En pequeños animales, Lorell y sus colegas desarrollaron el modelo que hemos descrito aquí y reportaron la ocurrencia de hipertrofia cardiaca compensada 8 semanas después aórtica 5. Cambios cardíacos avancen paulatinamente hacia un estado descompensada y luego dan lugar a la insuficiencia cardíaca. La principal ventaja de este modelo es la aparición gradual de aumento de la presión ventricular izquierda y por lo tanto similar a situaciones clínicas en la hipertensión crónica. También es un modelo animal adecuado para el estudio de la insuficiencia cardíaca izquierda asociada hipertensión pulmonar 10.
Otros modelos animales para la insuficiencia cardíaca sobrecarga de presión, tales como ratas Dahl sensibles, ratas espontáneamente hipertensas y ratas con constricción de la aorta abdominal, también desarrollan sobrecarga de presión crónica. Ellos, sin embargo, tienen largos periodos de tiempo para la progresión fROM hipertrofia cardiaca a la insuficiencia cardíaca. El coste de mantenimiento de las ratas experimentales es, por tanto, también mayor 1. Dealmeida y sus colegas emplearon constricción aórtica transversal para la inducción de la hipertrofia ventricular izquierda en ratones 11. La técnica implica la esternotomía media y la retracción del esternón y por lo tanto es más difícil.
Asegurar un rápido cambio de la anestesia del cono de la nariz a la intubación traqueal antes de la toracotomía y de la intubación traqueal con cono de la nariz después de los procedimientos quirúrgicos. Un método alternativo para la intubación traqueal en ratas es mediante el uso de tubo de polietileno para la intubación endotraqueal en lugar de traqueotomía. Sin embargo, esta técnica requiere habilidad adecuada. Se debe tener cuidado para evitar cualquier daño a los pulmones mientras que hace la incisión entre las costillas. La aplicación de clips de titanio suficientes para producir constricción aórtica crítica para el estrés ventricular izquierda, pero no lo suficientemente graves como para producir insuficiencia ventricular izquierda aguda y pedema ulmonary. El uso de suturas de prolene para la aproximación de las costillas es fundamental para la recuperación exitosa del animal. Durante la aproximación de las costillas, hacer una pausa en el ventilador durante aproximadamente 2-4 segundos con el fin de volver a inflar los pulmones.
Tuvimos la mortalidad operatoria sólo el 20% de los animales y no hubo complicaciones postoperatorias. La técnica que hemos descrito aquí es, pues, una herramienta eficaz y adecuado para el estudio de los cambios crónicos fisiopatológicas en la hipertrofia cardíaca y la insuficiencia cardíaca progresiva.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India para el apoyo financiero de este proyecto. Ajith Kumar GS fue apoyado con becas de investigación senior del Consejo de Investigación Científica e Industrial, Gobierno de la India y Binil Raj con beca de investigación de alto nivel de Consejo Indio de Investigación Médica, Gobierno de la India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
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