Summary
우리는 작은 금속 클립을 사용하여 상행 대동맥의 수축에 의해 위 스타 쥐의 압력 과부하 및 좌심실 비대를 만들기위한 단계별 절차를 설명합니다. 이 모델은 광범위하게 심장 비대 동안 리모델링 변경을 공부하고 이러한 변화의 회귀를위한 전략을 파악하고 평가하기 위해 사용된다.
Abstract
대동맥 협착을 상승하면 심장 비대 및 심장 마비를 유도 압력 과부하를 만들기위한 가장 일반적이고 성공적인 수술 모델입니다. 여기, 우리는 작은 금속 클립을 사용하여 상행 대동맥의 수축에 의해 쥐의 압력 과부하 및 심장 비대를 만들기위한 자세한 수술 절차를 설명합니다. 마취 후 기관은 기관의 두 연골 고리 사이에 절반 방법의 절개를 통해 정맥을 삽입하여 삽관된다. 이어서 피부 절개는 왼쪽 가슴 벽에 제 늑간의 레벨에서 이루어지고, 근육층은 대동맥의 상승 부분을 찾을 클리어된다. 상행 대동맥은 작은 크기의 티타늄 클립을 적용하여 원래의 직경이 50 ~ 60 %로 수축된다. 대동맥 협착 다음, 두 번째 및 세 번째 리브 prolene의 봉합으로 근사화된다. 기관 캐뉼라를 제거 한 번자가 호흡을 다시 설립되었다. 동물은 O를 복구하도록 허용점차적으로 마취를 낮추는 방법으로 가열 패드를 명. 대동맥의 수축에 의해 생성 된 압력 과부하의 강도는 트랜스 흉부 이차원 도플러 초음파 검사를 사용하여 압력 구배를 기록함으로써 결정된다. 전반적으로이 프로토콜은 심장 마비 단계에 보상 심장 비대의 점진적 발병과 진행하는 동안 리모델링 이벤트와 심장의 수축 특성을 연구하는 데 유용합니다.
Introduction
작은 동물 모델은 심장 비대 및 심장 마비로의 진행의 개발에 만성 변화의 연구에 대한 가장 선호하는 도구입니다. 이 동물이 열려 가슴 수술, 중환자 실의 심 초음파 검사 및 평가에 최적으로 수술 방법에 의한 심장 마비 모델은 원래 쥐에서 개발되었다. 또한 세포 조직 및 분자 수준의 연구 1 적절한 사후 샘플을 제공합니다. 대동맥의 수축 압력 과부하 심부전 2, 3을 생성하기위한 가장 일반적인 성공적인 수술 모델 중의 하나이다. 이 모델은 잘 비대에서 심장 마비 4로 전환하는 동안 세포 및 서브 셀룰러 리모델링 이벤트와 심장의 수축 특성을 연구하기에 적합합니다.
이 모델의 주요 이점은, 심장 05 압력 과부하 점진적 발병 </> 6 한모금. 이 모델은 보상 때문에 심장 비대에서 대상성 상에 마지막으로 심장 마비 단계로의 느리지 만 꾸준한 진행의 임상 적으로 관련이 있습니다. 심장 마비와 관련된 생리적 변화에 심장 비대의 진행에 대한 지속 시간은 주로 7을 생산 협착의 정도에 의해 영향을 받는다. 상행 대동맥 협착이 봉합사를 사용하거나 금속 클립 (8, 9)의인가에 의해 하나, 두 가지 방법으로 수행 될 수있다. 대동맥 수축을위한 금속 클립을 사용하는 주요 장점은 수술 절차가 덜 복잡하고 있다는 점이다. 이 방법에서는 하나는 위에 판막 상행 대동맥을 찾아 수축의 원하는 수준을 얻기 위해 대동맥 주위에 클립을 삽입 할 수 있습니다. 가슴 트랙터는이 절차에서 필요하지 않습니다. 봉합에 의한 대동맥 밴딩은 상행 대동맥 옆에 게이지 바늘을 배치하고 그 주위 봉합에 대한 더 많은 수술 조작을 필요로대동맥 협착의 원하는 수준을 생산하고 있습니다. 후자의 기술은 대동맥 수축을위한 금속 클립의 사용과 비교할 때 더 많은 시간이 소요되는 것이다. 이 비디오에서 설명하는 방법은 창조의 압력 과부하 좌심실 비대 모델을 할 수 있습니다 쥐의 대동맥 수축 상승에 대한 수술을 보여줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 실험 기관 동물 윤리위원회의 승인을 얻은 후 시행 하였다. 위 스타 쥐 라이트 사이클 (CPCSEA 지침에 따라) 음식과 물을 임의로와 일정한 실내 온도 (24 ± 2 ° C)에 12 시간의 어두운에서 보관 하였다.
