Summary
We beschrijven een stapsgewijze procedure voor het creëren van druk overbelasting en linker ventrikel hypertrofie in Wistarratten door vernauwing van de aorta ascendens met een kleine metalen clip. Dit model wordt veel gebruikt voor het bestuderen remodelleren veranderingen tijdens cardiale hypertrofie en voor het identificeren en evalueren van strategieën voor regressie van dergelijke veranderingen.
Abstract
Oplopend aorta vernauwing is de meest voorkomende en succesvolle chirurgische model voor het creëren van druk overbelasting geïnduceerde cardiale hypertrofie en hartfalen. We beschrijven hier een gedetailleerde chirurgische procedure voor het maken pressure overload en cardiale hypertrofie in ratten door vernauwing van de aorta ascendens met een kleine metalen clip. Na verdoving wordt de trachea geïntubeerd door inbrengen van een canule via een incisie halverwege tussen twee kraakbeen ringen trachea. Dan is een incisie in de huid wordt gemaakt op het niveau van de tweede intercostale ruimte op de linker borstwand en de spieren lagen worden ontruimd om de opgaande deel van de aorta te lokaliseren. De stijgende aorta wordt vernauwd tot 50-60% van zijn oorspronkelijke diameter door het aanbrengen van een klein formaat titanium clip. Na aorta vernauwing, worden de tweede en derde rib benaderd met Prolene hechtingen. De tracheacanule wordt verwijderd zodra de spontane ademhaling is hersteld. Het dier mag o herstellenn de verwarming pad door een geleidelijke verlaging van de anesthesie. De intensiteit van drukoverbelasting door vernauwing van de aorta ascendens wordt bepaald door registratie van de drukgradiënt met transthoracale tweedimensionaal Doppler echocardiografie. Algemeen is dit protocol is het nuttig om de verbouwing evenementen en samentrekkende eigenschappen van het hart te bestuderen tijdens de geleidelijke ontstaan en de progressie van gecompenseerde hypertrofie tot hartfalen podium.
Introduction
Kleine diermodellen zijn de meest geprefereerde gereedschappen voor de studie van chronische veranderingen in de ontwikkeling van cardiale hypertrofie en de progressie van hartfalen. Hartfalen modellen van chirurgische methoden zijn oorspronkelijk ontwikkeld bij ratten als deze dieren zijn het meest geschikt voor de open kist chirurgische procedures, echocardiografie en evaluatie van hemodynamische parameters. Ze bieden ook een adequate post mortem monsters voor weefsel, cellulair en moleculair niveau studies 1. Vernauwing van de aorta ascendens is een van de meest voorkomende en succesvolle chirurgische voor het creëren van overdruk hartfalen 2, 3. Dit model is zeer geschikt voor de cellulaire en sub cellulaire verbouwing evenementen en samentrekkende eigenschappen van het hart te bestuderen tijdens de overgang van hypertrofie tot hartfalen 4.
Een groot voordeel van dit model is het geleidelijk begin van drukoverbelasting op het hart 5 </ Sup> 6. Dit model is klinisch relevant vanwege de langzame maar gestage progressie van cardiale hypertrofie gecompenseerd gedecompenseerde fase en uiteindelijk hartfalen fase. De duur voor progressie van cardiale hypertrofie en hartfalen de bijbehorende fysiologische veranderingen worden hoofdzakelijk beïnvloed door de mate van vernauwing geproduceerd 7. Stijgend aorta vernauwing kan op twee manieren, hetzij door hechtingen of door toepassing van metalen klemmen 8, 9. Het belangrijkste voordeel van een metalen clip voor aorta vernauwing is dat de chirurgische procedures minder ingewikkeld. Bij deze methode moet men de supra valvulaire aorta ascendens lokaliseren en plaats de clip rond de aorta om de gewenste mate van vernauwing verkrijgen. Een kist oprolmechanisme is niet nodig in deze procedure. Aorta banding door hechten vereist meer chirurgische handelingen voor het plaatsen van de naald naast het stijgende aorta en hechten er omheen tehet gewenste niveau van de aorta vernauwing. Deze techniek is meer tijd in vergelijking met het gebruik van metalen clips voor aorta vernauwing. De methode beschreven in deze video toont de chirurgische procedure voor oplopende aorta vernauwing in ratten die creatie van druk overbelasting van de linker ventrikel hypertrofie model maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven werden uitgevoerd na goedkeuring van de Institutional Animal Ethics Committee. Wistarratten werden gehuisvest onder een 12 uur donker naar licht cyclus, constante kamertemperatuur (24 ± 2 ° C) met voedsel en water ad libitum (volgens de CPCSEA richtlijnen).
