Summary
Nous décrivons un procédé par étapes pour la création d'une surcharge de pression et de l'hypertrophie ventriculaire gauche chez des rats Wistar par constriction de l'aorte ascendante en utilisant une petite pince métallique. Ce modèle est largement utilisé pour étudier les changements de remodelage pendant l'hypertrophie cardiaque et pour identifier et évaluer les stratégies pour la régression de ces changements.
Abstract
Croissant rétrécissement aortique est le modèle chirurgicale la plus courante et efficace pour créer une surcharge de pression induite par l'hypertrophie cardiaque et l'insuffisance cardiaque. Ici, nous décrivons un procédé chirurgical détaillée pour créer une surcharge de pression et de l'hypertrophie cardiaque chez les rats par constriction de l'aorte ascendante en utilisant une petite pince métallique. Après l'anesthésie, la trachée est intubée par l'insertion d'une canule à travers une incision à mi-chemin entre deux anneaux faits de cartilage de la trachée. Puis une incision de la peau est effectuée au niveau du deuxième espace intercostal sur la paroi de la poitrine gauche et les couches musculaires sont effacées pour localiser la partie ascendante de l'aorte. L'aorte ascendante est resserré à 50-60% de son diamètre initial par l'application d'un petit clip de titane de taille. Suite à une constriction aortique, les deuxième et troisième nervures sont estimés à l'aide de sutures de prolène. La canule trachéale est retiré une fois que la respiration spontanée a été rétablie. L'animal est autorisé à récupérer on le coussin chauffant en abaissant progressivement l'anesthésie. L'intensité de la surcharge de pression créée par constriction de l'aorte ascendante est déterminé par l'enregistrement du gradient de pression en utilisant transthoracique bidimensionnelle Doppler échocardiographie. Globalement, ce protocole est utile d'étudier les événements de remodelage et les propriétés contractiles du coeur au cours de l'installation progressive et de la progression de l'hypertrophie cardiaque compensée à l'étape de l'insuffisance cardiaque.
Introduction
Petits modèles animaux sont les outils les plus privilégiées pour l'étude des changements chroniques dans le développement de l'hypertrophie cardiaque et sa progression vers l'insuffisance cardiaque. modèles d'insuffisance cardiaque par des méthodes chirurgicales ont été initialement développées chez le rat que ces animaux sont les plus appropriés pour les interventions chirurgicales thoraciques ouverte, l'échocardiographie et l'évaluation des paramètres hémodynamiques. Ils fournissent également des échantillons adéquats post mortem des tissus, cellulaire et des études au niveau moléculaire 1. Rétrécissement de l'aorte ascendante est l'un des modèles chirurgicales les plus courantes et efficaces pour la création d'insuffisance cardiaque de surcharge de pression 2, 3. Ce modèle est bien adapté pour étudier les événements de remodelage cellulaire cellulaires et sous et les propriétés contractiles du coeur pendant la transition de l'hypertrophie de l'insuffisance cardiaque 4.
Un avantage important de ce modèle est l'apparition progressive d'une surcharge de pression sur le coeur 5, </ Sup> 6. Ce modèle est cliniquement pertinente en raison de sa progression lente mais constante de l'hypertrophie cardiaque compensée à la phase décompensée et enfin au stade de l'insuffisance cardiaque. La durée de la progression de l'hypertrophie cardiaque de l'insuffisance cardiaque et les changements physiologiques associés sont principalement influencés par le degré de sténose produit 7. Croissant constriction aortique peut être réalisé de deux manières, soit en utilisant des sutures ou par application d'agrafes métalliques 8, 9. Le principal avantage de l'utilisation d'un clip métallique pour une constriction aortique est que les procédures chirurgicales sont moins compliqués. Dans cette méthode, il faut localiser le supra valvulaire de l'aorte ascendante et insérer le clip autour de l'aorte pour obtenir un niveau désiré de constriction. Enrouleur de poitrine n'est pas nécessaire dans ce mode opératoire. Cerclage aortique par suture nécessite plusieurs manipulations chirurgicales pour placer l'aiguille de l'indicateur à côté de l'aorte ascendante et de la suture autour d'elle pourproduire le niveau de constriction aortique souhaitée. Cette dernière technique est plus longue en comparaison avec l'utilisation de clips métalliques pour une constriction aortique. La méthode décrite dans cette vidéo montre la procédure chirurgicale pour ascendant constriction aortique chez les rats qui permet la création d'une pression modèle de l'hypertrophie ventriculaire gauche surchargé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les expérimentations animales ont été effectuées après l'obtention de l'approbation du Comité d'éthique animale institutionnel. Des rats Wistar ont été logés dans une obscurité de 12 h à cycle de lumière, température ambiante constante (24 ± 2 ° C) avec de la nourriture et de l'eau ad libitum (selon les lignes directrices de CPCSEA).