1) 수술 전 관리 및 마취
- (: 물 500 ㎎ / L 용량) 경구 아목시실린을 투여하여 수술 전 항생제 우산 24 시간에서 쥐 (약 200 g 체중)을 유지합니다.
- 15 분 동안 121 ° C에서 고압 증기 멸균에 의해 (가위, 집게, 클립 도포, 봉합 바늘, 바늘 홀더 등) 모든 수술 도구를 소독.
- 심박수의 급격한 감소를 방지하기 위해 37 ° C의 주위 동물의 체온을 유지하기 위해 가열 패드를 사용한다.
- 수술 전과 동안 동물의 탈수를 방지하기 위해주의하십시오.
- 혼합 3 % 이소 플루 란으로 유도 챔버에서 래트를 마취0.5 ~ 1.0 L / 분 100 % 산소; 1.5 % 이소 플루 란으로 마취를 유지한다.
- 성공적인 마취를 확인하기 위해 페달 반사를 확인합니다.
수술 부위의 2) 준비
- 앙와위에서의 온도 제어 난방 패드의 상단에있는 쥐를 유지합니다.
- 코 콘 마취를 유지하면서 위치에 동물을 유지하기 위해 쥐의 앞니에 고무 밴드를 배치합니다.
- 목 둘레에서 모피를 제거하고 (바람직하게는 전기 면도기를 사용) 쥐의 가슴 영역을 떠났다.
- 다음 포비돈 - 요오드 용액과 70 % 에틸 알코올로 수술 부위를 소독.
- 수술 절차 중에 만 수술 부위를 노출하는 멸균 드레이프를 사용합니다.
주 : 동물 보호를위한 추가 옵션으로 0.25 % Bupivicaine ID (2.5 ㎎ / ㎏)의 사전 국소 마취 / 무통 각 절개 사이트에서 절개에 통합 될 수있다.
쥐 3) 기관 흡인 삽관
- 무균 수술 블레이드를 사용하여 기관에 피부 병렬에 작은 절개를 조심스럽게기도를 노출하기 위해 기본이되는 조직을 분리합니다.
- 기관 아래 4-0 실크 봉합사 스레드의 넥타이를 적용하고 부드럽게 위쪽으로 넥타이를 올립니다.
- 두 연골 고리 사이에 절반 방법의 절개를하고 쥐의 기관으로 기관 캐뉼라를 삽입합니다.
- / 분, 1.70 ML의 호흡량과 (200g의 체중을 가진 쥐의 경우) 0.60 초 영감 시간 50 호흡의 호흡을 유지하기위한 설치류 인공 호흡기에 기관의 캐 뉼러를 연결합니다.
오름차순 대동맥 4) 수축
- 손가락 리브의 위치를 감지 한 후, 두 번째 및 세 번째 늑골 사이 왼쪽 가슴 벽에 약 2 ㎝의 피부 절개를 만든다.
- 계층 늑간근 층을 분리하고 두 번째 및 세 번째 늑골 간 약 1.5 cm 긴 절개. (케어는 가지고 있어야한다갈비뼈 사이의 절개를하는 동안 폐에 부상을 방지하기 위해 N)
- 갈비뼈를 철회하고 대동맥의 상승 부분을 찾습니다.
- 원래 직경의 50 ~ 60 %에 대동맥을 죄기있다 주걱의 도움으로 상행 대동맥 주위에 작은 크기의 티타늄 클립을 놓습니다.
- 대동맥 협착 다음, 중단 봉합 패턴에서 3.0 prolene을 가진 두 번째 및 세 번째 갈비뼈를 근사화. 동시에, 폐를 다시 팽창하기 위해 약 2-4 초 동안 인공 호흡기를 일시 중지합니다.
