Summary
Vi beskriver en trinvis procedure til at skabe pres overbelastning og venstre ventrikel hypertrofi i Wistarrotter ved konstriktion af opstigende aorta ved hjælp af en lille metallisk klip. Denne model er flittigt brugt til at studere remodeling ændringer i løbet af hjertehypertrofi og for at identificere og evaluere strategier for regression af sådanne ændringer.
Abstract
Stigende pulsåresammensnøring er den mest almindelige og vellykket kirurgisk model for at skabe trykoverbelastning induceret hjertehypertrofi og hjertesvigt. Her beskriver vi en detaljeret kirurgisk procedure for at skabe pres overbelastning og hjertehypertrofi i rotter ved konstriktion af opstigende aorta ved hjælp af en lille metallisk klip. Efter anæstesi trachea intuberet ved indsættelse af en kanyle gennem en halvvejs indsnit mellem to bruskringene af luftrøret. Så en hud incision på niveau med den anden interkostale plads på venstre bryst væg og muskellag er godkendt til at lokalisere opstigende del af aorta. Opstigende aorta indsnævres til 50-60% af sin oprindelige diameter ved anvendelse af en lille størrelse titanium klip. Efter pulsåresammensnøring, andet og tredje ribben tilnærmes med PROLENE suturer. Den trakealkanyle fjernes en gang spontan vejrtrækning blev genoprettet. Dyret får lov til at komme on varmepuden ved gradvist at sænke anæstesi. Intensiteten af pres overbelastning skabt ved konstriktion af opstigende aorta bestemmes ved at registrere trykgradient hjælp transtorakal todimensionalt Doppler-ekkokardiografi. Samlet denne protokol er nyttigt at studere remodeling begivenheder og kontraktile egenskaber af hjertet under den gradvise opståen og udvikling fra kompenseret hjertehypertrofi til hjertesvigt scenen.
Introduction
Små dyremodeller er de mest foretrukne værktøjer til undersøgelse af kroniske forandringer i udviklingen af hjertehypertrofi, og dens progression til hjertesvigt. Hjertesvigt modeller af kirurgiske metoder blev oprindeligt udviklet i rotter, da disse dyr er mest velegnede til åben bryst kirurgiske procedurer, ekkokardiografi og evaluering af hæmodynamiske parametre. De giver også tilstrækkelige efter slagtning prøver til væv, cellulære og undersøgelser molekylære niveau 1. Konstriktion af den opstigende aorta er en af de mest almindelige og vellykkede kirurgiske modeller til at skabe trykoverbelastning hjertesvigt 2, 3. Denne model er velegnet til at studere cellulære og sub cellulære remodeling begivenheder og kontraktile egenskaber af hjertet under overgangen fra hypertrofi af hjertesvigt 4.
En stor fordel ved denne model er den gradvise indtræden af trykoverbelastning på hjertet 5 </ Sup> 6. Denne model er klinisk relevant på grund af sin langsom, men støt progression fra kompenseret hjertehypertrofi til dekompenseret fase og endelig til hjertesvigt scenen. Varigheden for progression af hjertehypertrofi til hjertesvigt og de dermed forbundne fysiologiske ændringer er primært påvirket af graden af stenose producerede 7. Stigende pulsåresammensnøring kan udføres på to måder, enten ved hjælp af suturer eller ved anvendelse af metalliske clips 8, 9. Den største fordel ved at anvende en metallisk clips pulsåresammensnøring er, at de kirurgiske procedurer er mindre kompliceret. I denne metode man har til at finde den supra valvular opstigende aorta og indsætte klippet omkring aorta for at opnå den ønskede grad af konstriktion. En kiste retraktor er ikke nødvendigt i denne procedure. Aorta banding ved suturering kræver flere kirurgiske manipulationer til at placere målernålen siden af opstigende aorta og suturering omkring det atproducere det ønskede niveau af pulsåresammensnøring. Sidstnævnte teknik er mere tidskrævende sammenlignet med brugen af metalklemmer til pulsåresammensnøring. Beskrevet i denne video metode viser den kirurgiske procedure for opstigende aorta indsnævring i rotter, der tillader etablering af tryk overbelastet venstre ventrikel hypertrofi model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført efter at have indhentet godkendelse fra Institutional Animal Ethics Committee. Wistarrotter blev huset under en 12 hr mørk til lys cyklus konstant stuetemperatur (24 ± 2 ° C) med mad og vand ad libitum (som pr retningslinjer CPCSEA).