1) Soins pré-opératoire et anesthésie
- Gardez rat (environ 200 g de poids corporel) sous antibiotique parapluie 24 heures avant une intervention chirurgicale par l'administration d'amoxicilline par voie orale (dose: 500 mg / L d'eau).
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux (tels que ciseaux, pinces, d'agrafes, aiguilles de suture, et porte-aiguille) par autoclavage à 121 ° C pendant 15 min.
- Utiliser un coussin chauffant pour maintenir la température du corps de l'animal autour de 37 ° C pour éviter une rapide diminution de la fréquence cardiaque.
- Prenez soin d'éviter la déshydratation de l'animal avant et pendant la chirurgie.
- Anesthésier le rat dans une chambre d'induction avec 3% d'isoflurane mélangé avec0,5-1,0 L / min de 100% d'oxygène; maintenir l'anesthésie avec 1,5% d'isoflurane.
- Vérifiez le réflexe de pédale pour confirmer l'anesthésie réussie.
2) Préparation du site opératoire
- Maintenir le rat sur le dessus d'un coussin chauffant à température contrôlée dans la position couchée sur le dos.
- Positionner une bande de caoutchouc sur les dents de devant du rat afin de maintenir l'animal en position, tout en maintenant une anesthésie avec un cône de nez.
- Enlever la fourrure de l'encolure et à gauche la région thoracique du rat (de préférence en utilisant un rasoir électrique).
- Désinfecter site chirurgical avec une solution de povidone-iode et ensuite avec de l'alcool éthylique à 70%.
- Utilisez un champ stérile pour exposer que le site chirurgical lors de l'intervention.
Remarque: Comme une option supplémentaire pour le soin des animaux, 0,25% bupivicaïne ID (2,5 mg / kg) peut être incorporé avant l'incision à chaque site de l'incision à l'anesthésie locale / analgésie.
3) Intubation trachéale chez le rat
- Faire une petite incision sur la peau parallèlement à la trachée en utilisant une lame chirurgicale stérile et on sépare soigneusement le tissu sous-jacent afin d'exposer la trachée.
- Appliquer une cravate de soie 4-0 fil de suture sous la trachée et soulevez doucement le lien vers le haut.
- Faire une incision en demi-chemin entre deux anneaux de cartilage et insérer la canule trachéale dans la trachée du rat.
- Connectez la canule trachéale à un ventilateur de rongeur pour maintenir une fréquence respiratoire de 50 respirations / min, le volume de marée de 1,70 ml et temps de l'inspiration de 0,60 s (rat avec 200 g de poids corporel).
4) La constriction de l'aorte ascendante
- Après détection de la position des nervures avec les doigts, faire une incision de la peau d'environ 2 cm sur la paroi gauche de la poitrine entre les deuxième et troisième nervures.
- Séparer la couche de muscles intercostaux par couche et faire une incision d'environ 1,5 cm de long entre les deuxième et troisième côtes. (Il faut être prendren d'éviter toute blessure aux poumons tout en faisant une incision entre les côtes)
- Rentrez les côtes et de localiser la partie ascendante de l'aorte.
- Placer une petite pince de titane de taille autour de l'aorte ascendante avec l'aide d'un applicateur par lequel la constriction de l'aorte 50 à 60% du diamètre d'origine.
- Suite à la constriction aortique, rapprochant les deuxième et troisième nervures avec 3,0 prolène dans un motif de fil de suture interrompue. En même temps, mettre en pause le ventilateur pendant environ 2-4 secondes pour regonfler les poumons.