- 3.0 prolene의 봉합 및 중단 봉합 패턴 4.0 실크 봉합사로 피부와 근육 층을 나란히 놓는다. 합성 비 흡수성 봉합사는 피부를 봉합 대신 실크 사용할 수 있습니다.
- 한 번자가 호흡이 다시 설립 쥐에서 기관 캐뉼라를 제거합니다.
- 3.0 prolene의 봉합 및 4.0 실크 봉합사로 피부 층을 가진 기관의 개방을 닫습니다.
- 동물이 t에 복구 할 수그는 점차 마취 및 인공 호흡기의 도움 호흡을 낮추는 방법으로 패드를 가열.
- 나이 일치 가짜 대조군에서 상행 대동맥의 수축없이 절개술 및 개흉술을 수행합니다.
5) 수술 후 관리
- 포비돈 - 요오드 용액으로 수술 영역을 소독.
- 수술 후 진통제로, 1 주 동안 (10 ㎎ / ㎏ 체중 / 일) 트라마돌의 복강 내 주입.
- 탈수의 징후가 수술 (약 1 ㎖) 후 나타날 경우 멸균 생리 식염수를 복강 내 주입한다.
- 칠일 (: 물 500 ㎎ / L 용량)의 경우, 혼합 된 식수, 경구 아목시실린을 관리 할 수 있습니다.
- 흡입 마취하에 수술 10 일 후 피부에 남아있는 실크 봉합사를 제거합니다.
오름차순 대동맥의 성공적인 수축의 6) 확인
- INTEN을 결정하는 트랜스 흉부 두 차원 도플러 심 초음파 검사를 수행상행 대동맥의 수축에 의해 생성 된 압력 과부하 SITY.
- 앞에서 설명한대로 쥐 1 주일 후 수술을 마취 (단계 1.5)
- 상행 대동맥의 수축 부분에 걸쳐 압력 구배를 기록 위에 흉골 위치에 초음파 변환기를 놓습니다.
주 : 대동맥 수축 사이트에서 수은의 약 60 mm의 압력 구배와 쥐에 대한 8~10주 수술을 우편으로 심각한 심장 비대를 개발합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리의 실험에서 우리는 80 % 이상 생존율을 달성 할 수 있습니다. 대동맥 수축의 효과는 도플러 심 초음파 검사를 수행하여 확인 하였다. 쥐 (N = 6) 대동맥 수축 사이트에서 수은의 약 60 mm의 압력 구배와 8 주 동안 관찰과 심장 비대의 개발 (그림 1)에 대한 분석을 희생했다. 팔주 후 수술 후 심 초음파 평가는 가짜 운영에 비해, 같은 대동맥 협착을받은 동물의 간 심실 중격 두께, 좌심실 후벽 두께와 이완기 상태에서 좌심실 내경 감소로 좌심실 매개 변수의 상당한 증가를 보여 컨트롤 (표 1, 그림 2). 심장 중량 / 체중 비율 좌심실 중량 / 체중 비율에서 상당한 증가는 대동맥 협착 (표 2,도 3)으로 래트에서 관찰되었다. 이러한 데이터가짜에 비해 대동맥 협착과 팔주 수술 후 쥐가 심장 비대의 상당한 수준을 개발하는 것이 좋습니다 컨트롤을 운영하고 있습니다.
상행 대동맥에서 압력 구배를 나타내는 쥐 그림 1. 심 초음파. AA) 대동맥의 수축 및 수은과 AB의 63.0 mm의 압력 구배를 갖는 쥐에서 대표 심 초음파 컨트롤을 작동 압력 구배가 가짜에서 대표 심 초음파. 바)를 측정 한 대동맥에 걸쳐 사이트의 색 도플러 에코를 나타냅니다 수은 및 비비의 2.86 mm의 압력 구배를 갖는 쥐 압력 구배가 측정되었다 대동맥 걸쳐 사이트의 컬러 도플러 에코를 의미 D. 압력 구배의 증가는 부분적으로 상승하는 대동맥 수축을받은 쥐의 대동맥을 성공적으로 밴딩을 나타냅니다.