1) Pre-operative pleje og anæstesi
- Hold rotte (ca. 200 g legemsvægt) under antibiotisk paraply 24 timer før operationen ved indgivelse amoxicillin oralt (dosis: 500 mg / L vand).
- Sterilisere alle kirurgiske instrumenter (såsom saks, pincet, clip applikator, suturnåle, og nåleholder) ved autoklavering ved 121 ° C i 15 min.
- Brug en varmepude til at opretholde dyrekroppen temperatur omkring 37 ° C for at undgå et hurtigt fald i hjertefrekvens.
- Sørg for at undgå dehydrering af dyret før og under operationen.
- Bedøve rotte i en induktion kammer med 3% isofluran blandet med0,5-1,0 L / min 100% oxygen; opretholde anæstesi med 1,5% isofluran.
- Kontroller pedal refleks at bekræfte vellykket bedøvelse.
2) Fremstilling af operationsstedet
- Hold rotten på toppen af en temperatur kontrolleret varmepude i liggende stilling.
- Placer en elastik over rottens fortænder at holde dyret i position og samtidig opretholde anæstesi med en næse kegle.
- Fjern skind fra halsudskæringen og venstre bryst region af rotte (helst ved hjælp af en elektrisk barbermaskine).
- Desinficer operationsstedet med povidon-jod-opløsning og derefter med 70% ethanol.
- Brug et sterilt afdækningsstykke kun at eksponere det kirurgiske sted under den operative procedure.
Bemærk: Som en ekstra mulighed for pasning af dyr, kan 0,25% bupivicain ID (2,5 mg / kg) indarbejdes før incising på hvert indsnit site for lokalbedøvelse / analgesi.
3) trakealintubation i Rat
- Lave et lille snit på huden parallelt med luftrøret anvendelse af en steril kirurgisk kniv og omhyggeligt adskille det underliggende væv for at blotlægge trachea.
- Påfør en uafgjort på 4-0 silkesutur tråden under luftrøret og forsigtigt hæve slips opad.
- Lav en halvvejs snit mellem to bruskringene og indsætte trakealkanylen i luftrøret af rotten.
- Slut tracheale kanyle til en gnaver ventilator til at opretholde en respirationsfrekvens på 50 vejrtrækninger / min respirationsvolumen 1,70 ml og inspiration tid på 0,60 sekunder (for rotte med 200 g legemsvægt).
4) konstriktion af aorta ascendens
- Efter afføling af positionen af ribber med fingrene, lave en incision i huden på omkring 2 cm på venstre bryst væg mellem den anden og tredje ribben.
- Adskil interkostale muskler lag for lag, og lave et snit omkring 1,5 cm lang tid mellem det andet og tredje ribben. (Man skal være tagen at undgå enhver skade på lungerne, samtidig med at indsnit mellem ribbenene)
- Træk ribberne og find opstigende del af aorta.
- Placer en lille størrelse titanium klip rundt opstigende aorta ved hjælp af en applikator, hvorved snærende aorta til 50-60% af den oprindelige diameter.
- Efter den pulsåresammensnøring, tilnærme den anden og tredje ribben med 3,0 prolene i en afbrudt sutur mønster. Samtidig pause ventilatoren for omkring 2-4 sekunder for at puste lungerne.
- Appose muskel lag med 3,0 PROLENE suturer og huden med 4,0 silkesuturer i en afbrudt sutur mønster. Syntetiske ikke resorberbare suturer kan anvendes i stedet for silke til suturering huden.