- Apposer les couches musculaires avec 3,0 sutures prolène et la peau avec 4,0 points de suture de soie dans un modèle de suture interrompue. Sutures absorbables synthétiques non peuvent être utilisés à la place de la soie pour suturer la peau.
- Retirer canule trachéale chez le rat de la respiration spontanée, une fois est rétablie.
- Fermez l'ouverture de la trachée avec 3,0 sutures prolène et la couche de peau avec 4,0 points de suture de soie.
- Laisser l'animal à récupérer sur til coussin chauffant en abaissant progressivement l'anesthésie et respirateur respiration assistée.
- Chez les animaux témoins simulacre appariés pour l'âge, effectuer une trachéotomie et une thoracotomie sans constriction de l'aorte ascendante.
5) Soins post-opératoires
- Désinfecter zone chirurgicale avec une solution de povidone-iode.
- Comme l'analgésie post-opératoire, injecter tramadol intra-péritonéale (10 mg / kg de poids corporel / jour) pendant 1 semaine.
- Injecter une solution saline normale stérile intra-péritonéale si des signes de déshydratation apparaissent après la chirurgie (environ 1 ml).
- Administrer amoxicilline par voie orale, mélangé avec de l'eau potable, pendant sept jours (dose: 500 mg / L d'eau).
- Retirez toutes les sutures de soie restants de la peau après 10 jours de la chirurgie sous anesthésie par inhalation.
6) Confirmation de constriction réussie de l'aorte ascendante
- Effectuez une trans-thoracique en deux dimensions Doppler échocardiographie pour déterminer la intentionsité de la surcharge de pression produite par la constriction de l'aorte ascendante.
- Anesthésier les rats une semaine après la chirurgie, comme décrit précédemment (étape 1.5)
- Placer le transducteur à ultrasons à la position sternale précité pour enregistrer le gradient de pression à travers la partie rétrécie de l'aorte ascendante.
Remarque: Les rats avec un gradient de pression d'environ 60 mm de Hg sur le site rétrécie aortique vont développer une hypertrophie cardiaque sévère par environ 8-10 semaines après la chirurgie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dans nos expériences, nous sommes en mesure d'atteindre plus de 80% des taux de survie. L'efficacité de constriction aortique a été confirmée par une échocardiographie Doppler. Les rats (n = 6) avec un gradient de pression d'environ 60 mm de Hg à l'endroit étranglé aortique ont été observés pendant 8 semaines et sacrifiés à analyser pour le développement de l'hypertrophie cardiaque (figure 1). Après 8 semaines évaluation échocardiographique post-chirurgicale a révélé une augmentation significative des paramètres du ventricule gauche, comme l'épaisseur du septum ventriculaire inter, l'épaisseur de la paroi ventriculaire gauche postérieure et diminution du diamètre interne du ventricule gauche à l'état diastolique, chez les animaux qui ont subi une constriction de l'aorte, par rapport à opéré fictivement contrôles (tableau 1, figure 2). Une augmentation significative des ratios de poids poids / corps cardiaques et rapports de poids poids / corps ventriculaire gauche a été observée chez le rat avec rétrécissement aortique (tableau 2, figure 3). Ces donnéessuggèrent que les rats 8 semaines post-chirurgie avec rétrécissement aortique développer un niveau significatif de l'hypertrophie cardiaque, par rapport à sham contrôles opérés.
Figure 1. Échocardiogramme chez les rats représentant le gradient de pression à travers l'aorte ascendante. Aa) Le échocardiogramme représentant d'un rat avec constriction de l'aorte et ayant un gradient de pression de 63,0 mm de Hg et Ab représente Doppler couleur écho du site dans l'aorte où le gradient de pression a été mesurée. Ba) L'échocardiogramme représentant d'un simulacre exploité contrôle rat présentant un gradient de pression de 2,86 mm de Hg et Bb représente écho Doppler couleur du site à travers l'aorte, où le gradient de pression a été mesurée d. Cette augmentation du gradient de pression indique bandes succès de l'aorte chez les rats qui ont subi partielle rétrécissement croissant de l'aorte.
