Summary
我们描述了使用一个小的金属夹子由升主动脉缩窄建立压力负荷和左心室肥厚大鼠一个逐步的过程。该模型被广泛用于心肌肥厚过程中学习重塑变化，物色及评估策略，这种变化的回归。
Abstract
升主动脉缩窄是一个用于创建诱导的心肌肥厚和心脏衰竭压力超负荷最常见和最成功的手术模型。在这里，我们描述了使用一个小的金属夹子由升主动脉缩窄建立压力负荷和心肌肥厚大鼠详细的手术过程。麻醉后，气管是通过一个半路上切口气管2软骨环之间进行插入插管插管。然后一个皮肤切口，在第二肋间水平上的左胸壁和肌肉层被清除，以找出主动脉的上升部分。升主动脉的收缩到其原始直径由应用的小尺寸钛夹的50-60％。以下主动脉缩窄，第二和第三肋近似prolene线缝合。气管插管被删除，一旦自主呼吸被重新建立。动物被允许恢复Ø通过逐渐降低麻醉n为加热垫。通过升主动脉的收缩产生的压力超负荷的强度是通过使用反式胸二维多普勒超声心动图记录的压力梯度来确定。总体来说，这一协议是逐渐发生和发展的代偿性心肌肥厚心脏衰竭阶段时，研究重塑事件和心脏的收缩特性非常有用。
Introduction
小动物模型是用于在心脏肥大及其进展为心脏衰竭的发展慢性变化的研究最优选的工具。通过手术方法心脏衰竭模型最初是在大鼠为这些动物都是敞胸外科手术，超声心动图血流动力学参数和评估最合适。它们还提供了充足的验尸样本进行组织，细胞和分子水平的研究1。升主动脉缩窄是最常见的和成功的手术模型用于创建压力超负荷心脏衰竭2，3中的一个。这种模式是非常适合从肥大心脏衰竭4在过渡期间，研究细胞和亚细胞重塑事件和心脏的收缩性能。
这种模式的主要优点是逐渐发生的5心脏压力超负荷，</燮> 6。这种模式是因为其缓慢但稳定的进展从补偿心肌肥厚到失代偿阶段，最后到心脏衰竭阶段临床相关性。持续时间为心肌肥厚心脏衰竭和相关生理变化的进程主要受狭窄程度产生7。升主动脉缩窄可以通过两种方式来进行，或者通过使用缝合线或者由应用的金属夹子8,9。使用金属夹，用于主动脉缩窄的主要优点是，外科手术是不太复杂的。在该方法中人们必须找出同上瓣膜升主动脉，插入片段围绕主动脉取得缩颈的期望的水平。胸部牵开器是没有必要在此过程。主动脉缩窄通过缝合需要更多的手术操作用于放置针头升主动脉旁，周围缝合到产生主动脉缩窄的所需的水平。后者的技术是更多的时间时，与使用金属夹子对主动脉缩窄比较耗时。在这个视频中描述的方法演示了外科手术升大鼠主动脉缩窄，使压力超负荷创造左心室肥厚模型。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
动物实验获得学院动物伦理委员会批准后执行。 Wistar大鼠容纳下一个12小时黑暗的光周期，恒定室温（24±2℃）与食物和水随意（按照CPCSEA准则）。
1）手术前护理和麻醉
- 根据抗生素伞24小时保持大鼠（约200g体重）术前通过口服阿莫西林（剂量：水500毫克/升）。
- 通过在121℃下高压灭菌15分钟进行消毒所有外科工具（如剪刀，镊子，夹子施放器，缝合针和缝合针夹持器）。
- 使用加热垫保持动物的体温约37℃，以避免在心脏速率迅速下降。
- 注意避免之前和期间手术的动物脱水。
- 麻醉中的感应腔的大鼠用3％异氟烷与混合0.5-1.0升/分钟100％的氧气;与1.5％异氟醚维持麻醉。
- 检查踏板反射确认成功麻醉。
2）准备手术部位
- 保持对大鼠温控加热垫的顶部在仰卧位。
- 定位橡皮筋在老鼠的门牙，以保持动物的位置，同时维持麻醉用鼻锥。
- 从领口取下毛皮，离开了大鼠胸部区域（最好使用电动剃须刀）。
- 消毒手术部位与聚维酮碘溶液，然后用70％的乙醇。
- 使用无菌悬垂到手术过程中只露出手术部位。
注：对于照顾动物一个额外的选项，0.25％布比卡因ID（2.5毫克/千克）可结合在每个切口部位切开局部麻醉/镇痛前。
3）气管插管鼠
- 使在平行于用无菌手术刀片气管皮肤的小切口，仔细分离下层组织以暴露气管。
- 适用的气管下方4-0丝线缝合线领带和轻轻抬起领带向上。
- 使2软骨环之间的半路上切口并插入气管套管插入大鼠的气管中。
- 气管插管连接到啮齿动物呼吸机维持50次呼吸/分钟，1.70毫升潮气量和0.60秒的吸气时间（对于大鼠用200g体重）的呼吸率。
升主动脉4）缩窄
- 经过感应肋骨的位置用手指，做出对第二和第三肋骨之间左胸壁约2厘米的皮肤切口。
- 通过层分离肋间肌层和做一个切口约1.5厘米长的第二和第三肋之间。 （护理应采取n到避免任何损伤肺，同时使肋之间切口）
- 收回肋骨和定位主动脉升部。
- 放置一个小尺寸的钛夹围绕升主动脉带有施加的帮助，从而收缩主动脉到原始直径的50-60％。
- 以下的主动脉缩窄，接近所述第二和第三肋与3.0 prolene线中的间断缝合图案。同时，暂停呼吸约2-4秒，以重新膨胀肺部。
- 放在附近的肌肉层，3.0普理灵缝线和皮肤4.0丝线缝合在间断缝合模式。合成的非吸收缝合线可以用来代替丝的缝合皮肤。
- 从一次自主呼吸重新建立大鼠去除气管套管。