- Fjern trakealkanyle fra rotten, når spontan vejrtrækning er re-etableret.
- Luk trakeal åbning med 3,0 PROLENE suturer og huden lag med 4,0 silkesuturer.
- Lad så dyret kan komme på than varmepude ved gradvist at sænke anæstesi og ventilator assisteret respiration.
- I aldersmatchede dyr fingeret kontrol, udføre trakeostomi og thoracotomi uden konstriktion af opstigende aorta.
5) Postoperativ pleje
- Desinficere kirurgiske område med povidon-jodopløsning.
- Som postoperativ analgesi, injiceres tramadol intraperitonealt (10 mg / kg legemsvægt / dag) i 1 uge.
- Injicere steril normalt saltvand intraperitonealt hvis tegn på dehydrering vises efter operationen (ca. 1 ml).
- Indgiv amoxycillin oralt, blandet med drikkevand, i syv dage (dosis: 500 mg / L vand).
- Fjern eventuelle resterende silkesuturer fra huden efter 10 dage kirurgi under inhalation anæstesi.
6) Bekræftelse af Vellykket konstriktion af aorta ascendens
- Udfør en transtorakal todimensionalt Doppler-ekkokardiografi til at bestemme hensigtenfoldighed af trykoverbelastning produceret af forsnævringen af opstigende aorta.
- Bedøver rotterne en uge efter kirurgi som beskrevet tidligere (trin 1.5)
- Placer ultralydstransducer ved supra brystbenet position til at optage trykgradient over den forsnævrede del af opstigende aorta.
Bemærk: Rotter med en trykgradient på omkring 60 mm Hg ved aorta trange site vil udvikle alvorlig hjertehypertrofi ved omkring 8-10 uger efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vores eksperimenter er vi i stand til at opnå mere end 80% overlevelse. Effektiviteten af pulsåresammensnøring blev bekræftet ved at udføre Doppler ekkokardiografi. Rotter (n = 6) med en trykgradient på omkring 60 mm Hg i aorta indsnævrede stedet blev observeret i 8 uger og aflivet for at analysere for udviklingen af hjertehypertrofi (fig. 1). Efter 8 uger efter operationen ekkokardiografisk evaluering viste en signifikant stigning i venstre ventrikel parametre såsom inter ventrikulær septal tykkelse, venstre ventrikel posterior vægtykkelse og fald i venstre ventrikel indvendig diameter på diastolisk stat, i dyr, som gennemgik pulsåresammensnøring sammenlignet med skinopererede kontroller (tabel 1, figur 2). En betydelig stigning i hjerte vægt / kropsvægt-forholdene og venstre ventrikel vægt / kropsvægt-forholdene blev observeret i rotter med pulsåresammensnøring (tabel 2, figur 3). Disse datatyder på, at 8 uger efter kirurgi rotter med pulsåresammensnøring udvikle en betydelig grad af hjertehypertrofi forhold til skinopererede kontroller.
Figur 1. Ekkokardiogram rotter repræsenterer trykgradient over aorta ascendens. Aa) Den repræsentative ekkokardiografi fra en rotte med konstriktion af aorta og har en trykgradient på 63,0 mm Hg og Ab repræsenterer farve Doppler ekko af stedet på tværs af aorta, hvor trykgradient blev målt. Ba) Repræsentanten ekkokardiografi fra en skinopererede kontrol rotte har en trykgradient på 2,86 mm Hg og Bb repræsenterer farve Doppler ekko af stedet på tværs af aorta, hvor trykgradienten var foranstaltning d.. Denne stigning i trykgradient indikerer en succesfuld banding af aorta i rotter, som undergik delvis stigende pulsåresammensnøring.