1) Pre-operatieve Zorg en Anesthesie
- Houd rat (ongeveer 200 g lichaamsgewicht) onder antibiotische paraplu 24 uur voor de operatie door het toedienen van amoxicilline oraal (dosis: 500 mg / l water).
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten (zoals een schaar, tang, klem applicator, hechtnaalden en naaldhouder) door autoclaveren bij 121 ° C gedurende 15 minuten.
- Gebruik een verwarmingselement om het dier lichaamstemperatuur ongeveer 37 ° C behouden om een snelle verlaging van de hartfrequentie voorkomen.
- Zorg om uitdroging van het dier te voorkomen vóór en tijdens chirurgie.
- Verdoven van de rat in een inductie kamer met 3% isofluraan gemengd met0.5-1.0 L / min 100% zuurstof; anesthesie te onderhouden met 1,5% isofluraan.
- Controleer het pedaal reflex om succesvolle anesthesie bevestigen.
2) Voorbereiding van de chirurgische site
- Houd de rat op een temperatuur gecontroleerde verwarming pad in rugligging.
- Plaats een rubberen band over voortanden van de rat om het dier in positie te houden met behoud van anesthesie met een neuskegel.
- Verwijder bont van de hals en linker borst regio van de rat (bij voorkeur met een elektrisch scheerapparaat).
- Ontsmet chirurgische site met povidonjood-oplossing en daarna met 70% ethylalcohol.
- Gebruik een steriel laken om tijdens de operatieve procedure alleen de operatiewond bloot.
Opmerking: Als extra optie voor de verzorging van dieren, kunnen 0,25% bupivicaine ID (2,5 mg / kg) voorafgaand aan het insnijden van elke incisie die lokale anesthesie / analgesie worden opgenomen.
3) tracheale intubatie in Rat
- Voeg een kleine insnijding op de huid parallel aan de luchtpijp met een steriel chirurgisch mes en zorgvuldig scheiden het onderliggende weefsel om de luchtpijp bloot.
- Breng een gelijkspel van 4-0 zijden hechtdraad onder de luchtpijp en voorzichtig de band te verhogen naar boven.
- Maak een halverwege incisie tussen twee kraakbeen ringen en steek de tracheale canule in de luchtpijp van de rat.
- Sluit de tracheale canule een knaagdier ventilator voor het handhaven van een ademhalingsfrequentie van 50 ademhalingen / min, ademvolume van 1,70 ml en inspiratie moment van 0,60 sec (voor rat met 200 g lichaamsgewicht).
4) Vernauwing van de aorta ascendens
- Na het detecteren van de positie van de ribben met vingers, maakt een incisie van ongeveer 2 cm aan de linker borstwand tussen de tweede en derde rib.
- Scheid de intercostale spieren laag voor laag en een insnijding ongeveer 1,5 cm tussen de tweede en derde rib. (Care moeten nemenn om verwondingen te voorkomen aan de longen, terwijl het maken incisie tussen de ribben)
- Trek de ribben en zoek de opgaande deel van de aorta.
- Plaats een klein formaat titanium klem rond de aorta ascendens met behulp van een applicator, waarbij vernauwen de aorta tot 50-60% van de oorspronkelijke diameter.
- Na de aorta vernauwing, benaderen de tweede en derde ribs met 3,0 prolene in een onderbroken hechtdraad patroon. Tegelijkertijd pauze de ventilator voor ongeveer 2-4 seconden om opnieuw opblazen van de longen.