.. 대동맥 협착 (A) 및 제어 희생의 타임 : 주 수술 후 IVST는 = 간 심실 중격 두께로 좌심실의 크기를 묘사하는 쥐 (B)와 쥐의 좌심실의 그림 2와 M-모드 초음파 검사; LVPWT는 = 좌심실 후벽 두께; 심장 확장에 LVID는 = 좌심실 내경. 대동맥 협착 간 심실 중격 두께의 유의 한 증가와 쥐, 좌심실 후벽 두께와 이완기 상태에서 좌심실 내경 감소가 관찰 될 수있다.
그림 3. 대동맥 수축 (A)를 시행하고 가짜 제어 쥐 (B) 팔주 후 수술을 운영하는 쥐의 전체 마음의 이미지. 대동맥 협착을 가진 쥐 컨트롤을 사기에 운영 비해 상당한 심장 비대가 있습니다.
표 1 M 모드 희생의 시간에 심장 좌심실의 심 초음파 매개 변수를 8 주 동안 수술 후 IVST는 = 간 심실 중격 두께.,. LVPWT는 = 좌심실 후벽 두께; 이완기 상태에서 LVID는 = 좌심실 내경; AAC는 = 대동맥 협착을 상승.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
압력 과부하 유도뿐만 아니라 심장 비대 및 심장 마비에 대한 몇 가지 수술 모델이 있습니다. 작은 동물에서 Lorell와 동료는 우리가 여기에서 기술 한 모델을 개발하고 그들이 보상 심장 비대 팔주 후 대동맥 밴딩 5의 발생을보고했다. 심장의 변화는 점차적으로 대상 부전 상태로 진행 한 후 심장 마비의 원인. 이 모델의 가장 큰 장점은 좌심실 압력의 증가와 만성 고혈압의 임상 적 상황에 따라서 유사의 점진적 발병합니다. 또한 왼쪽 심장 마비 관련된 폐동맥 고혈압 (10) 공부를위한 적절한 동물 모델입니다.
같은 달에 민감한 쥐, 자발적으로 고혈압 쥐의 복부 대동맥의 수축과 쥐 등의 압력 과부하 심장 마비에 대한 다른 동물 모델은 또한 만성 압력 과부하를 개발한다. 그들은, 그러나, 진행 F에 대한 확장 된 기간을심장 마비에 롬 심장 비대. 실험 쥐의 유지비 한 따라서도 높다. deAlmeida와 동료 쥐 11에서 좌심실 비대를 유도 가로 대동맥 수축을 채택했다. 이 기술은 중간 흉골과 흉골의 철회를 포함하고, 따라서 더 많은 도전입니다.
수술 절차 후 코 콘에 개흉술 전에 기관 삽관에서 삽관을 기관에 코 콘에서 마취의 신속한 변화를 확인합니다. 쥐의 기관 삽관을위한 또 다른 방법은 기관 내 삽관 용 폴리에틸렌 관을 사용하는 대신에 기관 절개술입니다. 그러나,이 기술은 적절한 기술이 필요합니다. 케어는 갈비뼈 사이에 절개를하는 동안 폐에 부상을 방지하기 위해주의해야한다. 좌심실 스트레스,하지만 급성 좌심실의 실패와 P를 생성 할만큼 심각하지 중요 대동맥 협착을 생산하기에 충분한 티타늄 클립의 적용ulmonary 부종. 리브의 근사치에 대한 prolene의 봉합의 사용은 동물의 성공적인 복구를 위해 중요합니다. 리브의 근사 동안 폐를 다시 팽창하기 위해 약 2-4 초 동안 인공 호흡기를 일시 중지합니다.
우리는 동물에서 20 % 사망률을했고 어떤 수술 후 합병증은 없었다. 우리는 여기에 설명 된 기술은 따라서 심장 비대와 진보적 인 심장 마비 만성 병리 생리 학적 변화를 연구하기위한 효율적이고 적합한 도구입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는이 프로젝트의 재정 지원을위한 생명 공학 교실, 인도의 정부를 인정합니다. Ajith 쿠마 GS는 과학 및 의학 연구, 인도 정부의 인도위원회에서 선임 연구 활동과 산업 연구, 인도 정부와 Binil 주권의 이사회에서 선임 연구 활동에 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