. Figure 2 en mode M échocardiographie du ventricule gauche chez les rats avec rétrécissement aortique (A) et le contrôle des rats (B) représentant les dimensions du ventricule gauche au moment du sacrifice huit semaines post-chirurgie IVST = entre l'épaisseur du septum ventriculaire.; LVPWT = épaisseur gauche postérieure du ventricule de mur; Lvid = diamètre interne du ventricule gauche en diastole. Chez les rats avec constriction aortique d'une augmentation importante de l'épaisseur du septum inter ventriculaire, ventriculaire gauche épaisseur de la paroi postérieure et la diminution du diamètre interne du ventricule gauche à l'état diastolique peuvent être observées.
Figure 3. Images de l'ensemble des coeurs d'un rat ayant subi une constriction aortique (A) et une imposture exploités rat témoin (B) 8 semaines post-chirurgie. L'rat avec rétrécissement aortique a hypertrophie cardiaque significative par rapport à simulacre exploité contrôle.
Tableau 1 M en mode paramètres échocardiographiques de ventricule cardiaque gauche au moment du sacrifice, huit semaines après la chirurgie IVST = entre l'épaisseur du septum ventriculaire..; LVPWT = épaisseur gauche postérieure du ventricule de mur; Lvid = diamètre interne du ventricule gauche à l'état diastolique; AAC = ascendant rétrécissement aortique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il existe plusieurs modèles chirurgicales pour l'induction d'une surcharge de pression, ainsi que l'hypertrophie cardiaque et l'insuffisance cardiaque. Chez les petits animaux, Lorell et ses collègues ont développé le modèle que nous avons décrit ici et ils ont signalé l'apparition de l'hypertrophie cardiaque compensée 8 semaines après de baguage aortique 5. Modifications cardiaques passent progressivement à un état décompensée et aboutissent à l'insuffisance cardiaque. Le principal avantage de ce modèle est l'apparition progressive de l'augmentation de la pression ventriculaire gauche et donc semblable à des situations cliniques dans l'hypertension chronique. Il est également un modèle animal approprié pour l'étude de l'insuffisance cardiaque gauche associée de l'hypertension pulmonaire 10.
Autres modèles animaux pour l'insuffisance cardiaque de surcharge de pression, tels que les rats Dahl sensibles, des rats spontanément hypertendus et des rats avec rétrécissement de l'aorte abdominale, développent également une surcharge de pression chronique. Cependant, ils prennent de longues périodes de progression from hypertrophie cardiaque à l'insuffisance cardiaque. Le coût d'entretien des rats de laboratoire est donc également plus élevé 1. Dealmeida et ses collègues ont utilisé rétrécissement aortique pour induire une hypertrophie ventriculaire gauche chez les souris 11. La technique consiste à sternotomie médiane et la rétraction du sternum et est donc plus difficile.
Assurer un changement rapide de l'anesthésie du cône de nez à l'intubation trachéale avant thoracotomie et de l'intubation trachéale à cône après les interventions chirurgicales. Une autre méthode pour l'intubation endotrachéale chez le rat en utilisant le tube en polyéthylène pour l'intubation endotrachéale à la place de la trachéotomie. Cependant, cette technique nécessite des compétences suffisantes. Des précautions doivent être prises pour éviter toute blessure aux poumons tout en faisant une incision entre les côtes. Application de clips en titane suffisantes pour produire une constriction aortique critique pour le stress du ventricule gauche, mais pas suffisamment grave pour entraîner une défaillance ventriculaire gauche aiguë et pœdème ulmonary. L'utilisation de sutures prolène pour le rapprochement des côtes est essentiel pour la récupération réussie de l'animal. Pendant le rapprochement des côtes, mettre en pause le ventilateur pendant environ 2-4 secondes pour regonfler les poumons.
Nous avions seulement 20% la mortalité opératoire chez les animaux et il y avait pas de complications post-opératoires. La technique que nous avons décrit ici est donc un outil efficace et adapté à l'étude des changements chroniques patho-physiologiques dans l'hypertrophie cardiaque et l'insuffisance cardiaque progressive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent Département de biotechnologie, gouvernement de l'Inde pour le soutien financier de ce projet. Ajith Kumar GS a été pris en charge avec bourse de recherche principal du Conseil de recherche scientifique et industrielle, gouvernement de l'Inde et Binil Raj avec bourse de recherche principal du Conseil indien de la recherche médicale, gouvernement de l'Inde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