- Appose de spier lagen met 3,0 prolene hechtingen en de huid met 4,0 zijden hechtingen in een onderbroken hechtdraad patroon. Synthetische niet absorbeerbare hechtingen plaats zijde worden gebruikt voor het hechten van de huid.
- Verwijder tracheacanule uit de rat eenmaal spontane ademhaling is hersteld.
- Sluit de tracheale opening met 3,0 prolene hechtingen en de huid laag met 4,0 zijden hechtingen.
- Laat het dier te laten bekomen op tHij verwarming pad door het geleidelijk verlagen van de anesthesie en beademing beademing.
- In dezelfde leeftijd sham controle dieren, tracheotomie en thoracotomie uitvoeren zonder vernauwing van de aorta ascendens.
5) Post-operatieve Zorg
- Ontsmet operatiegebied met povidonjood oplossing.
- Als postoperatieve analgesie, injecteren tramadol intra-peritoneaal (10 mg / kg lichaamsgewicht / dag) gedurende 1 week.
- Injecteren steriele fysiologische zoutoplossing intraperitoneaal als tekenen van uitdroging optreden na de operatie (ongeveer 1 ml).
- Dien amoxicilline oraal, gemengd met drinkwater, gedurende zeven dagen (dosis: 500 mg / l water).
- Verwijder alle resterende zijden hechtingen van de huid na 10 dagen van de operatie onder inhalatie-anesthesie.
6) Bevestiging van succesvolle Vernauwing van de aorta ascendens
- Voer een trans-thoracale twee dimensionale Doppler-echocardiografie met de intenties bepalensiteit van de overdruk door de vernauwing van stijgende aorta.
- Verdoven de ratten een week na de operatie zoals eerder beschreven (stap 1.5)
- Plaats de ultrasone transducer in de hierboven sternale positie om de drukgradiënt nemen over het versmalde gedeelte van de omhooggaande aorta.
Opmerking: Ratten met een drukgradiënt van ongeveer 60 mm Hg in de aorta vernauwde site ernstige cardiale hypertrofie te ontwikkelen ongeveer 8-10 weken na de operatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze experimenten kunnen we meer dan 80% overleving bereikt. De effectiviteit van aorta vernauwing werd bevestigd met behulp Doppler echocardiografie. Ratten (n = 6) met een drukgradiënt van ongeveer 60 mm Hg in de aorta vernauwde plaats werden gedurende 8 weken opgeofferd te analyseren voor de ontwikkeling van cardiale hypertrofie (Figuur 1). Na 8 weken na de operatie echocardiografische evaluatie toonde een aanzienlijke toename van linker ventriculaire parameters als de ventriculaire septum, linkerventrikel posterieure wanddikte afname van linker ventriculaire interne diameter aan diastolische toestand, dieren die aorta vernauwing ondergaan, vergeleken met schijn-geopereerde controles (Tabel 1, Figuur 2). Een significante toename van hart gewicht / lichaamsgewicht verhoudingen en linker ventrikel gewicht / lichaamsgewicht verhoudingen werden waargenomen bij ratten met aorta vernauwing (Tabel 2, Figuur 3). Deze gegevenssuggereren dat 8 weken na de operatie ratten met aorta vernauwing ontwikkelen van een aanzienlijke mate van hypertrofie van het hart, in vergelijking met placebo bediende.
Figuur 1. Echocardiogram bij ratten die de drukgradiënt over de omhooggaande aorta. Aa) De vertegenwoordiger echocardiogram van een rat met een vernauwing van de aorta en het hebben van een drukgradiënt van 63,0 mm Hg en Ab vertegenwoordigt kleur Doppler echo van de site over de aorta waar drukgradiënt werd gemeten. Ba) De vertegenwoordiger echocardiogram van een schijnvertoning bedieningssysteem rat van een drukgradiënt van 2,86 mm Hg en Bb staat kleur Doppler echo van de locatie in de aorta waar de drukgradiënt was maatregel d. Deze drukverhoging gradiënt geeft succesvol verbinden van de aorta van ratten waarin een gedeeltelijke opgaande aorta vernauwing ondergaan.