. Figur 2. M-mode ekkokardiografi af den venstre ventrikel i rotter med pulsåresammensnøring (A) og kontrol rotter (B) afbilder venstre ventrikulære dimensioner på tidspunktet for aflivning otte uger efter kirurgi IVST = inter ventrikulær septumtykkelse.; LVPWT = venstre ventrikel posterior vægtykkelse; LVID = venstre ventrikel indvendig diameter i diastole. I rotter med pulsåresammensnøring en betydelig forøgelse af de ventrikulære septumtykkelse, kan observeres venstre ventrikel posterior vægtykkelse og fald i venstre ventrikel indvendige diameter diastolisk tilstand.
Figur 3. Billeder af hele hjerter fra en rotte, der undergik pulsåresammensnøring (A) og en skinopererede kontrol rotte (B) 8 uger efter kirurgi. Rotten med pulsåresammensnøring har signifikant hjertehypertrofi i forhold til skinopererede kontrol.
Tabel 1 M-mode ekkokardiografiske parametre for hjerte-venstre ventrikel på tidspunktet for offer 8 uger efter operationen IVST = inter ventrikel septumtykkelse..; LVPWT = venstre ventrikel posterior vægtykkelse; LVID = venstre ventrikel indvendig diameter på diastoliske tilstand; AAC = opstigende pulsåresammensnøring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kirurgiske modeller for induktion af trykoverbelastning samt hjertehypertrofi og hjertesvigt. I små dyr, Lorell og kolleger udviklet den model, vi har beskrevet her, og de rapporterede forekomst af kompenseret hjertehypertrofi otte uger efter aorta banding 5.. Hjerte ændringer gradvist videre til en dekompenseret tilstand og derefter resultere i hjertesvigt. Den største fordel ved denne model er den gradvise indtræden af stigningen i tryk i venstre ventrikel og dermed svarer til kliniske situationer i kronisk hypertension. Det er også en egnet dyremodel for at studere venstre hjertesvigt associeret pulmonal hypertension 10.
Andre dyremodeller for pres overbelastning hjertesvigt, såsom Dahl følsomme rotter, spontant hypertensive rotter og rotter med konstriktion af abdominal aorta, også udvikle kronisk pres overbelastning. De tager imidlertid længere tidsperioder for progression from hjertehypertrofi til hjertesvigt. Vedligeholdelsesudgifter af eksperimentelle rotter er derfor også højere 1. deAlmeida og kolleger ansat tværgående pulsåresammensnøring for at fremkalde hypertrofi af venstre ventrikel i mus 11. Teknikken indebærer mediansternotomi og tilbagetrækning af brystbenet og dermed er mere udfordrende.
Sikre en hurtig ændring af anæstesi fra næse kegle til trakeal intubation før torakotomi og fra trakealintubation til næse kegle efter operative procedurer. En alternativ fremgangsmåde til trakealintubation hos rotter ved hjælp af polyethylen-rør til endotracheal stedet for tracheotomi. Men denne teknik kræver passende dygtighed. Der bør udvises omhu for at undgå enhver skade på lungerne, samtidig med at indsnit mellem ribbenene. Anvendelse af titanium klip tilstrækkelige til at frembringe kritiske pulsåresammensnøring for venstre ventrikel stress, men ikke alvorlige nok til at producere akut venstre ventrikel svigt og pulmonary ødem. Brug af PROLENE suturer for tilnærmelse af ribben er afgørende for en vellykket inddrivelse af dyret. Under tilnærmelse af ribben, pause ventilatoren for omkring 2-4 sekunder for at puste lungerne.
Vi havde kun 20% operativ mortalitet i dyr, og der var ingen post-operative komplikationer. Den teknik, som vi beskrev her er således en effektiv og velegnet værktøj til at studere kroniske patofysiologiske ændringer i hjertehypertrofi og progressiv hjertesvigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkender Institut for Bioteknologi, Indiens regering om økonomisk støtte til dette projekt. Ajith Kumar GS blev støttet med seniorforsker stipendium fra Rådet for videnskabelig og industriel forskning, Indiens regering og Binil Raj med seniorforsker stipendium fra Indiske Råd for Medicinsk Forskning, Indiens regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