- 关闭气管开口3.0普理灵缝线和皮肤层4.0丝线缝合。
- 让动物恢复对T他通过逐渐降低麻醉和呼吸机辅助呼吸的加热垫。
- 在年龄匹配的假手术对照组动物，进行气管切开及开胸无升主动脉缩窄。
5）术后护理
- 消毒手术区域用聚维酮碘溶液。
- 由于手术后的镇痛，曲马多注射腹腔内（10毫克/公斤体重/天）1周。
- 注入无菌生理盐水腹腔内，如果脱水体征手术（大约1毫升）后出现。
- 辖阿莫西林口服，混合饮水，七天（剂量：水500毫克/升）。
- 从后下吸入麻醉10天手术的皮肤去除任何剩余的丝线缝合。
6）确认升主动脉的成功缩窄的
- 执行跨胸二维多普勒超声心动图来确定INTENSITY由升主动脉的收缩所产生的压力超负荷。
- 如前所述麻醉大鼠1周手术后（步骤1.5）
- 将超声换能器在上文胸骨位置横跨升主动脉的收缩部记录的压力梯度。
注：大鼠在主动脉狭窄部位约60毫米汞柱的压力梯度会出现严重的心肌肥厚约8-10周后手术。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在我们的实验中，我们能够实现80％以上的存活率。主动脉缩窄的效果是通过执行多普勒超声心动图证实。大鼠（N = 6），其在主动脉狭窄部位约60毫米汞柱的压力梯度，观察8周，处死以便分析心肌肥大的发展（ 图1）。 8周后手术后的超声心动图评价结果显示左心室参数，如跨室间隔厚度，左室后壁厚度及减少左室内径在舒张状态，动物，进行主动脉缩窄显著增加，较假手术对照组（ 表1，图2）。在心脏重量/体重比值和左室重量/体重比值显著增加，观察大鼠主动脉缩窄（ 表2，图3）。这些数据建议有8周后手术大鼠主动脉缩窄出现心脏肥大的显著水准，相较于假手术对照。
图1。超声心动图在大鼠代表整个升主动脉的压力梯度。 AA）的代表超声心动图从大鼠主动脉收缩，并具有63.0毫米汞柱和抗体的压力梯度表示站点的跨越，其中压力梯度进行了测量。 巴）的代表从超声心动图是假的主动脉彩色多普勒回声控制操作大鼠有2.86毫米汞柱和 Bb的压力梯度表示站点的整个主动脉那里的压力梯度是衡量彩色多普勒回声 ð。这种增加的压力梯度表示大鼠的例行部分升主动脉缩窄主动脉绑扎成功。
。左心室的大鼠主动脉缩窄（A）和对照组（B）以牺牲时间8周后，手术 IVST =跨室间隔厚度描绘左心室尺寸图2 M型超声心动图 ; LVPWT =左室后壁厚度; LVID =左室内径舒张。大鼠主动脉缩窄的跨室间隔厚度显著增加，左室后壁厚度及减少左室内径在舒张状态下可以观察到。
相比，假手术对照图3。一只老鼠的整个心哪行主动脉缩窄（A）和假手术对照组大鼠（B）8周后，手术图像。与主动脉缩窄大鼠有显著心肌肥厚。
表1 M型心肌左心室在处死时超声心动图参数，后8周手术 IVST =跨室间隔厚度; LVPWT =左室后壁厚度; LVID =左室内径在舒张状态; AAC =升主动脉缩窄。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
有几种手术的型号为感应压力超负荷以及心肌肥厚和心脏衰竭。在小动物，Lorell和他的同事开发了我们在这里所描述的模型，他们报告的代偿性心肌肥厚后8周主动脉缩窄5的发生。心脏的变化逐渐进展到失代偿状态，然后导致心脏衰竭。这种模式的主要优点是逐步发病增加，左心室压力，从而类似于在慢性高血压的临床情况的。它也是一种合适的动物模型用于研究相关 的左心脏衰竭肺动脉高血压10。
其他动物模型用于压力超负荷心脏衰竭，如达尔敏感大鼠，自发性高血压大鼠和大鼠腹主动脉缩窄，也发展为慢性压力超负荷。然而，他们对进展F凸出部分的时间段ROM心肌肥厚心脏衰竭。实验组大鼠的维护成本因此也较高1。 deAlmeida和他的同事采用横向主动脉缩窄诱导左室肥厚小鼠11。该技术涉及胸骨正中胸骨和回缩，因此更具挑战性。
确保麻醉从鼻锥迅速变化后手术开胸程序前，从气管插管气管插管，以鼻锥。在大鼠气管插管的另一种方法是使用聚乙烯管，气管插管代替气管切开。但是，这种技术需要充足的技能。应小心，以避免任何损伤到肺部，同时使肋之间的切口。钛夹足以产生关键的主动脉缩窄左心室压力，但还不足以严重到产生急性左心衰竭和p中的应用ulmonary水肿。使用普理灵缝线的肋骨的近似是对动物的复苏成功的关键。在肋骨的逼近，暂停呼吸机约2-4秒，以重新膨胀的肺部。
我们只有20％，手术死亡率在动物和没有术后并发症。我们这里所描述的技术是这样一个有效率和适合学习的心肌肥厚和渐进心脏衰竭慢性病理生理变化的工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者承认生物技术系，印度政府为这个项目提供财政支持。阿吉特·库马尔GS与科学和工业研究，印度政府和Binil拉吉与医学研究，印度政府的印第安人理事会高级研究奖学金理事会高级研究奖学金得到了支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