. Figuur 2 M-mode echocardiogram van de linker ventrikel bij ratten met aorta vernauwing (A) en controleratten (B) afschilderen linker ventrikel dimensies op het moment van opoffering 8 weken na de operatie IVST = inter ventriculaire septum.; LVPWT = linker ventrikel posterieure wanddikte; LVID = linker ventrikel binnendiameter in diastole. Bij ratten aorta vernauwing een aanzienlijke toename van de inter ventriculaire septum kan linkerventrikel posterieure wanddikte afname van linker ventriculaire interne diameter aan diastolische toestand worden waargenomen.
Figuur 3. Beelden van het hele hart van een rat die aorta vernauwing (A) ondergingen en een schijnvertoning bedieningssysteem rat (B) 8 weken na de operatie. De rat met aorta vernauwing heeft significante cardiale hypertrofie, vergeleken met placebo bedieningssysteem.
Tabel 1 M-mode echocardiografische parameters van cardiale linker ventrikel op het moment van opoffering, 8 weken na de operatie IVST = inter ventriculaire septum..; LVPWT = linker ventrikel posterieure wanddikte; LVID = linker ventrikel inwendige doorsnede van diastolische staat; AAC = oplopend aorta vernauwing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verscheidene chirurgische modellen voor de inductie van drukoverbelasting en cardiale hypertrofie en hartinsufficiëntie. In kleine dieren, Lorell en collega's ontwikkelde het model dat we hier hebben beschreven en rapporteerden zij het optreden van gecompenseerde hypertrofie 8 weken na aorta banding 5. Cardiale veranderingen geleidelijk ontwikkelen tot een gedecompenseerde staat en vervolgens leiden tot hartfalen. Het belangrijkste voordeel van dit model is het geleidelijk begin van de toename van de linker ventriculaire druk en dus soortgelijke klinische situaties chronische hypertensie. Het is ook een geschikt diermodel voor het bestuderen linker hartfalen geassocieerd pulmonale hypertensie 10.
Andere dierlijke modellen voor druk overbelasting hartfalen, zoals Dahl gevoelige ratten, spontaan hypertensieve ratten en ratten met een vernauwing van de abdominale aorta, ook de ontwikkeling van chronische druk overbelasting. Zij echter rekening langere perioden voor progressie from cardiale hypertrofie op hartfalen. De onderhoudskosten van de experimentele ratten is dus ook hoger 1. deAlmeida en collega's werkzaam dwarse aorta vernauwing voor het induceren van linker ventrikel hypertrofie bij muizen 11. De techniek houdt mediane sternotomie en intrekken van borstbeen en dus is een grotere uitdaging.
Zorgen voor een snelle verandering van de anesthesie van neuskegel tot intubatie tracheale voor thoracotomie en van tracheaalintubatie naar neuskegel na de operatieve procedures. Een alternatieve methode voor tracheale intubatie bij ratten is met behulp van polyethyleen buis voor intubatie plaats van tracheotomie. Echter, deze techniek vereist voldoende vaardigheid. Zorg moeten worden genomen om eventuele schade te voorkomen aan de longen, terwijl het maken incisie tussen de ribben. Toepassing van titaan klemmen voldoende kritische aorta vernauwing van linker ventrikel stress, maar niet ernstig genoeg om acute linkerventrikelfalen en p producerenulmonary oedeem. Gebruik van prolene hechtingen voor de aanpassing van de ribben is van cruciaal belang voor een succesvol herstel van het dier. Tijdens de aanpassing van de ribben, pauzeer de ventilator voor ongeveer 2-4 seconden om opnieuw opblazen van de longen.
We hadden slechts 20% operatieve sterfte bij de dieren en er waren geen postoperatieve complicaties. De techniek die we hier beschreven is dus een efficiënt en geschikt hulpmiddel om chronische pathofysiologische veranderingen in cardiale hypertrofie en progressieve hartinsufficiëntie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen afdeling Biotechnologie, de regering van India voor de financiële ondersteuning van dit project. Ajith Kumar GS werd ondersteund met senior research fellowship van de Raad voor Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek, regering van India en Binil Raj met senior research fellowship van de Indiase Raad voor Medisch Onderzoek, de regering van India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
